1.2.1. Giới thiệu về cà chua
Cà chua đem lại cho con người một nguồn dồi dào các vitamin như vitamin C, vitamin A, vitamin K, vitamin B cùng một số chất khoáng như K, Mg, Cr, Cu, Fe,
protein và chất xơ. Đặc biệt trong cà chua có 4 loại caroten là α-caroten, β-caroten, lutein, lycopen. Phân tử lycopen trong cà chua có tính chống oxy hóa cao, đây là thành phần có lợi cho sức khỏe con người.
Cà chua là loại rau ăn quả thuộc họ cà Solanaceae, có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Cà chua có tên tiếng anh là tomato và tên khoa học là Lycopersincon esculetum [48].
1.2.2. Thành phần hóa học của cà chua
1.2.2.1. Chất khô
Hàm lượng chất khô trong cà chua phụ thuộc vào loại nguyên liệu và điều kiện trồng trọt, chiếm khoảng 4-8%. Trong thành phần chất khô bao gồm:
Đường: 2-5%, phần lớn là glucose, còn saccharose chiếm rất ít ( < 0,5%) Tinh bột: chỉ ở dạng vết khoảng 0,07- 0,26%, trong quá trình chín, tinh bột sẽ chuyển thành đường.
Cenlulose: có nhiều trong quả xanh, càng chín, hàm lượng càng giảm dần.
1.2.2.2. Độ acid
Độ acid chung của cà chua khoảng 0,4% (theo acid malic). Độ acid hoạt động trong khoảng pH =3,1-4,1. Ngoài ra còn có acid citric và lượng nhỏ acid tatric.
Khi còn xanh, acid ở dạng tự do. Khi chín có dạng muối acid.
1.2.2.3. Nitơ
Nitơ trong cà chua khoảng 1%. Lúc còn xanh, nitơ ở dạng tự do, khi chín nó bị phân hủy thành axit amin.
1.2.2.4. Chất khoáng
Chất khoáng trong cà chua chiếm khoảng 0,4%, gồm một số chất khoáng như canxi, photpho, sắt.
1.2.2.5. Glucozit
Cà chua thường có vị hăng là do chứa glucozit solanin. - Cà chua xanh có hàm lượng solanin khoảng 8%. - Cà chua ửng có hàm lượng solanin khoảng 8%. - Cà chua chín có hàm lượng solanin khoảng 8%.
1.2.2.6. Sắc tố
Trong cà chua có nhóm sắc tố thuộc nhóm carotenoid như: carotene, lycopen, xantophyl. Ở quả cà chua xanh còn có chlorophyll. Tùy theo mức độ chín mà sắc tố tăng dần nên màu của quả đậm hơn.
1.2.2.7. Vitamin
Trong cà chua chứa nhiều vitamin, gồm có: - Vitamin C chiếm khoảng 20 – 40 (mg%). - Vitamin B1 chiếm khoảng 0,08 – 0,15 (mg%). - Vitamin B2 chiếm khoảng 0,05 – 0,07 (mg%). - Vitamin PP chiếm khoảng 0,5 – 16,5 (mg%). - Vitamin K chiếm khoảng 50 (mg%).
- Carotin chiếm khoảng 1,2 – 1,6 (mg%).
1.2.3. Vai trò của cà chua
Trong cà chua có sắc tố lycopen cùng với caroten vừa ngăn chặn tế bào ung thư vừa chống sự hình thành các cục máu đông trong thành mạch nên giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch, chống lại các bệnh thoái hóa thần kinh và bệnh liên quan đến tiểu đường loại. Lycopen được xem là chất chống oxy hóa mạnh, có khả năng hóa giải các gốc tự do, ngăn chặn tế bào ung thư vì các gốc tự do có trong cơ thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc hình thành các tế bào ung thư. Các gốc tự do nội sinh và ngoại sinh trong cơ thể sẽ phá hủy các DNA và RNA, tạo nên đột biến gen gây ung thư, đồng thời phá hủy tế bào dẫn đến bệnh tật, tử vong.
Cà chua chứa vitamin C, B1, B6, PP, lycopen, β-caroten, hàm lượng đạm, đường, chất béo có rất ít nên cà chua được xem là một loại thực phẩm nghèo năng lượng dành cho người béo phì. Ngoài ra, cà chua có tính bình, vị chua, hơi ngọt, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, chống khát nước, giúp thông tiểu tiện và tiêu hóa tốt.
Cà chua còn là loại rau ăn quả thường được sử dụng để tạo vị ngon và màu sắc hấp dẫn cho món ăn, thức uống.
