Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi, ngành chăn nuôi vịt đang dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan trọng, góp phần vào chương trình xoá đói giảm nghèo cho nông dân.
Trang 1Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng
khác của thế giới
Đề cương đề tài mã số: CH0852
Lời cam đoan 1
Lời cảm ơn 2
Mục lục 3
Danh mục các chữ viết tắt 6
Danh mục bảng 7
Danh mục hình 8
1 MỞ ĐẦU 10
1.1 Tính cấp thiết của đề tài……… 10
1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài……… 11
1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài………11
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12
2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck Hepatitis)……… 12
2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh……… 12
2.1.2 Loài mắc bệnh……… 13
2.1.3 Đường xâm nhập và cách lây lan……….13
2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus……… 14
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích……… 14
2.1.6 Chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus……….16
2.1.7 Phòng chống bệnh………17
2.2 Một số đặc tính sinh học của virus viêm gan vịt type I……… 18
2.2.1 Đặc tính nuôi cấy virus………18
2.2.2 Sức đề kháng của DHV-1………20
2.2.3 Đặc tính kháng nguyên của virus DHV-1………20
2.2.4 Biến dị của virus
……… 21
2.3 Sinh học phân tử và sơ đồ phả hệ virus viêm gan vịt type I ……… 21
2.3.1 Sơ lược về Picornavirus ……… ………21
Trang 22.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I………23
2.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1……… ………25
2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt ……….……… 29
2.4.1 Miễn dịch thụ động ……….………29
2.4.2 Miễn dịch chủ động ……….………30
2.5 Các kĩ thuật sinh học phân tử ……… 31
2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ………31
2.5.2 Phản ứng RT-PCR ……….………32
2.5.3 Kĩ thuật điện di… ……….………32
2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen……… ………33
2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu đặc tính phân tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt được sử dụng ở Việt Nam ……….……….………34
2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trong và ngoài nước …………35
3 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38
3.1 Nội dung nghiên cứu……… ……… 38
3.2 Nguyên liệu… ……… 38
3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1….………….……… 38
3.2.2 Cặp mồi ………… ……….………39
3.2.3 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm……….………39
3.3 Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt…… 41
3.4 Địa điểm thực hiện đề tài ……… ……… 42
3.5 Phương pháp nghiên cứu ……… ……… 42
3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số
…….………42
3.5.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR một bước.………43
3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR ……… ………44
3.5.4 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR… ………….………45
3.5.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen ………45
3.5.6 Thực hiện phản ứng giải trình trình tự…….………49
3.5.7 Tinh sạch sản phẩm giải trình trình tự ….………50
3.5.8 Xử lý số liệu……….………51
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số……… ……… 52
Trang 34.2 Kết quả phản ứng RT-PCR ……… ……… 53
4.3 Kết quả dòng hóa và tách dòng sản phẩm……… ……… 54
4.3.1 Kết quả dòng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli ………54
4.3.2 Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp ………56
4.4 Kết quả giải trình trình tự nucleotit và axit amin của gen kháng nguyên VP1 ở 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt……… ……….57
4.5 Kết quả truy cập ngân hàng gen, so sánh chuỗi gen kháng nguyên VP1 của 2 chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng khác trên thế giới… ……… 59
4.6 So sánh thành phần nucleotit và axit amin của gen VP1 giữa hai chủng virus vacxin ở Việt Nam và một số chủng trên thế giới……… ……… 62
4.6.1 Các chủng tham gia trong phân tích so sánh ………62
4.6.2 Kết quả đối chiếu so sánh thành phần nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của VxAC và VxXT với các chủng khác trên thế giới ………63
4.7 Tỷ lệ tương đồng nucleotit và axit amin giữa các chủng nghiên cứu …… 69
4.8 Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng virus nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác……… ……… 71
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74
5.1 Kết luận ……… 74
5.2 Kiến nghị……… ……… 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO 75
PHỤ LỤC 81
Trang 4CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DHV : Duck Hepatitis Virus
VxXT : Vacxin do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất VxAC : Vacxin có nguồn gốc đưa về từ Ai Cập
DNA : Axit Deoxyribonucleic
RNA : Axit Ribonucleic
VPg : Viral Protein genome-linked
PCR : Polymerase Chain Reaction
RT-PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid
dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate
ddNTP : Dideoxy Nucleotide Triphosphate
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase
TAE : Tris Acetic acid EDTA
UTR : Untranslated Region
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
Trang 5DANH MỤC BẢNG
3.1 Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 39 4.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi
gen VP1 của chủng virus vacxin Ai Cập (VxAC)
60
4.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi
gen VP1 của chủng virus vacxin xưởng thuốc (VxXT)
61
4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh 62 4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotit (trên đường
chéo) và axit amin (dưới đường chéo) của hai chủng virus
vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với
một số chủng trên thế giới thuộc DHV-1
70
Trang 6DANH MỤC HÌNH
Số
2.1 Tư thế chết điển hình ở trạng thái opistotonus của
vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt (ảnh minh họa)
15
2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa) 15 2.3 Mô tả virus viêm gan vịt type I 22 2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm
gan vịt
22
2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24
loại virus thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae Mối
quan hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách của cây
phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của
phức hệ protein [60] Vị trí của nhóm virus viêm gan
vịt (DHV 1) được chỉ dẫn bằng mũi tên
28
2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO 33 3.1 Sơ đồ vị trí bám của mồi để thu nhận đoạn DNA
(~0.8kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã
gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi
DH3F-DH4R (ảnh minh họa)
39
3.2 Sơ đồ qui trình nghiên cứu lưu giữ và phân tích
vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt
41
4.1 Kết quả điện di RNA tổng số được chiết tách từ
mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1%
52
4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của
mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1%
53
4.3 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên đĩa thạch
(LB-agar 1,5%) có chứa kháng sinh kanamycin và
X-gal, bao gồm các khuẩn lạc xanh và trắng cần chọn lọc
55
4.4 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm
gan vịt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%,
các sản phẩm DNA plasmid được kiểm tra bằng cách
cắt với enzym EcoRI.
56
Trang 74.5 Giản đồ giải trình trình tự (chromatogram) thành
phần nucleotit của vùng gen VP1 virus viêm gan vịt
của chủng VxXT Các nucleotit tiếp nhận thuốc nhuộm
huỳnh quang (fluorescent dye), khi đọc bằng tia laze
cho hiển thị Adenine có màu xanh lá cây (green),
Thymine có màu đỏ (red), Guanine có màu đen (black)
và Cytosine có màu xanh nước biển (blue)
57
4.6 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của
chủng virus viêm gan vịt VxAC nghiên cứu
58
4.7 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của
chủng virus viêm gan vịt VxXT nghiên cứu
58
4.8 So sánh trình tự nucleotit gen VP1 của 2 chủng
virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và
VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế
giới
64
4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2
chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và
VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế
giới
65
4.10 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng
nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác
trên thế giới dựa trên phân tích thành phần nucleotit
Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT
trên cây phả hệ
71
4.11 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng
nghiên cứu (VxAc và VxXT) với một số chủng khác
trên thế giới dựa trên phân tích thành phần amino acid
Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT
trên cây phả hệ
72
Trang 81 MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi, ngành chăn nuôi vịt đang dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan trọng, góp phần vào chương trình xoá đói giảm nghèo cho nông dân Hàng năm, nước ta tiến hành nhập nội hàng loạt các giống vịt cao sản và được nhân ra trên diện rộng, các giống này tuy có ưu điểm cho năng suất cao nhưng sức đề kháng kém hơn rất nhiều so với giống vịt nội địa
Trong các bệnh diễn ra trên vịt, bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm hết sức nguy hiểm Bệnh xảy ra cấp tính ở vịt con từ 1 - 6 tuần tuổi, lây lan nhanh, mạnh, tỷ lệ chết cao, có khi lên tới 100%, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi [2]
Hệ gen của virus gây bệnh viêm gan ở vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi đơn dương, có độ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotit, chứa duy nhất một khung đọc mở đơn, gồm 3 tổ hợp gen P1, P2 và P3 Tổ hợp gen P1 mã hoá cho các loại protein cấu trúc VP0, VP1 và VP3 Tổ hợp gen P2 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm protein 2A, 2B và 2C Cuối cùng, tổ hợp gen P3 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm 4 loại protein là 3A, 3B, 3C và 3D Trong đó, đặc biệt quan trọng là protein cấu trúc VP1, được mã hoá bởi đoạn gen có độ dài
714 nucleotit Đây là gen kháng nguyên, vừa quyết định tính kháng nguyên vừa quyết định tính gây bệnh của virus Đối với các chủng virus vacxin, việc xác định được mức độ tương đồng với các chủng cường độc viêm gan vịt đang lưu hành có
ý nghĩa thực tiễn rất lớn Vì vậy, việc so sánh vùng gen VP1 trong giám định sinh phân tử không những có mục đích chẩn đoán mà còn giúp tìm hiểu tương đồng kháng nguyên, phân biệt được mức độ độc lực, cũng như xác định mức độ đồng nhất về tính kháng nguyên của virus
Mặt khác, các nghiên cứu gần đây về hệ gen và sinh học phân tử phân loại virus đều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc về một nhóm mới trong họ Picornaviridae; hơn nữa, đã có biến đổi để tạo nên những genotype và serotype
Trang 9khác biệt [22], [36], [37], [61], [62], [60] Đồng thời, các nghiên cứu này cũng
xác định virus viêm gan vịt không còn thuộc chi Enterovirus hoặc ít nhất đã có
những biến chủng, khiến cho virus không còn có những đặc tính vốn có trước đây như virus viêm gan vịt cổ điển [22], [61] Tại Việt Nam, rất có thể virus viêm gan vịt cũng bị biến đổi tạo nên genotype, serotype thuộc nhóm mới như các nghiên cứu nước ngoài đã xác định Tuy có rất nhiều nghiên cứu về dịch tễ học và có rất nhiều chủng virus viêm gan vịt được phân lập nhưng chưa có nghiên cứu sâu sắc nào về đặc tính sinh học phân tử, định hướng dịch tễ học phân tử trong phòng chống bệnh này Xuất phát từ nhu cầu cần có dữ liệu sinh học phân tử gen và hệ gen cũng như xác định vị trí phân loại của virus viêm gan vịt có mặt tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan
vịt ở Việt Nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới”
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Với tên đề tài nghiên cứu, mục tiêu của chúng tôi là:
- Giải trình trình tự vùng gen VP1 của các chủng virus vacxin hiện có mặt tại Việt Nam
- So sánh vùng gen VP1 của chủng virus vacxin thu được với một số chủng virus vacxin và cường độc khác trên thế giới để có thể xác định được mức độ tương đồng giữa các chủng so sánh
- Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các chủng virus vacxin này với các chủng virus viêm gan vịt của thế giới được thu nhận để so sánh
1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
- Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử về chủng virus vacxin viêm gan vịt ở Việt Nam
- Tạo cơ sở xác định tính tương đồng về gen và axit amin giữa các chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng virus khác của thế giới để từ đó giúp ích cho việc nghiên cứu vacxin phòng bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam.
Trang 10Đề cương bạn đang xem tại Thuvienluanvan.com được trích dẫn từ bản nội dung đầy đủ.
Trường hợp có nhu cầu tham khảo toàn bộ nội dung, độc giả có thể đặt mua tài liệu này từ thư viện.
Vui lòng truy cập tại đây để xem hướng dẫn: http://thuvienluanvan.com