- Vật chủ: PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Ngồi ra, lợn rừng cũng mắc bệnh và đây cĩ thể được coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán bệnh. Theo Tổ chức Nơng lương Thế giới (FAO), PRRS được xác định khơng lây truyền và gây bệnh sang gia súc khác và con người [52].
- ðường truyền lây: Virus PRRS cĩ trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra mơi trường; tinh
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………24
dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus cĩ thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng cĩ thểđào thải virus ra mơi trường trong vịng 6 tháng [8].
Bệnh truyền chủ yếu theo đường khơng khí, cĩ thể lây trực tiếp thơng qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và cũng cĩ thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian (khơng khí, đất, nước, thức
ăn,…) bị nhiễm virus, virus cĩ khả năng phát tán rộng và dễ gây nhiễm qua
đường hơ hấp [23].
1.2.6 Cơ chế sinh bệnh
Sau khi xâm nhập vào cơ thể, đích tấn cơng của virus là đại thực bào, đặc biệt đại thực bào ở phế nang và phế quản. ðại thực bào là loại tế bào duy nhất cĩ receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nĩ. Cĩ một tỷ lệ lớn tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm [52].
Lúc đầu, PRRSV cĩ thể kích thích các tế bào này cung cấp nguyên liệu cho quá trình sao chép của virus, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phĩng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác. Ở
giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus và vi khuẩn khơng liên quan khác trong cơ
thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch. ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn [52].
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………25
Virus PRRS
ðại thực bào
ðại thực bào bịPRRSV phá huỷ
Virus PRRS
ðại thực bào bịvirus phá huỷ
ðại thực bào
Hình 1.10. Hình ảnh xâm nhiễm và phá huỷ đại thực bào của PRRSV
Nguồn: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH
Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào là tế bào cĩ thẩm quyền miễn dịch, đĩng vai trị vơ cùng quan trọng trong đáp ứng miễn dịch cả
khơng đặc hiệu và đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch khơng xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát [27]. Hậu quả suy giảm miễn dịch cịn thể hiện ở gĩc độ khơng hoặc giảm hiệu lực của các vaccine khác ở lợn như vaccine dịch tả, tụ huyết trùng,... ðiều này cĩ thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ cĩ sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi thứ (kế) phát do những vi khuẩn vốn sẵn cĩ trong đường hơ hấp [52] (Hình 1.9).
Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hĩa của thai, thai bị
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………26
tăng cao vì phải nuơi thai, ở thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu cầu về oxy tăng gấp bội, vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng, nên thai hay sảy vào kỳ cuối. Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thối hĩa, hoại tử nên làm chậm các quá trình sinh lý khác.
Tuỳ theo đối tượng lợn nhiễm bệnh mà hậu quả gây ra cĩ sự khác nhau. Hầu hết lợn con và lợn nái đang trong thời kỳ mang thai đều bị chết do nhiễm khuẩn kế phát nặng sau nhiễm PRRSV. Tuy nhiên, để ngăn chặn nguồn bệnh và cắt đường lây truyền của dịch, người ta thường tiêu huỷ 100% lợn bệnh, nếu dịch bệnh xảy ra trên diện rộng sẽ gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuơi, mơi trường và xã hội.
1.2.7 Chẩn đốn
1.2.7.1 Chẩn đốn lâm sàng
Chẩn đốn dựa vào 2 nhĩm triệu chứng:
+ Triệu chứng đường sinh sản: chủ yếu đối với lợn nái. Vào giai đoạn
đầu của dịch PRRS, cĩ thể thấy hiện tượng sảy thai ở giai đoạn cuối thời kỳ
mang thai và đẻ non, cĩ các thai yếu, thai chết lưu, đồng thời cĩ thai gỗ, lợn con yếu, chết trước khi cai sữa.
+ Triệu chứng đường hơ hấp: Chủ yếu dựa vào biểu hiện viêm phổi ở
lợn con và lợn vỗ béo [10].
1.2.7.2 Chẩn đốn bằng phương pháp giải phẫu bệnh
+ ðối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn xuất chuồng: Bệnh tích khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và cĩ vùng xám và hồng.
+ Trên tiêu bản vi thể: Viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dày lên, viêm não giữa và giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho.
+ ðối với thai sảy và thai chết lưu: Khơng cĩ bệnh tích đại thể hoặc vi thể [10].
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………27 1.2.7.3 Phát hiện virus
Lấy bệnh phẩm là huyết thanh, huyết tương, bạch cầu, phổi, hạch Amidan, tổ chức Lympho, dịch báng của thai chết lưu hoặc lợn chết ngay sau khi sinh để phát hiện virus.
Cĩ thể áp dụng một số kỹ thuật sau đây để phát hiện virus:
- Phân lập virus trên một số loại tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA-104, tế bào MARC-145, CL-2621 và CL-11171.
- Phương pháp bệnh lý miễn dịch.
- Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên. - Phương pháp sinh học phân tử.
+ Phương pháp nhân gen (RT-PCR).
+ Phương pháp lai phân tử tại chỗ (in situ hybridization) [10].
Phản ứng RT-PCR cĩ độ chính xác cao đáp ứng được yêu cầu phát hiện sớm và chính xác virus PRRS trên đàn lợn. Trong quá trình chẩn đốn, việc
ứng dụng và hồn thiện quy trình kỹ thuật RT-PCR gĩp phần xây dựng chiến lược kiểm sốt bệnh trong ngành chăn nuơi lợn Việt Nam [2].
Phương pháp sinh học phân tử cĩ độ nhạy và độ chính xác cao đang
được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đốn xác định bệnh dịch, và cung cấp các dữ liệu di truyền học của virus PRRS giúp cho việc nghiên cứu và điều chế
vaccine phịng bệnh thế hệ mới.
1.2.7.4 Chẩn đốn huyết thanh học
Cĩ thể phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh, dịch của cơ thể hoặc từ thai chết lưu bằng một số phương pháp huyết thanh học bao gồm phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phương pháp miễn dịch enzyme, ELISA và phản ứng trung hịa huyết thanh.
Trong đĩ, ELISA là phương pháp tiện lợi hơn cả. Thuận lợi của phương pháp này là cĩ thể chẩn đốn một số lượng lớn các mẫu huyết thanh
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………28
và các kết quả thu được của các phịng thí nghiệm (khi chẩn đốn huyết thanh cùng lúc) là tương đối đồng nhất [10].
Tuy nhiên, việc chọn lọc kháng nguyên chẩn đốn là hết sức quan trọng do PRRS là nhĩm virus đa dịng, đa chủng.
1.2.8 ðiều trị và phịng chống
1.2.8.1 ðiều trị
Khơng cĩ thuốc điều trịđặc hiệu với PRRSV, chủ yếu chỉđiều trị triệu chứng. Hầu hết các phương pháp điều trị chủ yếu nhằm ngăn chặn và điều trị
các nhiễm khuẩn thứ phát.
Chống nhiễm bệnh kế phát cĩ thể dùng kháng sinh cĩ tác dụng với
đường hơ hấp như: Flofenicol, Lincomix S, Tylansulfa – G, Amoxicilin LA, Linco – spectin, Cephalosporin.
Ngồi ra cĩ thể sử dụng một số thuốc chống sảy thai dành cho nái mang thai như: Acid acetyl salicylique, Salicylate sodium,…
1.2.8.2 Phịng chống
Thơng thường biện pháp ngăn chặn quyết liệt và hữu hiệu nhất là tiêu huỷ đàn gia súc bị bệnh, vệ sinh và khử trùng chuồng trại,… nhằm tiêu huỷ
mầm bệnh và ngăn chặn nguyên nhân phát tán bệnh ra diện rộng.
Hiệu quả của vaccine bảo vệ trước nhiễm trùng đem lại cĩ thể phịng ngừa bệnh lý lâm sàng và là cơng cụ chính trong việc tiêu diệt PRRSV. Việc tiêm phịng bằng vaccine được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để kiểm sốt bệnh dịch hiện nay. Tuy nhiên, do PRRS đa dịng đa chủng, cĩ độ đồng nhất kháng nguyên khơng cao, nên vaccine nào phù hợp là vấn đề và giá cả
vaccine quá cao đối với người chăn nuơi Việt Nam (thấp nhất là 100.000 VNð/liều, đối với vaccine nhập từ Trung Quốc). Thời gian tạo ra miễn dịch bảo hộ phụ thuộc vào các chủng virus vaccine. ðặc biệt ở Việt Nam hiện nay, do chưa xác định được chính xác chủng virus gây bệnh nên việc tiêm phịng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………29
đạt kết quả khơng cao. Hiện tại, vaccine phịng PRRSV đã được Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn cho phép nhập vào Việt Nam để phịng bệnh cho lợn (http://www.cucthuy.gov.vn/). Cĩ 2 loại vaccine đang được sử dụng ở
các địa phương:
1. Vaccine phịng PRRS BSL – PS100 : Là loại vaccine virus PRRS sống nhược độc dạng đơng khơ cĩ nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc dịng Bắc Mỹ.
2. Vaccine phịng PRRS BSK-PS100: Là loại vaccine vơ hoạt chứa chủng virus PRRS dịng châu Âu. Vaccine an tồn và gây miễn dịch tốt.
Cơng nghệ sinh học hiện nay cho phép tách chiết các hợp phần kháng nguyên từ tế bào nuơi cấy cĩ một vài bước đặc biệt so với quy trình sản xuất vaccine thơng thường để gần như loại bỏ hết các tế bào nuơi cấy trong sản phẩm cuối cùng nhằm cĩ một thành phẩm vaccine đạt độ tinh khiết kháng nguyên rất cao - đĩ là vaccine phịng PRRS trong tương lai.
1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu phân tích gen và hệ gen gen và hệ gen
1.3.1 Kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR được phát hiện vào giữa những năm 1980, là phương pháp hồn tồn mới trong việc nghiên cứu, giúp chúng ta tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn DNA mong muốn. PCR là một phản ứng sinh hĩa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt, cĩ hai đoạn ngắn làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuơn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nĩ [5].
Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm cĩ độ dài nằm
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………30
giữa hai đoạn mồi này. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng
được nâng nhiệt độ lên thích hợp cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, rồi các sợi này được dùng làm khuơn cho chu kỳ tiếp theo. Phản ứng PCR được tiến hành qua ba bước điều chỉnh nhiệt độ cho 1 chu kỳ (cịn gọi là
chu trình nhiệt của phản ứng) [5]. Bao gồm các giai đoạn:
- Bung liên kết của DNA (denaturation). Thực hiện ở nhiệt độ 90oC
đến 98oC (thường là 94oC) trong vài giây đến vài phút, làm gẫy các liên kết hydro của chuỗi xoắn kép DNA tạo ra các sợi DNA mạch đơn.
- Mồi bám (annealing) hay cịn gọi là ủ với mồi. Ngay sau giai đoạn bung liên kết nhiệt độđược hạ xuống 37 - 68oC, các đoạn mồi (oligopeptide - cĩ độ dài từ 6-30 nucleotide) bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên
đoạn DNA sợi đơn làm khuơn được tạo ra ở trên tại điểm khởi đầu sao chép. - Tổng hợp hay cịn gọi là kéo dài (extension). Nhiệt độđược nâng lên đến 68-720C (thường là 720C) trong vài chục giây đến vài chục phút, để tổng hợp các sợi DNA bổ sung - sản phẩm PCR dưới xúc tác của enzyme DNA-polymerase.
Sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên các sợi DNA mới, các sợi này được dùng làm khuơn cho các chu kỳ tiếp theo, đến chu kỳ cuối nhiệt độ được duy trì ở 720C/5-10 phút, để cho tất cả các đoạn DNA mới được tổng hợp xoắn lại hồn tồn tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng, duy trì nhiệt độở 40C để bảo quản sản phẩm. Kết quả, sau n chu kỳ của phản ứng, đoạn DNA ban đầu được “nhân lên” với số lượng rất lớn, theo lý thuyết sẽ cĩ 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm ở giữa hai đoạn mồi. Ví dụ: sau 30 chu kỳ số lượng sản phẩm PCR sẽ là: 230=1.073.741.824 bản sao của một đoạn DNA ban đầu [5].
1.3.2 Kỹ thuật RT-PCR
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuơn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: giai
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………31
đoạn thứ nhất là chuyển đổi RNA một sợi làm khuơn thành DNA 2 sợi; sau
đĩ qua giai đoạn thứ hai, dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuơn để thực hiện phản ứng PCR.
Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành cDNA phải nhờ đến vai trị của enzyme phiên mã ngược. Do vậy giai đoạn này gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT – reverse transcription). Khi đã cĩ cDNA hai sợi làm khuơn, phản ứng tiếp theo là PCR và được thực hiện ba bước thay đổi nhiệt độ cho phù hợp mỗi chu kỳ. Tùy theo từng mục đích của việc thực hiện các phản ứng RT- PCR, cĩ thể sử dụng RT-PCR một bước hoặc RT-PCR hai bước. Trong chẩn
đốn virus PRRS hiện nay phương pháp RT-PCR một bước được đánh giá là phương pháp cĩ độ nhạy cao, cho kết quả nhanh [4].
1.3.3 Kỹ thuật tách dịng
Phương pháp tách dịng là đưa đoạn DNA sản phẩm của PCR/RT-PCR vào trong hệ gen của một vịng DNA đã được thiết kế trước gọi là plasmid hay là vector dẫn truyền. Sau đĩ plasmid chứa DNA ngoại lai này sẽ chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng (thường là vi khuẩn E. coli rồi nuơi cấy với số
lượng lớn). Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo cơ chế X-gal và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn khơng tái tổ
hợp. Sau đĩ tách DNA plasmid chứa đoạn DNA của phản ứng PCR/RT-PCR nĩi trên. Thành phần thực hiện dịng hố gồm: DNA ngoại lai (DNA của