với một số chủng thế giới
Sử dụng chương trình GENEDOC2.5 so sánh tỷ lệ đồng nhất (%) về
thành phần nucleotide gen GP5 và tương đồng về amino acid trong chuỗi polypeptide GP5 của hai chủng TX196 và TXMT1 so với các chủng được lựa chọn so sánh, và được trình bày tĩm tắt trên Bảng 3.2.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………67
Bảng 3.2. Tỷ lệđồng nhất (%) nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng amino acid (dưới đường chéo) của gen GP5 giữa các
chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng thế giới ðộc lực cao ðộc lực thấp Nhĩm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 99 98 99 99 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 2 100 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 3 99 99 99 98 98 98 99 99 99 98 99 99 98 88 88 88 94 88 86 88 88 89 89 4 100 100 99 99 99 99 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 5 100 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 6 100 100 99 100 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 7 100 100 99 100 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 8 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 9 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 10 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 11 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 12 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 99 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 13 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 88 88 88 95 88 87 89 89 90 89 ðộc lực cao 14 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 88 88 88 94 88 87 89 89 89 89 15 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 100 99 91 88 91 99 99 90 99 16 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 100 99 91 88 91 99 99 90 99 17 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 86 87 87 88 99 99 91 88 91 99 99 90 99 18 93 93 92 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 92 90 90 90 90 89 91 91 92 92 19 87 87 86 87 87 87 87 87 87 87 86 87 86 86 87 87 87 90 87 88 88 90 89 20 86 86 85 86 86 86 86 86 86 86 85 86 85 85 88 88 89 88 84 91 91 88 91 21 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 99 99 99 90 87 88 100 90 99 22 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 99 99 99 90 87 88 100 90 99 23 92 92 91 92 92 92 92 92 92 92 91 92 91 91 91 91 91 94 91 89 92 92 91 ðộc lực thấp 24 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 89 89 98 98 98 91 88 88 99 99 93
Chú thích: 1. TX196-VN; 2. TXMT1-VN; 3. 07QN-VN; 4. 07NM-CN; 5. GD-CN; 6. HUB1-CN; 7. HUB1-CN ; 8. HEN13-CN; 9. HUN4-
CN; 10. Jsyx-CN; 11. JXA1-CN; 12. NX06-CN; 13. BO-CN; 14. YN02-CN; 15. PRRSV01-CN; 16. S1-CN; 17. Fuzhou-CN; 18. CH1a-
CN; 19. 07NP4-TL; 20. LMY-KR; 21. MLV-USA; 22. MLVvac-USA; 23. PrimePac(a) USA; 24. VR2332-ATCC. VN: Việt Nam; CN:
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………68
Bảng 3.2 cho thấy, qua so sánh 603 nucleotide (tương ứng với 200 amino acid) của hai chủng TX196 và TXMT1 cĩ tỷ lệ đồng nhất về
nucleotide và tương đồng về amino acid rất cao (99%, nucleotide; 100%, amino acid). Giữa các chủng phân lập ở Trung Quốc và một chủng Việt Nam (07QN-VN) tỷ lệ này đạt khoảng 98-100%. Với các chủng Bắc Mỹ thì mức
độ tương đồng thấp hơn (88-90% về nucleotide và 87-92% về amino acid). Khơng cĩ sự sai khác nhiều về nucleotide và amino acid giữa các chủng TX196 và TXMT1 với các chủng phân lập ở Trung Quốc năm 2006- 2007. Tuy nhiên, sự sai khác này cũng đủđể tạo nên sựđa dạng về chủng loại trong quần thể virus PRRS và làm phức tạp hơn về mặt dịch tễ học của PRRS.
ðiều đĩ cũng cho thấy rằng tác nhân gây PRRS cĩ tại Việt Nam rất cĩ thể là cĩ từ các chủng PRRSV của Trung Quốc. Như vậy, qua phân tích, rõ ràng gen GP5 của chủng TX196 và TXMT1 của Việt Nam và các chủng Trung Quốc
đã cĩ sự tiến hố xa hơn rất nhiều so với với chủng gốc VR2332 của Bắc Mỹ
như một số nhận định của nhiều tác giả khác [62]; [29]; [64]; [38].
