2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5 Các kĩ thuật sinh học phân tử
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt ựộ, sử dụng ựặc ựiểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym DNA-polymerase chịu nhiệt, có hai ựoạn ngắn DNA làm mồi và dùng các ựoạn DNA mạch ựơn làm khuôn ựể tổng hợp nên sợi mới bổ sung. Vì vậy, ựể khởi ựầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp ựoạn mồi oligonucleotide (có ựộ dài từ 6 - 30 nucleotit). đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại ựiểm khởi ựầu sao chép và ựược enzym DNA-polymerase ựiều khiển tổng hợp một ựoạn DNA ựặc thù. Các sợi DNA mạch ựơn làm khuôn ựược tạo ra theo cách ựơn giản là nâng nhiệt ựộ lên trên 90oC(92 - 98oC) cho mạch xoắn kép DNA bung ra.
Cả hai sợi DNA ựều ựược dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các ựoạn mồi (gọi là oligonucleotide hay primer) ựược cung cấp ựể bám vào vị trắ tương ứng cho cả hai sợi. Trong kĩ thuật PCR, các ựoạn mồi ựược chọn nằm ở hai ựầu ựoạn DNA cần nhân lên sao cho các sợi DNA tổng hợp mới ựược bắt ựầu tại mỗi ựoạn mồi và kéo dài về phắa ựoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có ựộ dài giới hạn giữa hai ựoạn mồi này. độ dài sản phẩm PCR có thể vài trăm cho ựến hàng ngàn, thậm chắ hàng chục ngàn cặp nucleotit. Như vậy, sau mỗi chu kỳ các ựiểm bám cho các ựoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới ựược tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại ựược nâng nhiệt ựộ lên thắch hợp sao cho các sợi ban ựầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau ựó còn ựược dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn ựoạn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các ựoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kì của phản ứng tắnh theo lắ thuyết sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa hai ựoạn mồi [10]. Như vậy, kết quả là một ựoạn DNA ựịnh trước ựược nhân lên với số lượng rất lớn. Vắ dụ, sau 28 chu kỳ (228) số lượng bản sao DNA của PCR sẽ là: 1.073.741.824.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ23
2.5.2 Phản ứng RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)
Kĩ thuật RT-PCR (hay còn gọi là phản ứng PCR ngược) là một phản ứng nhân một ựoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lắ của phản ứng PCR bao gồm hai giai ựoạn: giai ựoạn thứ nhất là chuyển ựổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau ựó qua giai ựoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn ựể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR.
RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ựó có Adenine, Guanine, Cytosine, Uracil. Chuỗi nucleotit này phải ựược chuyển ựổi thành DNA hai sợi, mà thành phần Uracil ựược thay thế bằng Thymine. Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờựến vai trò của enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase - RT). Do vậy, giai ựoạn này ựược gọi là giai ựoạn chuyển ngược. Khi ựã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR.
Do vậy, giai ựoạn này gọi là giai ựoạn chuyển ngược (RT-Reverse Transcription). Khi ựã có cDNA hai sợi làm khuôn, phản ứng tiếp theo là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một ựoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai ựoạn nói trên ựược gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngược. Thay ựổi nhiệt ựộựể phù hợp cho mỗi chu kỳ. Có thể sử dụng phản ứng RT-PCR một bước hoặc hai bước.
2.5.3 Kĩ thuật ựiện di
Kĩ thuật ựiện di trên thạch agarose là hết sức quan trọng ựối với người làm kĩ thuật di truyền và sinh học phân tử, ựó là cách chủ yếu làm cho các ựoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một ựặc tắnh là các phân tử axit nucleic ở pH trung tắnh chúng tắch ựiện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Khi ựặt chúng vào một ựiện trường, các phân tử axit nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch ựặc biệt khác, các phân tử axit nucleic tuỳ theo kắch thước sẽ dịch chuyển với các tốc ựộ khác nhau. Loại có phân tử lượng lớn dịch chuyển chậm, loại bé hơn sẽ dịch chuyển nhanh hơn [10].
