3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
3.5.6Thực hiện phản ứng giải trình trình tự
Giải trình trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotit của một phân ñoạn DNA cần nghiên cứu. Phương pháp này sử dụng mồi ñơn và sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTP) kết hợp ba bước của một phản ứng, bao gồm: bung liên kết, bám mồi và tổng hợp sợi ñơn nucleotit. Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận ñược bao giờ cũng ñược xác ñịnh theo chiều 5’3’.
Giải trình trình tự DNA plasmid tái tổ hợp ñược tiến hành với mồi ñơn (mồi xuôi hoặc với mồi ngược), là các chuỗi oligonucleotide bám vào thành phần vector ởñầu DNA ngoại lai ñể thu ñược chuỗi thô nucleotit của DNA plasmid. Trước khi ñối chiếu so sánh, các chuỗi thô ñược xử lý bằng chương trình máy tính ñể thu ñược chuỗi có trình tự tốt hơn. Mồi dùng ñể giải trình trình tự DNA plasmid là:
Mồi xuôi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’ Thành phần của phản ứng giải trình trình tự bao gồm:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………41 96oC – 5 phút 30 chu kì 4oC 96oC – 30 giây 50oC – 5 giây 60oC – 4 phút Thành phần phản ứng Thể tích - Big dye 1 µl - Mồi 3,2 µl - Mẫu nghiên cứu 3 µl - Nước tinh sạch 2,8 µl - Thành phần kích hoạt 10 µl Tổng thể tích 20 µl
Các thành phần này ñược cho cùng vào một ống Eppendorf 0,5ml, sau ñó tiến hành phản ứng giải trình trình tự với chu trình nhiệt:
Khi kết thúc, nhiệt ñộ ñược giảm xuống 4oC và sản phẩm ñược bảo quản ở nhiệt ñộ này cho tới khi làm sạch.