Phân lập các chủng niêm khuẩn myxococcus, nuôi cấy và xác định phân đoạn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ dịch lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ LAN LINH PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NIÊM KHUẨN MYXOCOCCUS, NI CẤY VÀ XÁC ĐỊNH PHÂN ĐOẠN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT TỪ DỊCH LÊN MEN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ LAN LINH PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NIÊM KHUẨN MYXOCOCCUS, NI CẤY VÀ XÁC ĐỊNH PHÂN ĐOẠN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT TỪ DỊCH LÊN MEN CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TÚ ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực khách quan Tác giả luận văn ĐINH THỊ LAN LINH TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Phân lập chủng niêm khuẩn Myxococcus, nuôi cấy xác định phân đoạn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ dịch lên men Học viên: Đinh Thị Lan Linh Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Tú Anh Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu: Tình hình đề kháng kháng sinh giới ngày gia tăng, nguyên nhân gây tử vong hàng trăm ngàn người năm tiêu tốn hàng trăm tỷ USD Trong năm gần đây, Myxococcus xem nguồn cung cấp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học cao nhà khoa học quan tâm Trong nghiên cứu này, tiến hành: (i) Phân lập định danh chủng thuộc chi Myxococcus; (ii) Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật sàng lọc chủng tiềm năng; (iii) Khảo sát môi trường điều kiện nuôi cấy tối ưu nhằm mục đích thu cao chiết có hoạt tính cao xác định phân đoạn có hoạt tính từ cao chiết Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Các mẫu đất thu thập từ 11 tỉnh/thành phố Việt Nam sử dụng để phân lập Myxococcus phương pháp: mồi E coli, phân thỏ giấy lọc Các chủng vi khuẩn phân lập làm định danh dựa vào đặc điểm hình thái, chuyển động trượt ly giải vi khuẩn, thử nghiệm sinh hóa giải trình tự gen 16S rDNA Tiếp theo, lên men vi khuẩn thu cao chiết, đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch vi pha loãng để xác định chủng tiềm Sau cùng, khảo sát môi trường điều kiện nuôi cấy chủng tiềm để thu cao chiết có hoạt tính cao Xác định phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao chiết phương pháp hình sinh học Kết quả: Phân lập làm 19 chủng vi khuẩn phương pháp phân lập, kết định danh cho thấy 19 chủng thuộc chi Myxococcus Trong đó, chủng định danh tới mức độ chi, chủng thuộc loài Myxococcus fulvus, chủng thuộc loài Myxococcus stipitatus chủng thuộc loài Myxococcus virescens Qua sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật, 19 chủng có hoạt tính vi khuẩn vi nấm với giá trị MIC khoảng từ 1-512 µg/ml Chủng GL41 (M stipitatus) chủng tiềm thể hoạt tính cao tất chủng vi sinh vật thử nghiệm Môi trường điều kiện lên men tối ưu vi khuẩn môi trường VY/3, thời gian lên men 10 ngày 35 ℃, pH 7,6 thời điểm bổ sung nhựa XAD16N vào ngày thứ trình lên men Ở điều kiện tối ưu, GL41 có hoạt tính tốt MSSA, MRSA, S faecalis, C albicans A niger với giá trị MIC µg/ml, Rhizopus sp Mucor sp µg/ml, Penicillium sp µg/ml, E coli 32 µg/ml thấp P aeruginosa 128 µg/ml Khai triển sắc ký lớp mỏng, xuất vết sắc ký đồ tương ứng với phân đoạn Trong đó, phân đoạn có hoạt tính phân đoạn số (Rf = 0,63) ức chế phát triển vi sinh vật thử nghiệm gồm MRSA, S faecalis, Rhizopus sp., Mucor sp., Penicillium sp., C albicans, A niger phân đoạn số (Rf = 0,72) tạo vùng ức chế vi sinh vật MSSA, C albicans A niger Kết luận kiến nghị: Cao chiết từ dịch lên men chủng GL41 có hoạt tính tốt 10 chủng vi sinh vật thử nghiệm có tiềm để phân lập hoạt chất tinh khiết ABSTRACT THESIS OF MASTER OF PHARMACY Isolation of strains of Myxococcus, culture and determination of fractions with antimicrobial activity from fermented broth Student: Dinh Thi Lan Linh Instructor: Assoc Prof Dr Nguyen Tu Anh Introductions and research objectives: Antibiotic resistance is one of the biggest threats to global health, causing hundreds of thousands of deaths and costing billions of dollars annually In recent years, Myxococcus has been considered a microorganism producing highly bioactive secondary metabolites and is great interest to scientists In this study, the experiments were conducted to (i) Isolation and identification of isolates belonging to the genus Myxococcus; (ii) Evaluation of the antimicrobial activities and determination