Xác định đặc tính sinh học phân tử gen VP1 của các chủng virus vacxin viêm gan vịt ở việt nam và so sánh với một số chủng khác của thế giới

Cùng với sự phát triển chung của ngành chăn nuôi, ngành chăn nuôi vịt ñang dần trở thành ngành sản xuất hàng hoá quan trọng, góp phần vào chương trình xoá ñói giảm nghèo cho nông dân. Hàng năm, nước ta tiến hành nhập nội hàng loạt các giống vịt cao sản và ñược nhân ra trên diện rộng, các giống này tuy có ưu ñiểm cho năng suất cao nhưng sức ñề kháng kém hơn rất nhiều so với giống vịt nội ñịa. Trong các bệnh diễn ra trên vịt, bệnh viêm gan vịt do virus là một bệnh truyền nhiễm hết sức nguy hiểm. Bệnh xảy ra cấp tính ở vịt con từ 1 - 6 tuần tuổi, lây lan nhanh, mạnh, tỷ lệ chết cao, có khi lên tới 100%, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi [2]. Hệ gen của virus gây bệnh viêm gan ở vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương, có ñộ dài khoảng 7.600 – 7.700 nucleotit, chứa duy nhất một khung ñọc mở ñơn, gồm 3 tổ hợp gen P1, P2 và P3. Tổ hợp gen P1 mã hoá cho các loại protein cấu trúc VP0, VP1 và VP3. Tổ hợp gen P2 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm protein 2A, 2B và 2C. Cuối cùng, tổ hợp gen P3 mã hoá cho các loại protein phi cấu trúc, gồm 4 loại protein là 3A, 3B, 3C và 3D. Trong ñó, ñặc biệt quan trọng là protein cấu trúc VP1, ñược mã hoá bởi ñoạn gen có ñộ dài 714 nucleotit. ðây là gen kháng nguyên, vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên vừa quyết ñịnh tính gây bệnh của virus. ðối với các chủng virus vacxin, việc xác ñịnh ñược mức ñộ tương ñồng với các chủng cường ñộc viêm gan vịt ñang lưu hành có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Vì vậy, việc so sánh vùng gen VP1 trong giám ñịnh sinh phân tử không những có mục ñích chẩn ñoán mà còn giúp tìm hiểu tương ñồng kháng nguyên, phân biệt ñược mức ñộ ñộc lực, cũng như xác ñịnh mức ñộ ñồng nhất về tính kháng nguyên của virus.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI --------------        -------------- NGUYỄN LUẬN XÁC ðỊNH ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ GEN VP1 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS VACXIN VIÊM GAN VỊT Ở VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG KHÁC CỦA THẾ GIỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THANH HÒA HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008 Tác giả luận văn Nguyễn Luận Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii Lời Cảm Ơn Sau thời gian học tập và nghiên cứu, ñến nay tôi ñã hoàn thành khoá học. Nhân dịp này, tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến PGS.TS. Lê Thanh Hòa - Trưởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), người thầy ñã tận tình hướng dẫn trực tiếp và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi ñược học tập, thực hành thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S ðoàn Thị Thanh Hương, Th.S Nguyễn Thị Bích Nga cùng toàn thể cán bộ Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn ñến sâu sắc tới toàn thể các thầy giáo - cô giáo trong Nhà trường, khoa Sau ñại học, Khoa Chăn nuôi - Thú y, ñặc biệt là các thầy giáo - cô giáo ở Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành ñề tài. Xin chân thành cảm ơn Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ñã hỗ trợ kinh phí cho ñề tài nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn các cơ quan, những người thân, gia ñình và bạn bè ñã ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2008 Nguyễn Luận Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Trang Lời cam ñoan 1 Lời cảm ơn 2 Mục lục . 3 Danh mục các chữ viết tắt . 6 Danh mục bảng . 