1.2.4. Bệnh thối ướt ở cà chua
Cà chua chứa nhiều vi sinh vật có nguồn gốc từ đất, nước, không khí và các môi trường khác có thể chứa một số tác nhân gây bệnh ở thực vật. Các vi sinh vật này sinh trưởng rất nhanh trong các quả cà chua bị trầy xước, dập nát và gây ra bệnh thối ướt. Một số vi sinh vật thường gây bệnh thối ướt ở cà chua như Rhizopus nigricans, Fusarium, Aspergillus niger, Clostridium, Pseudomonas, Erwinia. Cà chua khi bị bệnh thối ướt sẽ mất giá trị dinh dưỡng và mùi vị đặc trưng, giảm chất lượng nhanh chóng .
Bệnh thối ướt do vi khuẩn Erwinia sp. gây hại với các triệu chứng như thối nhũn một phần hoặc cả quả cà chua, có mùi thối, màu sắc biến đổi, vỏ nhăn. Các triệu chứng trên sẽ phát triển nhanh chóng khi nhiệt độ và độ ẩm cao. Đây là loại bệnh phổ biến và gây thiệt nghiêm trọng đối với cà chua trong quá trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập khẩu. Nếu không phát hiện và cách ly kịp thời những quả bị hỏng thì dễ làm lây nhiễm sang các quả nguyên vẹn khác, gây tổn thất cả lô hàng. Vi khuẩn gây bệnh là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Vi khuẩn xâm nhập chủ yếu qua vết thương, vết dập nát.
Bệnh thối ướt có thể phát sinh ngay từ khi cà chua mới thu hoạch và kéo dài trong thời gian bảo quản. Bệnh xuất hiện với tỷ lệ thấp ở tháng 1 đến tháng 3 bởi vì giai đoạn này nhiệt độ thấp không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm gây bệnh. Bệnh thối ướt quả cà chua phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ cao và ẩm độ cao. Trong những tháng mùa hè bệnh thối ướt phát triển mạnh nhất, cao điểm của bệnh vào các tháng 6, 7, 8. Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại và mức độ bệnh giảm dần khi điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi cho vi khuẩn gây thối ướt (tháng 10 - 12).
Trong quá trình bảo quản trong kho, bệnh thối ướt có thể phát sinh nhưng mức độ bị bệnh nặng hay nhẹ phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và chất lượng cà chua giữ vai trò quyết định. Khi bề mặt quả bị ẩm, không khí trong kho lưu thông kém hoặc bề mặt quả bị tổn thương thì vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây hư hỏng.
1.3. Giới thiệu về vi khuẩn Erwinia sp.
1.3.1. Phân loại:
Theo Winslow cà cộng tác viên (1920), loài Erwinia thuộc: Giới (Kingdom) : Bacteria
Ngành (Phylum) : Proteobacteria Lớp (Class) : γ –Proteobacteria Bộ (Order) : Enterobacteriales
Họ (Family) : Enterobacteriaceae
Giống (Genus) : Erwinia
Loài Erwinia là một thành viên của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae được chia thành 2 nhóm: nhóm gây thối mềm (soft rot) hay “carotovora” và nhóm gây bệnh héo hoặc tàn rụi cây trồng “non – soft rot” hay “amylovora” [55].
1.3.2. Đặc điểm
Erwinia là loài vi khuẩn có họ hàng với Enterobacteriaceae, được chia thành hai nhóm: nhóm gây bệnh thối mềm và nhóm gây bệnh héo ở cây trồng (Hà, 2006). Chi Erwinia bao gồm chủ yếu là các loài vi khuẩn gây bệnh thực vật, được gọi tên theo nhà vi khuẩn thực vật học đầu tiên là Erwin Frink Smith. Vi khuẩn gây ra bệnh thối ướt gồm có một số loài, trong đó có 3 loài chính là Ewwinia carotovora spp..carotovora, Ewwinia carotovora spp.. atroseptica, Ewwinia chrysanthemi [24], [48]. Đây là chi vi khuẩn Gram âm có quan hệ gần với Escherichia coli, Shigella,
Salmonella và Yersinia [48].