of the most potent strains; (iii) Investigation the optimal fermentation culture and conditions for the most active extract and determination of the active fractions from the extract Objective and research methods: Soil samples collected from 11 provinces/cities in Viet Nam were used to isolate Myxococcus applying methods: E coli primer, rabbit dungs and filter paper methods The isolates were purified and identified by morphological characterization, gliding and bacterial lysis, biochemical test and 16S rDNA gene sequencing Then crude extracts from these Myxococcus strains were test the antimicrobial activities by agar well diffusion and microdilution method Continously, the media compositions and culture conditions of the selected potent strain was optimized to obtain the extract possessing the highest antimicrobial activity The active fractions were determined by bioautography assay Results: 19 strains of bacteria isolated and purified by the methods belonged to the genus Myxococcus Among these, strains were identified at the genus level, Myxococcus fulvus (6 strains), Myxococcus stipitatus (5 strains), and Myxococcus virescens (1 strain) Screening for antimicrobial activity, all of 19 strains showed the ability against the test bacteria or yeast, filamentous fungi with MIC values in the range of 1-512 µg/ml Strain GL41 (identified as M stipitatus) is a potent strain that shows high activity against all the tested microorganisms The optimal medium and condition fermentation for this strain were determined: VY/3 medium, 10th-day fermentation at 35 oC, pH 7.6 and XAD-16N resin was added at 4th-day of culture Under optimal conditions, GL41 had the best activity against MSSA, MRSA, S faecalis, C albicans and A niger with MIC value of µg/ml, Rhizopus sp and Mucor sp are µg/ml, Penicillium sp is µg/ml, E coli is 32 µg/ml, and the lowest is 128 µg/ml on P aeruginosa After developing thin layer chromatography, spots were detected in the chromatogram corresponding to fractions In which, the two active fractions are the fraction (Rf = 0,63) inhibiting the growth of the seven tested microorganisms including MRSA, S faecalis, Rhizopus sp., Mucor sp., Penicillium sp., C albicans, and A niger and the fraction (Rf = 0,72) showing inhibition zones for the three tested microorganisms including MSSA, C albicans, and A niger Conclusions and recommendations: The total extract from strain GL41 have good activity against all the 10 tested strains of microorganisms, and great potential in isolating bioactive compounds LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới cô PGS TS Nguyễn Tú Anh - người hướng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu đồng hành, giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới cô ThS Nguyễn Thị Ngọc Yến, thầy ThS Dương Đình Chung hỗ trợ giúp đỡ em hết lòng suốt quãng thời gian em thực luận văn Cảm ơn thầy, cô, anh, chị bạn monitor môn Vi sinh – Ký sinh thuộc khoa Dược trường Đại học Nguyễn Tất Thành Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ em nhiều giai đoạn đề tài Cảm ơn tồn thể thầy khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, người truyền đạt thêm nhiều kiến thức, kỹ kinh nghiệm cho em năm qua Mình xin cảm ơn bạn lớp Cao học Kiểm nghiệm thuốc độc chất 2020 quan tâm, động viên, giúp đỡ cho nhiều kỉ niệm đẹp suốt quãng thời gian học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới bố, mẹ vất vả hi sinh đời điểm tựa cho mặt tinh thần, nguồn động lực giúp dám mạnh mẽ vươn tay chạm tới ước mơ Xin trân trọng cảm ơn tất người! MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH iv MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Myxococcus 1.2 Phân lập Myxococcus 1.3 Định danh Myxococcus 10 1.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật 14 1.5 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật phương pháp hình sinh học 17 1.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 18 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 2.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 Chương KẾT QUẢ .37 3.1 Phân lập Myxococcus 37 3.2 Định danh Myxococcus 40 3.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật Myxococcus .45 3.4 Xác định môi trường lên men chủng GL41 .51 3.5 Khảo sát điều kiện lên men chủng GL41 52 3.6 Xác định phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao chiết dịch lên men chủng GL41 54 Chương Bàn luận 57 4.1 Phân lập Myxococcus 57 4.2 Định danh Myxococcus 58 4.