7 Danh mục hình 8 1. MỞ ðẦU 10 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài…………………………………………………… 10 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài…………………………………………… .11 1.3 Ý nghĩa khoa học của ñề tài…………………………………………………11 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 12 2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt (Duck Hepatitis)……………………………… .12 2.1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh……………………………………… 12 2.1.2 Loài mắc bệnh………………………………………………………… 13 2.1.3 ðường xâm nhập và cách lây lan……………………………………….13 2.1.4 Cơ chế gây bệnh của virus…………………………………………… .14 2.1.5 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích…………………………………… 14 2.1.6 Chẩn ñoán bệnh viêm gan vịt do virus………………………………….16 2.1.7 Phòng chống bệnh………………………………………………………17 2.2 Một số ñặc tính sinh học của virus viêm gan vịt type I…………………… 18 2.2.1 ðặc tính nuôi cấy virus…………………………………………………18 2.2.2 Sức ñề kháng của DHV-1………………………………………………20 2.2.3 ðặc tính kháng nguyên của virus DHV-1………………………………20 2.2.4 Biến dị của virus ……………………………………………………… 21 2.3 Sinh học phân tử và sơ ñồ phả hệ virus viêm gan vịt type I ……………… 21 2.3.1 Sơ lược về Picornavirus ……………… ………………………………21 2.3.2 Sơ lược về hình thái và cấu tạo virus viêm gan vịt type I………………23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 2.3.3 Sơ lược về phả hệ virus DHV-1……… .………………………………25 2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt ……………………….……………… 29 2.4.1 Miễn dịch thụ ñộng …………………….………………………………29 2.4.2 Miễn dịch chủ ñộng ……………………….……………………………30 2.5 Các kĩ thuật sinh học phân tử …………………………………………… .31 2.5.1 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) .…………………………31 2.5.2 Phản ứng RT-PCR .……………………….……………………………32 2.5.3 Kĩ thuật ñiện di… . ……………………….……………………………32 2.5.4 Nguyên lí tách dòng và lưu giữ nguồn gen……………… ……………33 2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu ñặc tính phân tử gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt ñược sử dụng ở Việt Nam ……………………………….…………….……………………………34 2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trong và ngoài nước .…………35 3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 38 3.1 Nội dung nghiên cứu……………………………………… ……………… 38 3.2 Nguyên liệu… …………………………………………………………… 38 3.2.1 Giống virus và chuỗi gen VP1….………….………………………… .38 3.2.2 Cặp mồi ………… ……………………….……………………………39 3.2.3 Các trang thiết bị phòng thí nghiệm……….……………………………39 3.3 Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt…… 41 3.4 ðịa ñiểm thực hiện ñề tài ………………………………… ……………… 42 3.5 Phương pháp nghiên cứu ………………………………… ……………… 42 3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số …….……………………………42 3.5.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR một bước.…………………43 3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR …………… ……………………………44 3.5.4 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR… ………….……………………………45 3.5.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen …………………………45 3.5.6 Thực hiện phản ứng giải trình trình tự…….……………………………49 3.5.7 Tinh sạch sản phẩm giải trình trình tự .….……………………………50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.5.8 Xử lý số liệu……………………………….……………………………51 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 52 4.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số………………………… ……………… 52 4.2 Kết quả phản ứng RT-PCR ……………………………… ……………… 53 4.3 Kết quả dòng hóa và tách dòng sản phẩm………………… ……………… 54 4.3.1 Kết quả dòng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli .………………54 4.3.2 Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp ……………………………56 4.4 Kết quả giải trình trình tự nucleotit và axit amin của gen kháng nguyên VP1 ở 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt…………………………… ……………….57 4.5 Kết quả truy cập ngân hàng gen, so sánh chuỗi gen kháng nguyên VP1 của 2 chủng virus vacxin nghiên cứu với một số chủng khác trên thế giới… ……… 59 4.6 So sánh thành phần nucleotit và axit amin của gen VP1 giữa hai chủng virus vacxin ở Việt Nam và một số chủng trên thế giới…………… ……………… 62 4.6.1 Các chủng tham gia trong phân tích so sánh …………………………62 4.6.2 Kết quả ñối chiếu so sánh thành phần nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của VxAC và VxXT với các chủng khác trên thế giới …………………63 4.7 Tỷ lệ tương ñồng nucleotit và axit amin giữa các chủng nghiên cứu …… 69 4.8 Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng virus nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác……………………. ……………… 71 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 74 5.1 Kết luận …………………………………………………………………… 74 5.2 Kiến nghị………………………………………………… .……………… 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 75 PHỤ LỤC . 81 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi CÁC CHỮ VIẾT TẮT DPV : Duck Picornavirus DHV : Duck Hepatitis Virus VxXT : Vacxin do Xí nghiệp thuốc thú y trung ương sản xuất VxAC : Vacxin có nguồn gốc ñưa về từ Ai Cập DNA : Axit Deoxyribonucleic RNA : Axit Ribonucleic VP : Viral Protein VPg : Viral Protein genome-linked PCR : Polymerase Chain Reaction RT- PCR : Revese Transcription - Polymerase Chain Reaction EDTA : Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP : Dideoxy Nucleotide Triphosphate X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase TAE : Tris Acetic acid EDTA LB : Luria Bertani-agar UTR : Untranslated Region BLAST : Basic Local Alignment Search Tool cs : cộng sự tr : trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 3.1 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 39 4.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen VP1 của chủng virus vacxin Ai Cập (VxAC) 60 4.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế sử dụng chuỗi gen VP1 của chủng virus vacxin xưởng thuốc (VxXT) 61 4.3 Các chủng virus viêm gan vịt sử dụng so sánh 62 4.4 So sánh tỷ lệ (%) tương ñồng về nucleotit (trên ñường chéo) và axit amin (dưới ñường chéo) của hai chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng trên thế giới thuộc DHV-1. 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH Số hình Tên hình Trang 2.1 Tư thế chết ñiển hình ở trạng thái opistotonus của vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt (ảnh minh họa). 15 2.2 Gan vịt xuất huyết (ảnh minh họa). 15 2.3 Mô tả virus viêm gan vịt type I 22 2.4 Mô tả hệ gen và chuỗi polypeptit của virus viêm gan vịt 22 2.5 Cây phả hệ thể hiện liên quan của DHV-1 với 24 loại virus thuộc 11 chi trong họ Picornaviridae. Mối quan hệ ñược xây dựng dựa trên khoảng cách của cây phả hệ nhờ xem xét sự giống nhau về axit amin của phức hệ protein [60]. Vị trí của nhóm virus viêm gan vịt (DHV 1) ñược chỉ dẫn bằng mũi tên 28 2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO 33 3.1 Sơ ñồ vị trí bám của mồi ñể thu nhận ñoạn DNA (~0.8kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh họa). 39 3.2 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu lưu giữ và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt 41 4.1 Kết quả ñiện di RNA tổng số ñược chiết tách từ mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1% 52 4.2 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của mẫu VxXT và VxAC trên thạch agarose 1% 53 4.3 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên ñĩa thạch (LB-agar 1,5%) có chứa kháng sinh kanamycin và X-gal, bao gồm các khuẩn lạc xanh và trắng cần chọn lọc. 55 4.4 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt ñược ñiện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, các sản phẩm DNA 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix plasmid ñược kiểm tra bằng cách cắt với enzym EcoRI. 4.5 Giản ñồ giải trình trình tự (chromatogram) thành phần nucleotit của vùng gen VP1 virus viêm gan vịt của chủng VxXT. Các nucleotit tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi ñọc bằng tia laze cho hiển thị Adenine có màu xanh lá cây (green), Thymine có màu ñỏ (red), Guanine có màu ñen (black) và Cytosine có màu xanh nước biển (blue). 57 4.6 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus viêm gan vịt VxAC nghiên cứu 58 4.7 Trình tự nucleotit và axit amin vùng gen VP1 của chủng virus viêm gan vịt VxXT nghiên cứu 58 4.8 So sánh trình tự nucleotit gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới 64 4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên cứu (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới 65 4.10 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAC và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần nucleotit. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ 71 4.11 Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa hai chủng nghiên cứu (VxAc và VxXT) với một số chủng khác trên thế giới dựa trên phân tích thành phần amino acid. Mũi tên chỉ dẫn vị trí của chủng VxAC và chủng VxXT trên cây phả hệ 72 . vùng gen VP1 của các chủng virus vacxin hiện có mặt tại Việt Nam. - So sánh vùng gen VP1 của chủng virus vacxin thu ñược với một số chủng virus vacxin và. (VxAC và VxXT) với các chủng virus viêm gan vịt khác trên thế giới 64 4.9 So sánh trình tự axit amin vùng gen VP1 của 2 chủng virus vacxin viêm gan vịt nghiên