Vi khuẩn Erwinia sp. phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới lẫn ôn đới [47]. Vi khuẩn được tìm thấy trong đất, nước, trên bề mặt cây [24]. Chúng gây bệnh ở nhiều loại cây khác nhau như khoai tây, bắp cải, hành, tiêu, dưa leo [20], [23], do có khả năng sản xuất ra các enzyme làm phá vỡ các thành tế bào thực vật. Thành tế bào bị hư cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn. Một số emzyme được vi khuẩn Erwinia
Vi khuẩn thường xâm nhập vào thực vật thông qua lỗ tự nhiên như khí khổng, lỗ vỏ, thân, rễ hoặc qua các vết thương do xây xước, côn trùng [20]. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Erwinia spp. phụ thuộc 3 yếu tố: độc lực, số lượng vi khuẩn và đường xâm nhập. Độc lực của vi khuẩn là năng lực gây bệnh của vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn ban đầu phải đủ lớn thì mới có khả năng gây bệnh. Cuối cùng, vi khuẩn phải xâm nhập đúng con đường và đường xâm nhập phải thích hợp như vết thương, chỗ dập nát trên quả.
Vi khuẩn Erwinia sp. hình gậy (1-2 micromet) đứng thành cặp hoặc chuỗi ngắn, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8 lông roi bao quanh mình, di động, kỵ khí không bắt buộc, không sinh bào tử, sinh trưởng tối ưu ở 30oC. Nuôi cấy trên môi trường pepton saccarose, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc ướt. Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm, háo khí, dịch hoá gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột, không tạo NH3. Trên môi trường có TZC khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia sp. có màu đỏ ở giữa, rìa ngoài màu trắng. Vi khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng từ 20oC –38oC [15], nhiệt độ thích hợp nhất là 27oC –32oC, nhiệt độ tới hạn chết là 50oC; phạm vi pH cũng khá rộng từ pH = 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH = 7,2. Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh nắng.
Vi khuẩn Erwinia sp. bắt đầu gây bệnh thối ướt thì sẽ làm pH tăng nhẹ, tạo điều kiện thuận cho một số vi khuẩn gây bệnh thực phẩm hoạt động như Salmonela,
Shigella [28]. Vì vậy, để đảm bảo an toàn thực phẩm thì cần loại bỏ những quả đã hư, mềm nhũn, chảy dịch nhằm tránh lây lan bệnh thối ướt và ngăn chặn khả năng mắc bệnh từ thực phẩm.
1.3.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn Erwinia sp.
Trên thế giới: có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia sp. và bệnh thối ướt trên các loài thực vật khác nhau.
Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan đã phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan.
Fiori và Schiaffino (2003) nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia.
Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc gia ở Venezuela đã nghiên cứu bệnh thối quả của xoài do Erwinia carotovora và Erwinia herbicola vào năm 1986.
Alpheus đã phát hiện vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối ướt trên khoai tây. Amodu (2006) nghiên cứu về bệnh thối củ gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp. [14]. Jennifer (2005) nghiên cứu về sự có mặt của Salmonella và Shigella trên cà chua bị bệnh thối ướt gây ra bởi vi khuẩn Erwinia carotovora [28].
Perobelon (2002) đã nghiên cứu về bệnh ở khoai tây gây ra bởi vi khuẩn
Erwinia sp. [44].
Tại Việt Nam: Nguyễn Thị Thanh Hà (2006) phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cympidium) bằng phương pháp PCR [3].
1.3.4. Ứng dụng của chitosan trong bảo quản cà chua
Yêu cầu cơ bản nhất trong bảo quản rau quả là tránh được tổn thất về khối lượng và giữ được trạng thái tươi cho rau quả, ngoài ra biện pháp bảo quản phải đơn giản và chi phí đầu tư thấp. Vì thế bảo quản bằng màng bao mang lại nhiều hiệu quả trên. Cà chua là một loại quả được trồng phổ biến, có giá trị dinh dưỡng nhưng là một loại quả có tuổi thọ kém, hô hấp đột biến. Chitosan là một polyme động vật được thu từ phế thải của ngành thuỷ sản, mang nhiều đặc tính phù hợp để bảo quản rau quả. Nghiên cứu này đã dụng chitosan làm màng bao để bảo quản cà chua.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng bao chitosan có nồng độ 2% là thích hợp nhất cho việc bảo quản cà chua ở cả điều kiện thường cũng như điều kiện nhiệt độ lạnh. Ở nồng độ này màng chitosan có khả năng hạn chế hô hấp của quả tốt nhất, lượng CO2 thoát ra ít nhất và quả sau khi bảo quản có trạng thái cảm quan tốt nhất. Độ chín cà chua thích hợp nhất để bảo quản là độ chín vàng (Breaker), số lần nhúng cà chua vào dung dịch chitosan để tạo màng tốt nhất là hai lần [57].
Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh cơ sở phía Bắc chi nhánh Thái Bình đã nghiên cứu đề tài: "nghiên cứu sử dụng màng Chitosan bảo quản quả cà chua tại vùng nông thôn Thái Bình"
Đề tài được xây dựng dựa trên quá trình nghiên cứu lấy mẫu cà chua tại xã Vũ Chính - Tp. Thái Bình. Từ kết quả nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã đề xuất được quy trình bảo quản cà chua ở nhiệt độ thường bằng màng chitosan có bổ sung phụ liệu có tính khả thi cao, phù hợp với điều kiện sản xuất quy mô vùng nông thôn, việc sử dụng màng chitosan đã mang lại nhiều ưu điểm như thời gian bảo quản kéo dài từ 28-35 ngày mà vẫn đạt chất lượng của quả. Bên cạnh đó, các nguồn phụ phẩm như vỏ tôm, ghẹ...là các loại phụ phẩm sẵn có đã được tận dụng mang lại hiệu quả kinh tế [58].
1.3.5. Một số nghiên cứu của chitosan đối với vi khuẩn Erwinia sp.
( Bautista-Banos, 2006) cho thấy sử dụng chitosan kháng vi khuẩn Erwinia sp.
hại rau quả [16].
(Jia Liu, 2007) nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan trên kiểm soát các bệnh sau thu hoạch và tiềm năng của các polymer sinh học chitosan có phân tử lượng khác nhau để kiểm soát nấm mốc màu xám sau thu hoạch quả cà chua [29].
(Mohamed E.I. Badawy, 2009) đã nghiên cứu chỉ ra chitosans hóa học thay đổi như các tác nhân kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn gây bệnh thực vật và nấm trên cà chua [40]
(Rabea E.I., Steurbaut W. 2010) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn, nấm của chitosan tác dụng trên Rot blackmold và yếu tố gây bệnh được sản xuất bởi Alternaria alternata trong nghệ sau thu hoạch cà chua [46].
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chitosan 2.1.1. Chitosan
Chitosan được sản xuất từ xương mực tại Đại Học Nha Trang có màu trắng đục.
Hình 2.1. Chitosan dạng hạt
2.1.2 Vi khuẩn Erwinia sp.
Vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh trên cà chua sau thu hoạch thu nhận từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Nha Trang.
Erwinia sp. là vi khuẩn gram âm, thuộc họ Enterobacteriacea.
Vi khuẩn Erwinia sp. Có khuẩn lạc màu trắng đuc, bờ tròn đều, tế bào có hình que, đầu tròn, có 2 -8 lông roi, các tế bào dính chùm từ 2 – 3 tế bào.
Hình 2.2. Vi khuẩn Erwinia sp.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy PGA
- Khoai tây : 200 gam - Glucose : 20 gam - Agar : 20 gam - Nước cất : 1000ml
2.1.4. Acid Acetic
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Thuyết minh:
Dung dịch chitosan được chuẩn bị từ các chitosan có độ deacetyl (DD) khác nhau, cân 0,075g; 0,1g; 0,125g; 0.15g cho vào 4 bình tam giác 150ml. Đong 25ml CH3COOH 1% cho vào mỗi bình tam giác, lắc đều đến khi tan hết. Chitosan thu được ở dạng dung dịch có nồng độ lần lượt là 0,3%; 0,4%; 0,5%; 0,6%.
Vi khuẩn Erwinia sp. được chuẩn bị ở dạng dung dịch bằng cách: Cấy chủng vi khuẩn vào môi trường TSB đã được khử trùng. Ủ ở 37ºC trong 24h để chủng vi khuẩn hoạt hóa và tăng sinh.
Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PGA, thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chitosan theo phương pháp đục lỗ thạch [35]. Quá trình nuôi cấy phải được thực hiện trong tủ cấy, phải đảm bảo các quy tắc vô trùng. Sau khi nuôi cấy xong, ủ các đĩa petri ở 37ºC, sau 24h đem ra đọc kết quả.
Hòa tan chitosan ở các nồng độ 0%; 0,3%; 0,4%, 0,5%; 0,6% trong CH3COOH 1% (pH = 5,5 – 6)
Dịch vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường TSB
Cấy trên môi trường PGA bằng phương pháp đục lỗ thạch và ủ ở 37ºC trong 24h
Đo đường kính kháng khuẩn Chitosan
2.2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của
chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ và độ
deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Mục đích thí nghiệm:
Xác định ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Các bước tiến hành như sau:
Vi khuẩn Erwinia sp.