nghiên cứu giải trình tự gen kháng nguyên GP5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp lợn việt nam và so sánh với một số chủng của thế giới

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------      ---------- LẠI THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU GIẢI TRÌNH TỰ GEN KHÁNG NGUYÊN GP5 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRS, TAI XANH) VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG CỦA THẾ GIỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ THANH HÒA HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan toàn bộ kết quả trong luận văn là do chính tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả ñược công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa ñược công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả Lại Thị Tuyết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS. Lê Thanh Hoà - Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người Thầy trực tiếp hướng dẫn, ñã tận tình chỉ bảo và tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên - Trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn sự tài trợ kinh phí nghiên cứu khoa học của Phòng Miễn dịch học do PGS.TS. Lê Thanh Hoà làm chủ nhiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn ñến: - ThS(NCS). Lê Thị Kim Xuyến, ThS(NCS) Nguyễn Thị Bích Nga, cùng các anh chị trong Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học, ñã nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện ñề tài. - Các Thầy, Cô trong Khoa Thú y, Viện ðào tạo sau ðại học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin ñược bày tỏ lòng biết ơn vô hạn ñến những người thân trong gia ñình cùng bạn bè ñã luôn hỗ trợ, ñộng viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Lại Thị Tuyết Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii ðẶT VẤN ðỀ……………………………………………………………… 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………. 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV)……………………………………………… 4 1.1.1. Khái niệm PRRS………………………………………………… . 4 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và phân loại………………………………. 5 1.1.3. Dịch tễ học PRRS…………………………………………………. 7 1.1.3.1. Trên thế giới…………………………………………………. 7 1.1.3.2. PRRS tại Việt Nam………………………………………… . 8 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích……………………………… . 11 1.1.4.1. Triệu chứng………………………………………………… 11 1.1.4.2. Bệnh tích…………………………………………………… . 13 1.2. ðẶC TÍNH SINH HỌC VIRUS PRRS . 14 1.2.1. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS 14 1.2.2. Cấu trúc phân tử hệ gen của virus PRRS 15 1.2.3. Khả năng gây bệnh và sức ñề kháng 19 1.2.3.1. Khả năng gây bệnh . 19 1.2.3.2. Sức ñề kháng 20 1.2.4. ðáp ứng miễn dịch của vật chủ với PSSRV 20 1.2.4.1. ðặc trưng ñáp ứng miễn dịch dịch thể với PRRS…………… 20 1.2.4.2. ðặc trưng ñáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của PRRS………………………………………………………… 21 1.2.5. Vật chủ và phương thức truyền lây……………………………… 23 1.2.6. Cơ chế sinh bệnh 24 1.2.7. Chẩn ñoán…………………………………………………………. 26 1.2.7.1. Chẩn ñoán lâm sàng………………………………………… 26 1.2.7.2. Chẩn ñoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh………………. 26 1.2.7.3. Phát hiện virus……………………………………………… 26 1.2.7.4. Chẩn ñoán huyết thanh học………………………………… 27 1.2.8. ðiều trị và phòng chống……………………………………… . 27 1.2.8.1. ðiều trị 27 1.2.8.2. Phòng chống ………………………………………………. 28 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 1.3. CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GEN VÀ HỆ GEN…………………… 29 1.3.1. Kỹ thuật PCR……………………………………………………… 29 1.3.2. Kỹ thuật RT-PCR……………………………………………… . 30 1.3.3. Kỹ thuật tách dòng………………………………………………… 31 1.3.4. Kỹ thuật giải trình trình tự 31 1.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU SỬ DỤNG CÁC PHẦN MỀM TIN – SINH HỌC 32 1.4.1. Nguyên tắc chung . 32 1.4.2. Xử lý số liệu trong nghiên cứu . 34 1.4.3. Các chương trình tin – sinh học ứng dụng trong nghiên cứu xử lý, phân tích và so sánh chuỗi gen thu nhận 34 1.5. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU TÌM HIỂU GEN GP5 36 PHẦN II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… . 39 2.1. NGUYÊN LIỆU ……………………………………………………… 39 2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU… 39 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị…………………………………………… 39 2.2.2. Hóa chất…………………………………………………………… 39 2.2.3. Dung dịch sử dụng trong tách dòng…………………………… 40 2.2.4. Các dung dịch dùng ñể ñiện di trên thạch agarose……………… . 41 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1. Tách chiết RNA tổng số . 42 2.3.2. Kỹ thuật ñiện di ñể kiểm tra RNA tổng số . 43 2.3.3. Phản ứng RT-PCR 43 2.3.3.1. Thiết kế mồi 43 2.3.3.2. Thực hiện phản ứng RT-PCR một bước . 44 2.3.4. ðiện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR . 45 2.3.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen . 45 2.3.6. Giải trình tự và xử lý chuỗi gen 49 2.3.6.1. Giải trình tự DNA . 49 2.3.6.2. Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình tự . 50 2.3.6.3. Thu nhận, xử lý và phân tích dữ liệu chuỗi gen GP5 50 2.3.6.4. Các gen GP5 của các chủng thế giới ñược lựa chọn so sánh 51 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 3.1. Kết quả tách chiết ARN tổng số . 