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật dịch lên men Myxococcus 61 4.4 Xác định môi trường điều kiện lên men 62 4.5 Xác định phân đoạn chứa hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật 64 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 5.1 Kết luận 66 5.2 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết MIC MSSA MRSA S faecalis Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh tròn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết MIC E coli P aeruginosa C albicans Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết MIC Rhizopus sp Mucor sp Penicillium sp Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết MIC A niger Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Mơi trường điều kiện lên men chủng GL41 Phụ lục 4.1 Xác định môi trường lên men chủng GL41 Môi trường CTT CYE MD1 P SSG VY/3 Môi trường CTT CYE MD1 P SSG VY/3 MIC (µg/ml) MSSA MRSA S faecalis E coli P aeruginos Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 512 512 512 512 512 512 512 512 512 512 512 512 256 256 256 128 128 128 64 64 64 128 128 128 1 1 1 1 64 64 64 128 128 128 8 1 8 1 1 1 1 32 32 32 128 128 128 C albicans Rhizopus sp Mucor sp Penicillium sp A niger Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 512 512 512 512 512 512 512 512 512 128 128 128 512 512 512 64 64 64 256 256 256 1 16 16 16 16 16 16 8 1 32 32 32 128 128 128 128 128 128 64 64 64 1 4 8 16 16 16 1 Ghi chú: (-) khơng có hoạt tính Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Vi sinh vật Kết thử nghiệm xác định môi trường lên men MSSA MRSA S faecalis E coli P aeruginosa Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Vi sinh vật Kết thử nghiệm xác định môi trường lên men C albicans Rhizopus sp Mucor sp Penicillium sp A niger Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh tròn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 4.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng GL41 Điều kiện MSSA MRSA Thời gian lên men (ngày) Lần Lần Lần Lần 16 16 Lần 16 16 Lần 16 16 Lần 1 10 Lần 1 Lần 1 Thời điểm bổ sung nhựa XAD-16N Lần Ngày Lần thứ Lần Lần 1 Ngày Lần 1 thứ Lần 1 Lần 256 64 Ngày thứ Lần 256 64 10 Lần 256 64 pH Lần 256 64 6,0 Lần 256 64 Lần 256 64 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn St Ec MIC (µg/ml) Pa Ca Rhi Mu Pe An 256 256 256 1 32 32 32 128 128 128 128 128 128 4 256 256 256 8 512 512 512 16 16 16 16 16 16 1 64 64 64 1 1 1 128 128 128 32 32 32 512 512 512 128 128 128 - 1 64 64 64 4 512 512 512 8 256 256 256 16 16 16 256 256 256 1 64 64 64 256 256 256 - - 32 32 32 256 256 256 128 128 128 512 512 512 32 32 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh MIC (µg/ml) Điều kiện MSSA MRSA St Ec Pa Ca Rhi Mu Pe An 1 512 512 512 - 1 512 512 512 - 1 - 32 32 32 - 128 128 128 - 1 128 128 128 - 4 512 512 512 - 8 128 128 128 - 16 16 16 512 512 512 - 1 - 2 1 - 4 1 - 8 1 - 256 256 256 32 32 32 - 256 256 256 128 128 128 - 2 1 - 8 4 - 8 4 - 16 16 16 8 - 1 1 1 - pH Lần 7,6 Lần Lần Lần 8,5 Lần Lần Lần 10,0 Lần Lần Nhiệt độ (℃) Lần 25 Lần Lần Lần 30 Lần Lần Lần 35 Lần Lần Lần 40 Lần Lần Ghi chú: (-) khơng có hoạt tính, St: S faecalis, Ec: E coli, Pa: P aeruginosa, Ca: C albicans, Rhi: Rhizopus sp., Mu: Mucor Sp., Pe: Penicillium sp., An: A niger Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện Thời gian lên men Thời điểm bổ sung nhựa XAD-16N MSSA MRSA S faecalis E coli Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện Thời gian lên men Thời điểm bổ sung nhựa XAD-16N P aeruginosa C albicans Rhizopus sp Mucor sp Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh tròn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện Thời gian lên men Thời điểm bổ sung nhựa XAD-16N Penicillium sp A niger Điều kiện pH Nhiệt độ MSSA Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh tròn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện Thời gian lên men Thời điểm bổ sung nhựa XAD-16N MRSA S faecalis E coli Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện pH Nhiệt độ P aeruginosa C albicans Rhizopus sp Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Điều kiện pH Nhiệt độ Mucor sp Penicillium sp A niger Ghi chú: Nồng độ giếng từ 1-10 512, 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, µg/ml, (11) giếng GC, (12) giếng SC, giếng khoanh trịn: vị trí giếng có giá trị MIC Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn