Phân lập acid oleanolic từ xuyên mộc thông ( c armandii ) và ứng dụng để phân biệt các dược liệu mộc thông bằng hplc và hptlc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  HUỲNH NGỌC THÙY TRÂM PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ XUYÊN MỘC THÔNG (C ARMANDII) VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ PHÂN BIỆT CÁC DƯỢC LIỆU MỘC THÔNG BẰNG HPLC VÀ HPTLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  HUỲNH NGỌC THÙY TRÂM PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ XUYÊN MỘC THÔNG (C.ARMANDII) VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ PHÂN BIỆT CÁC DƯỢC LIỆU MỘC THÔNG BẰNG HPLC VÀ HPTLC NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS HÀ MINH HIỂN PGS.TS VĨNH ĐỊNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực Và chưa cơng bố cơng trình khác Tác giá luận văn Huỳnh Ngọc Thùy Trâm BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT Từ khóa: HPTLC, Xun mộc thơng, acid oleanolic, triterpenoid, saponin, sapogenin Mở đầu: Phần lớn dược liệu Mộc thông thị trường thu hoạch từ Clematis armandii Franch (Chuanmutong – Dược điển Trung Quốc) có trường hợp lẫn lộn với Aristolochia manshuriensis Iodes vitiginea Đề tài thực phân lập acid oleanolic từ C.armandii, xây dựng quy trình định lượng acid oleanolic C.armandii HPLC quy trình định tính, bán định lượng HPTLC Các quy trình thẩm định đầy đủ tiêu Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Clematis armandii, Iodes vitiginea, Aristolochia manshuriensis Phương pháp nghiên cứu: Bột C.armandii ngâm lạnh với methanol 80%, cao phân đoạn n-butanol thủy phân chiết phân bố với petroleum ether, sau tiến hành sắc ký cột cổ điển kết tinh lạnh Hợp chất phân lập đem kiểm tra cấu trúc IR, MS, NMR xác định acid oleanolic Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid oleanolic C.armandii HPLC-PDA, định tính phân biệt, bán định lượng C.armandii HPTLC Kết quả: Đã phân lập 82,5 mg acid oleanolic Xây dựng quy trình định lượng HPLC định tính, bán định lượng HPTLC Kết định lượng cho thấy có khoảng 0,003% acid oleanolic nguồn dược liệu C.armandii Công ty TNHH Dân Lợi cung cấp Kết luận: Những kết tiền đề cho nghiên cứu kiểm nghiệm dược liệu Xuyên mộc thơng sau BẢNG TĨM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH Từ khóa: HPTLC, Chuanmutong, acid oleanolic, triterpenoid, saponin, sapogenin Introduction: Most of Chuanmutong on the market is harvested from Clematis armandii Franch but there are cases of alduterants with Aristolochia manshuriensis and Iodes vitiginea The thesis aims is to isolate oleanolic acid from C.armandii, develope a quantitative procedure of oleanolic acid in C.armandii by HPLC and qualitative, semi-quantitative procedures by HPTLC The procedures are fully validated Research object and method Object: Clematis armandii, Iodes vitiginea, Aristolochia manshuriensis Method: C armandii powder was extracted by percolation method with methanol 80%, n-butanol fraction was hydrolyzed and distributed with petroleum ether, then classical column chromatography and cold crystallization were performed The isolated compound was examined for structure by Infrared spectroscopy (IR), Mass spectrometry (MS) and Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and determined to be oleanolic acid Develop and validate method for quantitative oleanolic acid on C.armandii by HPLC-PDA, and qualitative and semi-quantitative C armandii by HPTLC Results: 82.5 mg of oleanolic acid was isolated The quantitative process by HPLC and qualitative and semi-quantitative processes by HPTLC was developed Quantitative results show that there is about 0.003% oleanolic acid in the source of C.armandii medicinal herbs provided by Dan Loi Co., Ltd Conclusion: These results are the premise for future researches on testing the medicinal herbs of Chuanmutong MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT ii BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Tổng quan họ Ranunculaceae 1.2 Tổng quan chi Clematis 1.3 Tổng quan Clematis armandii Franch 1.4 Sơ lược dược liệu Quan mộc thông Aristolochia manshuriensis acid aristolochic 14 1.