52 3.2. Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR 52 3.3. Kết quả dòng hóa sản phẩm gen GP5 trong vector tách dòng 53 3.4. Kết quả giải trình tự gen GP5 của TX196 và TXMT1 . 55 3.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen . 58 3.6. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và acid amin của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 với một số chủng trên thế giới . 59 3.6.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide 59 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v 3.6.2. Kết quả so sánh thành phần amino acid . 64 3.7. Kết quả so sánh mức ñộ ñồng nhất về thành phần nucleotide (%) và tương ñồng về amino acid (%) của gen GP5 giữa TX196 và TXMT1 với các chủng thế giới 66 3.8. Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ của hai chủng TX196 và TXMT1 với các chủng thế giới dựa trên gen GP5 68 3.9. Bàn luận chung . 72 KẾT LUẬN . 74 KIẾN NGHỊ . 75 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt aa Amino acid Axit amin BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair Cặp bazơ Da Dalton DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic EAV Equine arteritis virus Virus gây viêm ñộng mạch ngựa EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Axit ethylene diamine tetraacetic ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme EtBr Ethidium bromide GP Glycoprotein LB Luria-Bertani LDHV Lactate dehydrogenase-elevating virus Virus gây tăng hoạt enzyme Lactate dehydrogenase SHFV Simian hemorrhagic fever virus Virus gây bệnh sốt xuất huyết khỉ MEGA Molecular Evolutionnary Genetics Analysis N Nucleocapsid protein Protein vỏ nhân OIE Organisation of International Epidemiology Tổ chức Dịch tễ học Thế giới ORF Open reading frame Khung ñọc mở PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleprotein Phức hợp protein và RNA RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Phản ứng PCR ngược WHO Wold Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta- D-galactopyranoside Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Arterivirus gây bệnh trên ñộng vật………………………… 7 Bảng 1.2. Thống kê ñặc ñiểm hệ gen của các chủng ñại diện các dòng PRRS trên thế giới . 16 Bảng 2.1. Thành phần nucleotide các mồi dùng trong phản ứng RT-PCR 45 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR/1 ống Eppendorf cho PCR . 46 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid bằng EcoRI 50 Bảng 2.4. Danh sách các chủng PRRSV của Việt Nam và thế giới cung cấp chuỗi gen GP5 ñể phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 52 Bảng 3.1. Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế, sử dụng chuỗi nucleotide của gen GP5 của chủng TXMT1 làm chuỗi truy cập . 60 Bảng 3.2. Tỷ lệ ñồng nhất (%) nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng amino acid (dưới ñường chéo) của gen GP5 giữa các chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam với các chủng thế giới . 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây phả hệ thể hiện sự liên quan của virus PRRS với các virus khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae dựa trên dữ liệu chuỗi gen RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)…………………………………… 6 Hình 1.2. Bản ñồ lịch sử xuất hiện bệnh PRRS trên thế giới 8 Hình 1.3. Tình hình dịch bệnh PRRS ở Việt Nam (năm 2007) . 9 Hình 1.4. Hình ảnh triệu chứng lâm sàng ở lợn nhiễm PRRSV…… 12 Hình 1.5. Hình ảnh bệnh tích trên phổi lợn mắc PRRS…………… . 14 Hình 1.6. Hình thái virion của virus PRRS . 15 Hình 1.7. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS 17 Hình 1.8. Sơ ñồ hệ gen của virus PRRS 18 Hình 1.9. Mô phỏng vị trí các protein của PRRSV trong virion . 19 Hình 1.10. Hình ảnh xâm nhiễm và phá huỷ ñại thực bào của PRRSV 25 Hình 2.1. Sơ ñồ quy trình nghiên cứu 42 Hình 2.2. Sơ ñồ vị trí ORF5 vùng mã hoá protein chức năng của virus PRRS . 44 Hình 2.3. Sơ ñồ cấu tạo vector pCR ® 2.1-TOPO ® (Invitrogen) . 47 Hình 3.1. Kết quả ñiện di kiểm tra RNA tổng số của TX196 và TXMT1 53 Hình 3.2. Kết quả diện di sản phẩm RT -PCR gen GP5 54 Hình 3.3. ðĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh 55 Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra DNA của gen GP5 từ plasmid tái tổ hợp . 55 Hình 3.5. Giản ñồ giải trình tự tự ñộng (chromatogram) thành phần nucleotide của ñoạn gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 57 Hinh 3.6. Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 thu nhận sau giải trình tự…… 58 Hình 3.7. So sánh thành phần nucleotide 603 bp chuỗi gen GP5 của virus gây Hội chứng sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở lợn phân lập tại Việt Nam với các chủng của thế giới . 62 Hình 3.8. So sánh thành phần amino acid chuỗi gen GP5 của virus gây Hội chứng sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở lợn phân lập tại Việt Nam với các chủng của thế giới 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ix Hình 3.9. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotide của gen GP5 . 70 Hình 3.10. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần amino acid của chuỗi polypeptide GP5 . 72