Phân lập và khảo sát hàm lượng aloe emodin trong dược liệu phan tả diệp (cassia angustifolia valh, fabaceace)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ MINH THU HÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ALOE EMODIN TRONG DƯỢC LIỆU PHAN TẢ DIỆP (CASSIA ANGUSTIFOLIA VALH, FABACEACE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ MINH THU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ALOE EMODIN TRONG DƯỢC LIỆU PHAN TẢ DIỆP (CASSIA ANGUSTIFOLIA VALH, FABACEACE) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Hữu Tâm PGS.TS Nguyễn Đinh Nga Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 Luận văn thạc sĩ dược học Khóa 2016 – 2018 Chuyên ngành kiểm nghiệm thuốc & độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ALOE EMODIN TRONG DƯỢC LIỆU PHAN TẢ DIỆP (CASSIA ANGUSTIFOLIA VALH, FABACEACE) Học viên: Lê Thị Minh Thu Thầy Cô hướng dẫn: TS.Trần Hữu Tâm PGS.TS Nguyễn Đinh Nga Tóm tắt Đặt vấn đề - Mục tiêu: Nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm góp phần vào cơng tác quản lý, đề tài tiến hành phân lập aloe emodin phục vụ cho công tác kiểm nghiệm xây dựng quy trình định lượng thành phần dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia Valh) di thực ” thực để đáp ứng mục tiêu đặt đồng thời góp phần vào việc nghiên cứu tìm dược liệu có khả phát triển sử dụng để điều trị bệnh Phương pháp nghiên cứu: Phân lập aloe emodin sắc ký cột chân không tinh chế Tiến hành xác định cấu trúc phương pháp phổ nghiệm UV-Vis, IR, MS, NMR Xây dựng quy trình định lượng aloe emodin phương pháp HPLC sơ đánh giá hàm lượng aloe emodin Phan tả diệp di thực Kết quả: Phân lập aloe emodin với hàm lượng 99.69% (phương pháp HPLC) Quy trình định lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp di thực đạt tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính (15 – 150 µg/ml, R ≥ 0.995), độ xác (RSD ≤ %) Sơ đánh giá hàm lượng aloe emodin Phan tả diệp di thực 1.55 mg/g Kết luận: Aloe emodin có độ tinh khiết cao, đạt yêu cầu chất đối chiếu Quy trình phân lập định lượng aloe emodin Phan tả diệp di thực đạt thông số ứng dụng quy mơ cơng nghiệp Master’s thesis of Pharmacy Academic course: 2016 – 2018 Speciality: Drugs quality control – Speciality code: 8720210 ISOLATED AND ALOE EMODIN SURVEY IN CASSIA ANGUSTIFOLIA VALH, FABACEACE Le Thi Minh Thu Supervisor: PhD Tran Huu Tam, Assoc Prof Nguyen Dinh Nga ABSTRACT Introduction – Objectives: In order to improve the quality of the products and contribute to the management, the topic of isolation of aloe emodin for testing and development of this quantitative process in medicinal herbs Cassia angustifolia Valh This is done to meet the objectives set out and at the same time contribute to the research finding capable pharmaceutical development used to treat today Methods: Isolation of aloe emodin by vacuum column chromatography and purification Determine the structure by UV-Vis, IR, MS, NMR spectroscopy Elaboration of aloe emodin quantitative procedures by HPLC and the preliminary assessment levels in cassia angustifolia aloe emodin acclimatized Results: From raw material, aloe emodin was isolated Assigned content values of aloe emodin was 99.69% by HPLC – PDA Quantitative method validation met requirement for suitability, specificity, linearity (15 – 150 µg/ml, R ≥ 0.995) and accuracy (RSD ≤ 2%) Preliminary assessment levels in cassia angustifolia aloe emodin acclimatized is valid 1.55 mg/g Conclusions: Aloe emodin has a high purity, meets the requirements of the reference material Process isolation and quantification of cassia angustifolia aloe emodin acclimatized to reach the parameters that can be applied on an industrial scale i LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Lê Thị Minh Thu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại họ Fabaceae chi Cassia 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Cassia 1.1.3 Tổng quan thực vật học Phan tả diệp 1.2 TỔNG QUAN VỀ HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học chi Cassia 1.2.2 Thành phần hóa học Phan tả diệp 10 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 12 1.3.1 Tác dụng dược lý chi Cassia 12 1.3.2 Tác dụng dược lý Cassia angustifolia Valh 12 1.4 MỘT SỐ BÀI THUỐC VÀ CHẾ PHẨM TỪ PHAN TẢ DIỆP 14 1.4.1 Bài thuốc từ Phan tả diệp 14 1.4.2 Một số chế phẩm từ Phan tả diệp 14 1.5 CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ 14 1.5.1 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 15 1.5.2 Sắc ký cột chân không (VLC) 15 1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ TRONG XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 16 1.6.1 Phổ tử ngoại khả kiến 16 1.6.2 Phổ hồng ngoại 16 1.6.3 Khối phổ 16 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 17 1.7 TỔNG QUAN VỀ ALOE EMODIN 17 1.7.1 Tính chất hóa lý 17 1.7.2 Tính chất dược lý 18 iii Chương – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 19 2.2.1 Chất chuẩn, hóa chất, dung mơi 19 2.2.2 Trang thiết bị 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Chiết xuất 20 2.3.2 Phân lập tinh chế 20 2.3.3 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập 21 2.3.4 Xây dựng quy trình định lượng aloe emodin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 23 2.3.5 Đánh giá quy trình định lượng aloe emodin 24 Chương – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA PHAN TẢ DIỆP 27 3.2 CHIẾT XUẤT 28 3.3 PHÂN LẬP CÁC CHẤT BẰNG SẮC KÝ 28 3.3.1 Tách phân đoạn sắc ký cột chân không (VLC) 28 3.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết A1 HPLC 31 3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT A1 33 3.4.1 Phổ UV hợp chất A1 33 3.4.2 Phổ IR hợp chất A1 33 3.4.3 Phổ MS hợp chất A1 34 3.4.4 Phổ NMR hợp chất A1 35 3.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALOE EMODIN TRONG CÂY PHAN TẢ DIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 39 3.5.1 Khảo sát điều kiện HPLC 39 3.5.2 Quy trình định lượng aloe emodin Phan tả diệp 43 3.5.3 Đánh giá quy trình định lượng aloe emodin 43 3.5.4 Sơ đánh giá hàm lượng aloe emodin Phan tả diệp 48 Chương – BÀN LUẬN 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT δ Chemical shift - Độ dời hóa học CDCl3 Chloroform d Doublet – pic đôi dd Doublet – Doublet – pic bốn DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer HPLC High Performance Liquid Chromatography – sắc ký lỏng hiệu cao EA, EtoAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation J Hằng số ghép (coupling constant) MHz Mega Hertz MeOH Methanol MS Mass Spectroscopy – Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân ppm Parts per million s Singlet - Pic đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet – pic ba TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử VS Vanillin sulfuric VLC Vacuum Liquid Chromatography – Sắc ký cột chân không v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học số loài chi Cassia Bảng 1.2 Một số anthranoid Phan tả diệp Bảng 3.1 Kết phân tích sơ thành phần hóa học phan tả diệp 22 Bảng 3.2 Kết kiểm tra độ tinh khiết A1 HPLC 29 Bảng 3.3 Bảng so sánh phổ 1H-NMR 13C-NMR so với aloe emodin 31 Bảng 3.4 Số liệu đường tuyến tính aloe emodin 39 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống phương pháp aloe emodin 40 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại aloe emodin mẫu thử 43 Bảng 3.7 Tóm tắt kết thẩm định quy trình định lượng 44 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình ảnh Phan tả diệp (Cassia angustifolia Valh) Hình 1.2 Một số chế phẩm từ Phan tả diệp 12 Hình 3.1 Sắc ký đồ kiểm tra ống từ 55 – 63 qua cột VLC 26 Hình 3.2 Sắc ký đồ kiểm tra tủa A B sau rửa với CHCl3 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ (HPLC) họp chất A1 28 Hình 3.4 Phổ hấp thu UV hợp chất A1 28 Hình 3.5 Phổ 3D hợp chất A1 28 Hình 3.6 Độ tinh khiết pic A1 29 Hình 3.7 Phổ IR hợp chất A1 30 Hình 3.8 Phổ MS (ES-) hợp chất A1 30 Hình 3.9 Cấu trúc hố học aloe emodin (hợp chất A1) 32 Hình 3.10 Phổ 1H-NMR hợp chất A1 (CDCl3, 500 MHz) 33 Hình 3.11 Phổ 13C-NMR hợp chất A1 (CDCl3, 125 MHz) 33 Hình 3.12 Phổ DEPT hợp chất A1 (CDCl3, 125 MHz) 34 Hình 3.13 Phổ HMBC hợp chất A1 (CDCl3, 500MHz) 34 Hình 3.14 Phổ HSQC hợp chất A1 (CDCl3, 500 MHz) 35 Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu chuẩn aloe emodin 37 Hình 3.16 Phổ hấp thu UV aloe emodin 37 Hình 3.17 Sắc ký đồ mẫu thử với pha động MeOH – acid phosphoric 0.1 % (70 :30), (1 ml/phút) 38 Hình 3.18 Kết khảo sát độ tinh khiết pic aloe emodin với pha động MeOH –acid phosphoric 0.1 % (70:30), (1 ml/phút) 38 Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu thử với pha động MeOH – acid phosphoric 0.1 % (60:40), (1 ml/phút) 39 Hình 3.20 Kết khảo sát độ tinh khiết pic aloe emodin với pha động MeOH –acid phosphoric 0.1 % (60:40), (1 ml/phút) 39 Hình 3.21 Đường biểu diễn dện tích pic theo nồng độ aloe emodin 40 Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu trắng 42 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PHỤ LỤC 11 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PHỤ LỤC 12 Sắc ký đồ khảo sát tính lặp lại Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... góp phần vào cơng tác quản lý, đánh giá chất lượng thuốc có thành phần Phan tả diệp, đề tài ? ?Phân lập khảo sát hàm lượng aloe emodin dược liệu Phan tả diệp (Cassia angustifolia Valh, Fabaceace)? ??... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - LÊ THỊ MINH THU PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ALOE EMODIN TRONG DƯỢC LIỆU PHAN TẢ DIỆP (CASSIA ANGUSTIFOLIA VALH, FABACEACE). .. định lượng aloe emodin phương pháp HPLC sơ đánh giá hàm lượng aloe emodin Phan tả diệp di thực Kết quả: Phân lập aloe emodin với hàm lượng 99.69% (phương pháp HPLC) Quy trình định lượng aloe emodin