chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ và độ
deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Mục đích thí nghiệm:
Xác định ảnh hưởng của nồng độ và độ deacetyl của chitosan đến khả năng kháng Erwinia sp.
Các bước tiến hành như sau:
Vi khuẩn Erwinia sp.
Tăng sinh trên môi trường TSB
Dịch vi khuẩn
Cấy trang trên đĩa petri
Đục lỗ thạch CTS: DD = 70%
DD = 82%
Hòa tan trong CH3COOH 1%
CTS 0% CTS 0,3% CTS 0,4% CTS 0,5% CTS 0,6% Nhỏ 150µl Nuôi cấy 37ºC/24h Đọc kết quả
+ Chuẩn bị dụng cụ:
Ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa thủy tinh, đầu pipet… rửa sạch, để ráo và được bao gói kín bằng giấy báo sau đó sấy vô trùng ở 160ºC trong 2 giờ. Riêng đầu pipet được xếp vào các hộp nhựa và được thanh trùng ở 121ºC/15 – 30 phút.
+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy PGA (Potato Glucose Agar):
Khoai tây rửa sạch, thái nhỏ, đem đi xay, bổ sung nước cất theo tỷ lệ trên, đun trong 30 phút lọc lấy dịch. Sau đó bổ sung thêm glucose, agar theo tỷ lệ đã có. Tiếp theo, tiến hành thanh trùng ở 121ºC/ 15phút. Sau khi thanh trùng môi trường để nguội tới tº = 40ºC rồi tiến hành đổ ra đĩa petri. Môi trường sau khi chuẩn bị có pH = 7,30,2.
Lưu ý: không đổ môi trường khi còn nóng do sẽ gây hiện tượng ngưng hơi nước trên nắp đĩa petri, có thể làm nguội môi trường dưới vòi nước chảy nhưng cần xoay đều bình chứa môi trường nhằm tránh hiện tượng bị đông kết. Mỗi đĩa đổ khoảng 25 ml môi trường.
+ Chuẩn bị dung dịch chitosan:
Dung dịch chitosan được pha ở các nồng độ 0%; 0,3%; 0,4%; 0,5%; 0,6% trong dung acid acetic 1%. Điều chỉnh pH của dung dịch đến pH = 5,5 – 6 bằng dung dịch NaOH 3%.
+ Chuẩn bị dịch vi khuẩn Erwinia sp.
Chủng vi khuẩn nghiên cứu được bảo quản trong các ống thạch nghiêng ở điều kiện thích hợp. Trước khi làm thí nghiệm 24h thực hiện cấy ria vi khuẩn trên môi trường không chọn lọc PGA . Mục đích cấy ria là để chọn được vi khuẩn có sức sống tốt nhằm đảm bảo tính hiệu quả và khách quan.
Phương pháp đục lỗ thạch: Tiến hành thí nghiệm
+ Chuẩn bị chủng vi khuẩn thử nghiệm:
Cấy chủng vi khuẩn vào môi trường TSB đã được khử trùng. Ủ ở 37ºC trong 24h để các chủng vi khuẩn hoạt hóa và tăng sinh.
Dung dịch chitosan được pha ở các nồng độ 0%; 0,3%; 0,4%; 0,5 %; 0,6% trong dung acid acetic 1%. Điều chỉnh pH của dung dịch chitosan đến pH = 5,5 – 6 bằng dung dịch NaOH 3%.
+ Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng PGA:
Môi trường PGA được pha như trên. Sau đó, môi trường PGA được hấp khử trùng và đổ vào các đĩa petri với thể tích khoảng 25- 30ml để tạo mặt thạch.
+ Sau đó dùng pipetman hút chính xác 100µl dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị cho vào đĩa petri chứa môi trường PGA. Dùng que cấy trang trải đều vi khuẩn lên trên mặt thạch của môi trường PGA để vi khuẩn có thể sinh trưởng đều trên mặt thạch.
+ Đợi mặt thạch tương đối khô, tiến hành đục lỗ thạch.
+ Dùng pipetman hút chính xác 150µl chitosan ở các nồng độ khác nhau cho vào các lỗ thạch.
+ Các thao tác cần phải tao tác trong điều kiện vô trùng, đảm bảo các nguyên tắc khi sử dụng tủ cấy.
+ Ủ các đĩa petri này trong 24h ở nhiệt độ 37ºC. Sau cùng, quan sát kết quả dựa vào vòng kháng khuẩn của chitosan. Nếu mẫu chitosan có tạo vòng kháng khuẩn chứng tỏ chitosan có khả năng kháng chủng vi khuẩn thử nghiệm, đo đường kính vòng kháng khuẩn của chitosan và báo cáo kết quả.