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45 3.1 Kiểm tra tính dược liệu .45 3.2 Chiết xuất, phân lập tinh chế acid oleanolic 54 3.3 Xây dựng thẩm định quy trình phân định lượng acid oleanolic dược liệu C armandii HPLC-PDA 68 3.4 Xây dựng thẩm định quy trình định tính bán định lượng acid oleanolic C.armandii HPTLC 80 CHƯƠNG BÀN LUẬN 94 4.1 Chiết xuất phân lập 94 4.2 Định lượng acid oleanolic dược liệu C.armandii HPLC-PDA 95 4.3 Quy trình định tính bán định lượng HPTLC .96 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguyên EtOAc Ethyl acetat HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Evaporative light scattering detection (Đầu dò tán xạ ELSD ánh sáng bay hơi) ESI – MS Electron spray ionization mass spectrometry (phổ khối nguồnion hóa phun điện) EtOH Ethanol HPTLC High performance Thin-layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) HR-ESI–MS High resolution electron spray ionization mass spectrometry (phổ khốinguồn ion hóa phun điệnđộ phân giải cao) MeOH Methanol MS Mass spectrometry (Khối phổ) n-BuOH n-butanol NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photodiode Array (Dãy diod quang) SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin-layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) TLTK Tài liệu tham khảo UV Ultraviolet (Tử ngoại) Vis Visible (Khả kiến) PE Petroleum ether DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh Xun mộc thơng “A coloured Atlas of the chinese Materia Medica specified in Pharmacopoeia of the People's Republic of China (1995 edition) 12 Hình 1.2 Hình ảnh mẫu dược liệu Aristolochia manshuriensis (guanmutong) lưu giữ Hooper Collection 30 14 Hình 1.3 Máy chấm SKLMCAMAG Linomat 37 18 Hình 1.4 Máy triển khai SKLM CAMAG ADC 38 18 Hình 2.1 Sơ đồ trình tự nội dung nghiên cứu 23 Hình 2.2 Hình ảnh minh họa mỏng định tính từ dược điển Châu Âu 29 Hình 2.3 Sơ đồ trình tự phân lập acid oleanolic 31 Hình 2.4 Sơ đồ chuẩn bị mẫu thử 34 Hình 2.5 Cài đặt vị trí khoảng cách band mỏng 40 Hình 3.1 dạng hình thái phiến cắt mẫu dược liệu thu thập (1-Iodes vitiginea, 2-Clematis armandii, 3-Aristolochia manshuriensis) .45 Hình 3.2 Kết so sánh trình tự gen mẫu làm đối tượng nghiên cứu ngân hàng gen NCBI 46 Hình 3.3 Các cấu tử bột Xuyên mộc thông Clematis armandii 48 Hình 3.4 Các cấu tử bột Mộc thơng nam Iodes vitiginea .49 Hình 3.5 Các cấu tử bột Quan mộc thơng Aristolochia manshuriensis .50 Hình 3.6 Bản mỏng định tính theo quy trình Dược điển Châu Âu 10.1 50 Hình 3.7 Bản mỏng định tính theo quy trình Dược điển Trung Quốc 2020 51 Hình 3.8 Bản mỏng định tính theo quy trình Tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kong Trung Quốc 2022 51 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (trên) mẫu thử (dưới) xử lý theo quy trình Dược điển Châu Âu 10.1 53 Hình 3.10 SKLM dịch chiết phân đoạn từ cao MeOH EtOH .54 Hình 3.11 SKLM Dịch sau thủy phân từ cao MeOH 50%, 80%, 100% 55 Hình 3.12 SKLM Khảo sát nồng độ HCl thời gian thủy phân 56 Hình 3.13 SKLM Dịch sau thủy phân lắc phân bố với DCM PE (35 - 60°)57 Hình 3.14 Sơ đồ chiết xuất sapogenin từ bột thân Xun mộc thơng .58 Hình 3.15 Sắc ký đồ phân đoạn cao petroleum ether 59 Hình 3.16 Sơ đồ phân lập hợp chất sapogenin từ hỗn hợp sapogenin thu từ bột thân Xuyên mộc thông 60 Hình 3.17 Sắc ký đồ phân lập acid oleanolic 61 Hình 3.18 SKLM độ tinh khiết chất phân lập so với chuẩn Acid oleanolic 62 Hình 3.19 Phổ IR hợp chất phân lập 63 Hình 3.20 Phổ ESI MS+ hợp chất phân lập .64 Hình 3.21 Phổ 13C NMR (CDCL3, 125 MHz) hợp chất phân lập 65 Hình 3.22 Cấu trúc acid oleanolic 67 Hình 3.23 Sắc ký đồ HPLC đánh giá tính đặc hiệu quy trình định lượng acid oleanolic C armandii 72 Hình 3.24 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích 75 Hình 3.25 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diện tích dung dịch chuẩn .77 Hình 3.26 Kêt thống kê so sánh hệ số đáp ứng dung dịch .78 Hình 3.27 HPTLC tính đặc hiệu phương pháp – mỏng chưa phun thuốc thử - Quan sát UV 366 nm 81 Hình 3.28 HPTLC tính đặc hiệu phương pháp – mỏng chưa phun thuốc thử - Quan sát (A) Ánh sáng trắng (B) UV 366 nm 82 Hình 3.29 HPTLC độ ổn định dung dịch thời điểm giờ, .84 Hình 3.30 Overlay sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 86 Hình 3.31 So sánh sắc ký đồ dung dịch: (A) dung dịch thử, (B) dung dịch chuẩn, (C) mẫu trắng (methanol) 87 Hình 3.32 Kết tính tốn phần mềm VisionCat 89 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 15 Kết tính tuyến tính dung dịch chuẩn quy trình định lượng acid oleanolic C armandii PL 24 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 16 Kết độ quy trình định lượng acid oleanolic C armandii PL 25 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 26 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 17 Kết độ lặp lại quy trình định tính C armandii HPTLC Chú thích: 0.03: Dung dịch chuẩn acid oleanolic 30 µg/ml Mau 1-1, mau 1-2, mau 1-3: dung dịch C.armandii mẫu 1, cân xử lý mẫu riêng biệt Mau 2-1, mau 2-2, mau 2-3: dung dịch C.armandii mẫu 2, cân xử lý mẫu riêng biệt Mau 3-1, mau 3-2, mau 3-3: dung dịch C.armandii mẫu 3, cân xử lý mẫu riêng biệt PL 27 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 18 Kết độ xác trung gian quy trình định tính C armandii HPTLC PL 28 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 19 Kết độ thơ quy trình định tính C armandii HPTLC RF: 0.59 RF: 0.59 RF: 0.59 RF: 0.45 RF: 0.45 RF: 0.44 RF: 0.07 RF: 0.07 RF: 0.07 (A) (A) RF: 0.63 RF: 0.48 RF: 0.09 (B) RF: 0.62 RF: 0.62 RF: 0.47 RF: 0.46 RF: 0.09 RF: 0.09 (C) Các mẫu 1,2,3 triểu khai độ ẩm 58% (B) (C) (D) Lần lượt mẫu 1, 2, triển khai độ ẩm 38% PL 29 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn (D) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 20 Kết độ lặp lại hệ thống phun, quy trình bán định lượng C armandii HPTLC PL 30 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 21 Kết tính tuyến tính quy trình bán định lượng C armandii HPTLC PL 31 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 32 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 22 Kết độ lặp lại quy trình bán định lượng C armandii HPTLC Chú thích: 0.03: Dung dịch chuẩn acid oleanolic 30 µg/ml DL-1, DL-2, DL-3, DL-4, DL-5, DL-6: dung dịch thử độ lặp lại từ đến PL 33 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 34 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 23 Kết độ xác trung gian quy trình bán định lượng C armandii HPTLC Chú thích: 0.03: Dung dịch chuẩn acid oleanolic 30 µg/ml DCX-1, DCX-2, DCX-3, DCX-4, DCX-5, DCX-6: dung dịch thử độ xác từ đến PL 35 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 36 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 24 Kết độ quy trình bán định lượng C armandii HPTLC Chú thích: 0.03: Dung dịch chuẩn acid oleanolic 30 µg/ml Thu: Dung dịch thử (không thêm chuẩn) DD-80: dung dịch thử thêm chuẩn mức 80% DD-100: dung dịch thử thêm chuẩn mức 100% DD-120: dung dịch thử thêm chuẩn mức 120% vs (n.d.) PL 37 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Wua KM, Farrellya JG, Uptonb R, Chenc J Complexities of the herbal nomenclature system in traditional Chinese medicine (TCM): Lessons learned from the misuse of Aristolochia-related species and the importance of the pharmaceutical name during botanical drug product development Phytomedicine 2007; 14:273– 279 PL 38 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn