3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
3.5.3 Phát hiện sản phẩm RT-PCR
Chuẩn bị thạch agarose 1%: Cân 1gram thạch agarose nguyên chất cho vào lọ thuỷ tinh chịu nhiệt. Cho thêm 100 ml dung dịch ñệm TAE 1 lần (1X TAE). ðun hỗn hợp dung dịch trên trong lò vi sóng sao cho thạch agarose tan chảy hết. Sau ñó, ñể nguội ñến khoảng 60oC rồi rót khoảng 25 - 30 ml sang một cốc thuỷ tinh chịu nhiệt, bổ sung 4 µl dung dịch Ethidium bromide (10mg/ml), lắc ñều rồi ñổ vào khay có cài sẵn lược, ñổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm. ðể khoảng 60 - 90 phút cho thạch ñông, sau ñó rút răng lược, các răng lược sẽ tạo thành các lỗ giếng.
Sau khi chuẩn bị xong, tiến hành dìm ngập khay thạch trong buồng ñiện di chứa dung dịch ñệm TAE1X (ñệm TAE cung cấp ion cho ñiện trường hoạt ñộng).
Tra mẫu: Lấy 5 - 10 µl sản phẩm RT-PCR. Trộn từng mẫu với 2 µl Loading Dye và lần lượt tra vào các giếng riêng biệt .
Tra chỉ thị phân tử: Tra 5 - 10 µl chỉ thị phân tử vào một giếng (chỉ thị phân tử (DNA Marker) ñược dùng là DNA của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzym giới hạn HindIII (λHindIII).
Chạy ñiện di kiểm tra ở hiệu ñiện thế 120V, cường ñộ 400mA với thời gian 30 phút. Do mang ñiện tích âm, DNA của sản phẩm RT-PCR sẽ dịch chuyển từ cực âm ñến cực dương.
Phát hiện sản phẩm RT-PCR: Kết thúc ñiện di, lấy bản thạch ra khỏi buồng ñiện di và rửa bản thạch bằng nước, sau ñó soi trên máy Dolphin-DOC và chụp ảnh lưu giữ mẫu kiểm tra. Nếu xuất hiện ñoạn DNA quan tâm thì tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………36