Có hai loại thạch agarose ựược sử dụng phổ biến trong kĩ thuật ựiện di ựó là thạch agarose và thạch polyacrylamid. Thạch agarose ựược dùng ựể thực hiện ựiện
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ24
di trong máy ựiện di, gel polyacrylamid thường ựược dùng ựể phân tách các phân tử axit nucleic có kắch thước nhỏ trong các ứng dụng như xác ựịnh trình tự DNA.
điện di ựược thực hiện bằng cách ựưa các mẫu axit nucleic có trộn chỉ thị màu xanh Bromphenol vào các lỗ giếng của bản thạch và ựặt một ựiện áp vào ựó. Các axit nucleic ở trên thạch thường hiển thị khi nhuộm bằng Ethidium Bromide và ựược quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Các axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh và ghi nhận lại ựược. Kắch thước các băng DNA ựược so sánh với chỉ thị di truyền (DNA marker). DNA marker thường ựược dùng nhất là DNA của thực khuẩn thể Lamda, có chiều dài 43 kb, ựược cắt bằng enzym giới hạn
HindIII, tạo 8 phân ựoạn với các chiều dài bao gồm 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb; 0,125 kb. Nhờ chỉ thị di truyền này mà có thể xác ựịnh ựược ựộ dài của ựoạn axit nucleic cần phân tắch [10].
2.5.4 Nguyên lắ tách dòng và lưu giữ nguồn gen
Nguyên lắ của việc dòng hoá là gắn nối sản phẩm PCR hoặc RT-PCR vào vector tách dòng và chuyển nạp vào tế bào chủ tạo dòng tái tổ hợp.
Hình 2.6 Cấu trúc của vector pCR 2.1-TOPO
Theo nguyên tắc, một ựoạn DNA ngoại lai (sản phẩm của PCR hoặc RT-PCR) sẽựược cài vào trong hệ gen của một vòng DNA ựã ựược thiết kế sẵn gọi là plasmid
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ25
mang - vector dẫn truyền (thường dùng vector pCR 2.1-TOPO) tạo thành vector tái tổ hợp (hình 2.6). Sau ựó, vector tái tổ hợp này sẽ ựược chuyển nạp vào tế bào chủ thắch ứng, thông thường là tế bào E. coli, ựể nhân lên với số lượng lớn các bản sao của DNA ngoại lai. Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc tái tổ hợp theo hai cơ chế: Cơ chế X-gal, và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ các vi khuẩn không tái tổ hợp. Tách chiết các khuẩn lạc ựơn dòng ựể thu ựược lượng DNA tái tổ hợp và kiểm tra xem ựoạn DNA ngoại lai có ựược nối vào vector hay không bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn [10].
2.5.5 Tầm quan trọng của việc thu nhận, lưu giữ và nghiên cứu ựặc tắnh phân tử
gen kháng nguyên VP1 của virus vacxin viêm gan vịt ựược sử dụng ở Việt Nam
Việc lưu giữ hệ gen virus viêm gan vịt nói chung, ựặc biệt với gen kháng nguyên VP1 nói riêng, là một việc làm hết sức quan trọng vì ựây là những dữ liệu cung cấp thông tin về sự tiến hoá của virus và tương ựồng kháng nguyên - miễn dịch giữa các biến chủng của virus viêm gan vịt, kể cả cường ựộc và vacxin.
Với trình tự axit nucleic của vùng gen VP1 ựược phân lập và lưu giữ sẽ là cơ sở xác lập về dịch tễ học và xác ựịnh mối quan hệ về nguồn gốc tiến hoá và so sánh virus viêm gan vịt lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới.
Mặt khác, do virus viêm gan vịt có khả năng biến ựổi, ựặc biệt gần ựây xuất hiện nhiều biến chủng sai khác di truyền ựến mức cần phân biệt nhiều genotype khác nhau là genotype A, B, C [36], [61], [62], [63]. Các chủng thuộc các genotype khác nhau có thể phân biệt ựược bằng phương pháp PCR/RT-PCR [38]. Vacxin nhược ựộc viêm gan vịt hiện ựang ựược sử dụng tại Việt Nam là kết quảựược tạo ra của quá trình nhược ựộc hoá virus cường ựộc viêm gan vịt trên môi trường không cảm thụ. đây là các chủng vacxin nhập từ nước ngoài vào, hiện ựang ựược sản xuất tại Xắ nghiệp thuốc Thú y Trung ương và một chủng khác ựang nghiên cứu kiểm chứng. Việc tìm hiểu rõ ựặc tắnh cấu trúc sinh học phân tử của gen VP1 các chủng vacxin này là hết sức cần thiết.
Từ dữ liệu sinh học phân tử của chủng vacxin, việc so sánh sự giống và khác nhau của trình tự nucleotit và axit amin với các chủng cường ựộc của thế giới và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ26
của Việt Nam sẽ giúp chúng ta tìm hiểu ựược vùng gen kháng nguyên VP1 sâu sắc hơn, tạo ựiều kiện cho công tác phòng chống bệnh ựạt ựược hiệu quả tốt nhất.
2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC NƯỚC
Từ khi Levine và Hofstad lần ựầu tiên phát hiện ra bệnh viêm gan vịt vào năm 1945, cho ựến nay trên thế giới ựã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh. Trước ựây, các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu vềựặc ựiểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng - bệnh tắch, ựặc tắnh sinh học của virus, chế tạo vacxinẦ sao cho việc phòng chống bệnh viêm gan vịt ựạt hiệu quả cao nhất mà chưa có nghiên cứu sâu sắc vềựặc tắnh sinh học phân tử của hệ gen virus. Gần ựây, bệnh viêm gan vịt do virus ựược nhiều tác giả quan tâm, ựặc biệt là virus viêm gan vịt type I (DHV-1). Năm 2007, Tseng và Tsai ựã xác ựịnh ựược ựầy ựủ hoặc gần như ựầy ựủ hệ gen của 3 chủng virus DHV-1, gồm một chủng ựược phân lập ngoài tự nhiên ởđài Loan (là chủng 03D); một chủng vacxin nhược ựộc của Mỹ (chủng 5886) và một chủng vacxin của nước Anh (chủng H). Cho ựến nay (2008), hệ gen của hàng chục chủng virus viêm gan vịt kể cả cường ựộc cũng như vacxin ựã ựược giải mã và phân tắch. Qua phân tắch sự tiến hóa và phát sinh loài của DHV-1 thì DHV-1 ựược phân loại lại vào trong một chi mới trong họ Picornaviridae, tương tự, DHV-2 và DHV-3 ựược phân loại lại vào trong họ Astroviridae và ựược ựặt tên lại là Duck Astrovirus (chi Astrovirus) [29], [46]. Dựa vào những ựặc ựiểm riêng biệt của hệ gen như: gen VP0 không bị phân cắt; ba protein 2A không liên quan với nhau; sự tương ựồng thấp về trình tự axit amin với tất cả những Picornavirus khác và những kết quả của việc phân tắch phát sinh loài mà DHV-1 ựược xếp vào chi Picornavirus tách biệt và ựược coi là mẫu ựầu tiên của một chi mới [61]. Một sự phân tắch khác của Ding và Zhang trên chủng DHV-C80 (là một chủng vacxin thắch ứng trên phôi gà ở Trung Quốc) cũng ựề nghị nên xếp DHV-1 vào một chi riêng biệt trong họ Picornaviridae [22].
Ở nước ta, có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt và ựặc tắnh sinh học virus viêm gan vịt những vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về ựặc tắnh sinh học phân tử của virus viêm gan vịt. Bệnh viêm gan vịt ựược phát hiện lần
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ27
ựầu tiên vào năm 1978 khi mà một số giống vịt ngoại ựược nhập vào nước ta một cách ồ ạt và ựược nuôi rộng rãi trong dân. Vào thời ựiểm này, Trần Minh Châu và cs ựã ghi nhận bệnh ở đông Anh - Hà Nội [6], nhưng lúc ựó vẫn chưa phân lập ựược mầm bệnh.
Từ năm 1979 ựến năm 1983, bệnh xảy ra ở nhiều ựịa phương và làm chết rất nhiều vịt con [9]. Năm 1983, Trần Minh Châu và cs ựã phân lập ựược một chủng virus cường ựộc tại một trại nuôi vịt ở Phú Xuyên - Hà Sơn Bình (chủng TT). Khi nuôi cấy virus này trên phôi vịt 12 ngày tuổi, virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48 - 96 giờ, phôi có bệnh tắch xuất huyết. Virus này ựược giảm ựộc lực bằng cách cấy truyền qua 39 ựời trên phôi gà và tạo ựược chủng virus nhược ựộc (chủng VN) có lgELD50/0,2ml là 4 - 5 [5]. Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu ựi, không gây bệnh cho vịt con [14].
Năm 1985, các tác giả Trần Minh Châu, Lê Thị Nông, Nguyễn đức Tạo ựã xây dựng qui trình sản xuất vacxin từ 3 chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược ựộc: TN (Hungari), E32 (Pháp) và VN (Việt Nam). Cả 3 chủng virus vacxin ựều an toàn và có hiệu lực khi sử dụng. Khi miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với cường ựộc thì bảo hộựược 70 - 100% vịt con [4].
Theo Nguyễn Văn Cảm và cs (2001)[3] cho biết, từ tháng 1 ựến tháng 6 năm 2001, qua ựiều tra 12 ổ dịch ở các ựịa phương là Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang, ựã kết luận ựây là những ổ dịch do virus viêm gan vịt gây ra. Ổ dịch có tỷ lệ nhiễm trong ựàn lên ựến gần 100%, tỷ lệ chết từ 48 - 90%.
Theo Nguyễn đức Lưu và cs (2001)[13], bệnh viêm gan vịt có cơ hội xảy ra nhiều hơn trên các giống vịt, ngan cao sản nhập vào nước ta ở các ựịa phương như Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình, và các tỉnh ựồng bằng sông Cửu Long, gây tổn thất rất lớn cho các ựịa phương này.
Nguyễn đức Lưu và Vũ Như Quán (2002)[14] cho biết, bệnh viêm gan vịt do virus ựã xảy ra ở nhiều nơi, gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi ở các tỉnh ựồng bằng Nam Bộ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ28
Nguyễn Văn Cảm và cs ựã nghiên cứu biến ựổi bệnh lý bệnh viêm gan vịt do virus nhằm ựưa ra một phương pháp chẩn ựoán nhanh và chắnh xác [3].
Bùi Thị Cúc, 2002[7] nghiên cứu biến ựổi bệnh lý ựại thể, vi thể và siêu vi thể bệnh viêm gan vịt do virus cho biết: bệnh tắch siêu vi thể ựiển hình là màng nhân của tế bào gan bị thoái hoá và hoại tử; các glycogen trong tế bào gan bị phá huỷ, ựồng thời xuất hiện các tiểu thể hình cầu có bán kắnh 100 - 300nm.
Năm 2004, Nguyễn Phục Hưng ựã nghiên cứu ựặc tắnh sinh học của chủng virus nhược ựộc viêm gan vịt DH - EG - 2000 ựể có thể sản xuất vacxin phòng bệnh [11]. đến năm 2007, Bùi Thanh Khiết ựã nghiên cứu qui trình sản xuất vacxin viêm gan vịt từ chủng virus vacxin nhược ựộc trên và ứng dụng phòng - can thiệp vào thực tế sản xuất [12].
Ở nước ta, tuy có nhiều biện pháp phòng bệnh nhưng hiệu quả phòng bệnh vẫn chưa cao, hiệu quả khi sử dụng vacxin nhược ựộc và vô hoạt còn nhiều bất cập. Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng tới hiệu quả của việc phòng bệnh bằng vacxin có thể là do những loại vacxin này ựơn chủng lại chứa phần kháng nguyên của các chủng nước ngoài nên không phù hợp lắm với những chủng virus tại Việt Nam. Do vậy, ựể có những loại vacxin có hiệu quả cao, phù hợp với những chủng virus ở