Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vị t

3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

3.3 Qui trình thu nhận và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vị t

VIÊM GAN VỊT

Việc nghiên cứu, lưu giữ và phân tích ñặc tính sinh học phân tử vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt bao gồm các công ñoạn ñược biểu diễn theo sơ ñồ ở hình 3.2.

Hình 3.2 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu lưu giữ và phân tích vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………33

3.4 ðỊA ðIỂM THỰC HIỆN ðỀ TÀI

ðề tài của chúng tôi ñược thực hiện tại phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 3.5.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số là toàn bộ RNA ñược tách chiết từ mẫu nghiên cứu. Muốn thu RNA thì cần phải loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng ñến hiệu quả RT-PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt ñộng (RNA thông tin, RNA vận chuyển) của tế bào và của virus. Mục ñích là thu nhận ñược RNA của hệ gen virus viêm gan vịt ñạt hàm lượng cao, ñảm bảo ñủ làm khuôn cho RT-PCR. Tuy nhiên, vì sử dụng cặp mồi ñặc hiệu cho virus khi thu nhận RNA tổng số làm khuôn nên dù lẫn các loại RNA khác thì vẫn thu ñược sản phẩm từ hệ gen virus.

Chúng tôi chiết tách RNA virus bằng bộ kít “QIAamp viral kit” và sử dụng hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.

Tách virus viêm gan vịt ra khỏi vacxin bằng cách cho vào lọ vacxin 1,0 ml nước muối sinh lý 0,9 %, lắc ñều cho tan hết rồi chia ñều dịch vào 2 ống Eppendorf. Sau ñó ly tâm 4.000vòng/phút, trong 10 phút. Sau ly tâm, thu dịch trên vào 2 ống Eppendorf mới sau ñó tiến hành tách chiết RNA. Qui trình thực hiện theo các bước:

- Bước 1: Hút 560 µl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5 ml. - Bước 2: Thêm 140 µl dung dịch mẫu ñã xử lý vào Eppendorf trên, sau ñó lắc ñều nhanh trong 15 giây rồi ñểở nhiệt ñộ phòng trong 10 phút.

- Bước 3: Thêm 560 µl dung dịch Ethanol (96 - 100^oC), lắc ñều nhanh trong 15 giây.

- Bước 4: Chuyển 630 µl huyễn dịch trên sang cột QIAampspin. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nước dưới.

- Bước 5: Lặp lại bước 4.

- Bước 6: Thêm 500 µl dung dịch AW1, li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………34

- Bước 7: Thêm 500 µl dung dịch AW2, li tâm 13000 vòng/phút, trong 3 phút, giữ cột, bỏ nước dưới. Sau ñó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000vòng/phút, trong 1 phút.

- Bước 9: Chuyển cột sang một ống Eppendorf sạch mới. Thêm 60 µl dung dịch AVE, ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 1 phút. Sau ñó li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.

Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20^oC.

3.5.2 Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR một bước

Phản ứng RT-PCR ñược tiến hành qua hai giai ñoạn, bao gồm giai ñoạn RT (Reverse Transcription; chuyển ñổi RNA thành DNA) và giai ñoạn PCR (nhân ñoạn gen mong muốn bằng phản ứng PCR). Chúng tôi sử dụng bộ Kit RT - PCR một bước (one-step RT-PCR Kit) của hãng QIAGEN. Trong phản ứng này, tất cả thành phần cần thiết cho hai giai ñoạn phản ứng ñược cho vào cùng một lúc và cài ñặt chương trình sao cho sau khi kết thúc giai ñoạn RT thì máy tự ñộng chuyển sang giai ñoạn PCR cho kết quả cuối cùng.

Thành phần của phản ứng RT-PCR một bước bao gồm: Thành phần phản ứng Thể tích

- QIA one step RT-PCR 5x 5 µl

- dNTP mix (10mM) 1 µl - Mồi 1 (10pM/µl) 2 µl - Mồi 2 (10pM/µl) 2 µl - Enzym mix 1 µl - Mẫu 8 µl - Nước tinh sạch _{6 µl} Tổng thể tích 25 µl

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………35 500C - 30 phút 35 chu kì 720C - 1 phút 30 giây 720C - 8 phút 950C - 15 phút 40C/ON 940C - 15 giây 500C - 30 giây * Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR:

3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR

Chuẩn bị thạch agarose 1%: Cân 1gram thạch agarose nguyên chất cho vào lọ thuỷ tinh chịu nhiệt. Cho thêm 100 ml dung dịch ñệm TAE 1 lần (1X TAE). ðun hỗn hợp dung dịch trên trong lò vi sóng sao cho thạch agarose tan chảy hết. Sau ñó, ñể nguội ñến khoảng 60^oC rồi rót khoảng 25 - 30 ml sang một cốc thuỷ tinh chịu nhiệt, bổ sung 4 µl dung dịch Ethidium bromide (10mg/ml), lắc ñều rồi ñổ vào khay có cài sẵn lược, ñổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm. ðể khoảng 60 - 90 phút cho thạch ñông, sau ñó rút răng lược, các răng lược sẽ tạo thành các lỗ giếng.

Sau khi chuẩn bị xong, tiến hành dìm ngập khay thạch trong buồng ñiện di chứa dung dịch ñệm TAE1X (ñệm TAE cung cấp ion cho ñiện trường hoạt ñộng).

Tra mẫu: Lấy 5 - 10 µl sản phẩm RT-PCR. Trộn từng mẫu với 2 µl Loading Dye và lần lượt tra vào các giếng riêng biệt .

Tra chỉ thị phân tử: Tra 5 - 10 µl chỉ thị phân tử vào một giếng (chỉ thị phân tử (DNA Marker) ñược dùng là DNA của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzym giới hạn HindIII (λHindIII).

Chạy ñiện di kiểm tra ở hiệu ñiện thế 120V, cường ñộ 400mA với thời gian 30 phút. Do mang ñiện tích âm, DNA của sản phẩm RT-PCR sẽ dịch chuyển từ cực âm ñến cực dương.

Phát hiện sản phẩm RT-PCR: Kết thúc ñiện di, lấy bản thạch ra khỏi buồng ñiện di và rửa bản thạch bằng nước, sau ñó soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu kiểm tra. Nếu xuất hiện ñoạn DNA quan tâm thì tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36

3.5.4 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Sau phản ứng RT-PCR, một lượng lớn phân tử DNA của vùng cần nghiên cứu ñã ñược nhân lên. Nhiều trường hợp có thể sử dụng DNA chưa tinh sạch ñể dòng hóa, nhưng thông thường cần tinh sạch (purification) sản phẩm RT-PCR. Sản phẩm tinh sạch có thể ñược dùng ñể giải trình trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao hơn. Chúng tôi tinh sạch sản phẩm RT- PCR sử dụng bộ hóa chất của hãng Bioneer (AccuPrep^® PCR Purification Kit), tiến hành theo hướng dẫn như sau:

- Bước 1: Cho dung môi PB vào sản phẩm của PCR với tỷ lệ 5:1 (lấy 75 µl buffer PB cho vào 0,015 mg sản phẩm RT-PCR) sang một ống Eppendorf sạch, sau ñó cho tất cả sản phẩm RT-PCR sang rồi trộn ñều.

- Bước 2: Chuyển toàn bộ dung dịch sang cột lọc và li tâm 13000 vòng/phút, trong 1 phút. Rồi bỏ nước giữ cột.

- Bước 3: Thêm 500 µl WB lên cột. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước dưới giữ cột. Sau ñó li tâm thêm một lần nữa 13000 vòng/phút, trong 1 phút.

- Bước 4: Chuyển cột sang một ống Eppedorf loại 1,5 ml sạch, thêm 30 µl dung dịch EL, ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 2 phút. Sau ñó li tâm 11000vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lấy nước dưới. Dịch bên dưới chính là sản phẩm RT-PCR ñã ñược tinh sạch.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -20^oC.

3.5.5 Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen

3.5.5.1 Kĩ thuật gắn sản phẩm RT-PCR và tạo vector tái tổ hợp

Sản phẩm RT-PCR tinh sạch (vùng gen VP1) ñược ñưa vào một vector dẫn truyền - plasmid mang DNA (thường dùng vector pCR 2.1-TOPO) ñể nhân ñoạn gen thành lượng lớn bản sao DNA plasmid (DNA tái tổ hợp). Các DNA plasmid này ñược dùng ñể giải trình trình tự và lưu giữ nguồn gen.

Dưới xúc tác của enzym Taq-polymerase, sản phẩm phản ứng RT-PCR sẽñược gắn thêm nucleotit Adenin (A) ởñầu 3’. Vector pCR 2.1-TOPO ñược thiết kế có ñầu lồi Thymin (T). Do vậy, khi nối ñoạn DNA (sản phẩm của RT-PCR) với vector pCR

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………37

2.1-TOPO thì ñầu lồi A của sản phẩm sẽ ñược gắn vào ñầu lồi T của vector theo nguyên tắc bổ sung ñể tạo nên vector tái tổ hợp mang ñoạn DNA ngoại lai.

Sản phẩm của phản ứng RT-PCR (gen VP1) ñược kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu có các sản phẩm có ñộ dài như dự kiến sẽ ñược gắn vào vector pCR^®2.1- TOPO^® của bộ kit TOPO-TA cloning (Invitrogen). Phản ứng ñược tiến hành như sau:

Thành phần phản ứng Thể tích - Nước tinh sạch 2,5 µl - Vector pCR 2.1-TOPO 0,5 µl - Sản phẩm RT-PCR 2 µl - Muối 1 µl Tổng thể tích 6 µl

ðể hỗn hợp trên ở nhiệt ñộ phòng trong 5 phút. Bảo quản mẫu ở -20oC.

3.5.5.2 Chuyển nạp vào tế bào khả biến E. coli

Sau khi sản phẩm RT-PCR ñược gắn vào plasmid pCR^®2.1-TOPO^®, plasmid tái tổ hợp ñược chuyển nạp (transformation) vào tế bào khả biến thích ứng DH5α- T1 của hãng Invitrogen. Qui trình chuyển nạp vắn tắt như sau:

Bước 1: Lấy 3 µl hỗn hợp nối plasmid tái tổ hợp ñem trộn với 100 µl tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (10⁸ - 10⁹ tế bào/ml), ủ trong ñá lạnh 45 phút, ñể cho plasmid xuyên màng và chuyển nạp vào tế bào.

Bước 2: Hỗn hợp ñược xử lý sốc nhiệt (heat-shock) ở 42^oC trong 45 giây, rồi ngay lập tức chuyển qua ủñá trong 2 phút.

Bước 3: Bổ sung 200 µl môi trường dinh dưỡng SOC, lắc các ống tế bào với tốc ñộ 200 vòng/phút trong 1 giờở 37oC ñể các tế bào ổn ñịnh và nhân lên trong vài chu kì ñầu.

Bước 4: Sau khi ủ xong, lấy khoảng 200 µl dung dịch ñã ñược chuyển nạp trải ñều trên ñĩa thạch LB-agar 1,5% (Luria-Bertani agar) có bổ sung 100 µl kháng sinh Kanamycin (40mg/ml) và 200 µl X-gal (40mg/ml).

Bước 5: Các ñĩa Petri chứa thạch LB ñược ñặt trong tủ ấm 37^oC/18 - 20 giờ, sau ñó ñểở 4^oC/2 - 3 giờ cho việc phân biệt màu ñược rõ ràng.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………38

3.5.5.3 Chọn lọc và nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp

Sau 18 - 20 giờ, các ñĩa thạch sẽñược lấy ra ñể chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: chọn lọc theo phương pháp kháng kháng sinh (Kanamycin hoặc Ampicilin) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp ñược bất kỳ vector nào và các loại vi khuẩn nhiễm tạp khác; và chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X-Gal), nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vector tái tổ hợp. Vi khuẩn tái tổ hợp chứa vector pCR^®2.1-TOPO^® có gen sản xuất enzym kháng lại kháng sinh (ví dụ: kanamycin) và gen lacZ ñã bị sản phẩm RT-PCR chèn vào nên không còn gen hoàn chỉnh ñể sản xuất enzym β-galactosidase. Do vậy, khuẩn lạc trắng ñược chọn lọc ñể nuôi cấy.

Nuôi cấy các khuẩn lạc trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin hoặc Ampicillin, thường chọn 3 - 6 khuẩn lạc của mỗi ñĩa thạch. Các ống nuôi cấy ñược lắc ñiều nhiệt với tốc ñộ 200 vòng/phút ở 37^oC trong 18 - 20 giờ ñể cho các tế bào sinh trưởng và nhân lên tạo nhiều bản sao mang vector tái tổ hợp

3.5.5.4 Phương pháp tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp

Bộ hóa chất ñược chúng tôi sử dụng ñể tách chiết plasmid tái tổ hợp là bộ kit của hãng Bioneer (AccuPrep^® Plasmid Mini Extraction Kit). Thực hiện tách chiết DNA plasmid nhờ các dung dịch có khả năng li giải màng tế bào vi khuẩn, loại bỏ DNA hệ gen vi khuẩn khỏi DNA plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ Kit. Sau ñó, chuyển dung dịch chứa DNA plasmid sang cột lọc có cấu tạo màng lọc tích ñiện dương (+), chỉ giữ lại DNA plasmid tích ñiện âm (-) và qua nhiều lần li tâm. Quá trình ñược thực hiện theo các bước sau:

- Bước 1: Lắc ñều lọ nuôi cấy, ñổ vào ống Eppendorf sạch loại 2 ml sạch, li tâm 8.000 vòng/phút trong 2 phút. Lặp lại bước này một lần nữa. Dùng pipet hút bỏ nước trong và giữ lại căn tế bào.

- Bước 2: Thêm 250 µl buffer 1111, khuấy nhẹ nhàng cho tan cặn tế bào.

- Bước 3: Thêm 250 µl buffer 2222 vào hỗn dịch ñể ly giải tế bào (tức là phá màng tế bào), ñảo nhẹ và nhanh, ñậy nắp, lắc xuôi ngược toàn bộ ống vài lần, ñể

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………39

5’...GAATTC...3’ 3’...CTTAAG...5’

toàn bộ hỗn dịch trong ống ở nhiệt ñộ phòng trong 4 phút (không ñược quá 5 phút - vì lâu hơn thì dung môi sẽ phá tiếp màng nhân).

- Bước 4: Thêm 350 µl buffer , lắc nhanh sau ñó li tâm lạnh 13000vòng/phút trong 10 phút. Hút toàn bộ nước trong chuyển qua cột. Li tâm 13000vòng/phút trong 1 phút, bỏ nước dưới, giữ cột.

- Bước 5: Thêm 500 µl buffer D (tác dụng rửa màng lọc có DNA của plasmid tái tổ hợp), ñể nhiệt ñộ phòng 5 phút (không ñược ñể quá 5 phút). Li tâm 13000vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước dưới, giữ cột.

- Bước 6: Thêm 700 µl buffer . Li tâm 13000vòng/phút trong 1 phút (lặp lại hai lần), giữ cột bỏ nước dưới, rồi chuyển cột sang ống Eppedorf 1,5 ml sạch.

- Bước 7: Thêm 50 µl buffer , ñể ở nhiệt ñộ phòng 2 phút. Li tâm 13000vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột giữ nước dưới - là dung dịch chứa DNA plasmid.

Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -20^oC.

3.5.5.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI

Plasmid pCR 2.1-TOPO của hãng Invitrogen có ñộ dài là 3,9 kb. Tại hai ñầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai ñược bố trí ñiểm cắt của enzym giới hạn EcoRI.

Vị trí cắt của enzym EcoRI:

Khi cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI thì sẽ có 2 ñoạn DNA: một ñoạn có kích thước là 3,9 kb của vector pCR 2.1-TOPO và một ñoạn có kích thước tương ñương với ñoạn DNA sản phẩm của phản ứng RT-PCR gài vào vùng nhân dòng của vector (với ñiều kiện trong chuỗi DNA của PCR không có ñiểm cắt khác của

EcoRI). Nếu trong ñó có một hay vài ñiểm cắt EcoRI thì ñộ dài của PCR khi ñược kiểm tra sẽ bằng ñộ dài tổng số của các băng DNA.

Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn EcoRI ñược ủ ở 37oC trong 2 giờ. Sau ñó ñiện di trên thạch agarose 1% ñể kiểm tra ñoạn DNA ngoại lai. Kết quả ñược chụp ảnh ñể xem xét và lưu trữ. Nếu ñiện di cho kết quả tương ứng với ñộ dài của sản

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………40

phẩm RT-PCR thì DNA vector tái tổ hợp sẽ ñược thu nhận và tiến hành giải trình trình tự.

Thành phần của phản ứng cắt DNA tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI bao gồm những thành phần như:

Thành phần phản ứng Thể tích - Nước tinh sạch 16 µl - ðệm cho enzym EcoRI 2 µl

- Enzym EcoRI 1,5 µl