3.8 Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ của hai chủng TX196 và TXMT1 với một số chủng thế giới dựa trên gen GP5
Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid giữa các chủng virus PRRS chúng tơi tiến hành lập sơ đồ phả hệ dựa trên sự phân tích so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của chuỗi gen GP5 nghiên cứu, sử dụng chương trình MEGA3.1. Kết quảđược trình bày ở Hình 3.9 và Hình 3.10.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………69 HUB1-CN HUB2-CN TX196-VN JXA1-CN TXMT1-VN GD-CN 07NM-CN HEN13-CN HUN4-CN JSyx-CN NX06-CN YN02-CN 07QN-VN BQ-CN CH1a-CN 07NP4-TL PrimePac-US LMY-KR VR2332-ATCC MLV-USA MLVvac-USA Fuzhou-CN S1-CN PRRSV01-CN 100 100 90 100 100 100 100 100 100 90 100 90 40 40 60 100 100 100 70 90 90 100 80 100 100 100 60 100 0.01 100 100 I a II I b I Nucleotide (GP5)
Hình 3.9. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotide của
gen GP5
Kết quả phân tích phả hệ trình bày ở Hình 3.9 và Hình 3.10 cho thấy, 24 chủng PRRSV lựa chọn so sánh, cả về nucleotide và amino acid, được phân chia thành 2 nhĩm:
- Nhĩm I: gồm các chủng của Việt Nam và Trung Quốc, một chủng của Thái Lan và một chủng của Mỹ. Các chủng trong nhĩm I chia thành 2 phân nhĩm: Ia và Ib.
+ Phân nhĩm Ia: bao gồm các chủng TX196 và TXMT1 trong nghiên cứu của chúng tơi, cùng nhĩm với một số chủng PRRSV phân lập tại Trung Quốc và một chủng khác của Việt Nam (07QN-VN) [29]. Các chủng của Trung Quốc cĩ tính gây bệnh rất cao, đại diện cho PRRSV thể độc lực cao
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………70
mới xuất hiện tại các tỉnh phía Nam Trung Quốc từ năm 2006 [62]; [59]; [29]; [64]. ðiều này chứng tỏ, các chủng TX196, TXMT1 và 07QN của Việt Nam đều thuộc nhĩm các chủng cĩ độc lực cao mới xuất hiện gần đây trên
địa bàn các quốc gia Nam Á và ðơng Nam châu Á [38].
+ Phân nhĩm Ib: Gồm chủng 07NP4-TL của Thái Lan, chủng PrimePac-USA của Mỹ. Chủng 07NP4 của Thái Lan cĩ mức độ tương
đồng cao với chủng PrimePac-USA của Mỹ, mà theo nhận xét của nhiều nhà nghiên cứu, hiện nay Thái Lan cĩ nhiều genotype tồn tại, dịng Bắc- Mỹ (type II), dịng Châu Âu (type I), cĩ lẽ 07NP4 là một chủng mang đặc tính như vậy [61].
- Nhĩm II: bao gồm các chủng thuộc dịng Bắc Mỹ (nhĩm cũ) cĩ độc lực thấp, tiêu biểu trong nhĩm này là chủng VR2332 (Bắc Mỹ). Các chủng khác nằm trong nhĩm này cũng là các chủng được phân lập tại Mỹ (MLV- USA; MLVvac-USA) và một số chủng của Trung Quốc (Fuzhou-CN; S1- CN; PRRSV01-CN). Ngồi ra, trong nhĩm này cịn cĩ một chủng của Hàn Quốc (LMY-KR). Chủng LMY của Hàn Quốc cĩ mức độ biến đổi khác với các chủng trong vùng và Châu Á [22].
Kết quả phân tích phả hệ sử dụng trình tự amino acid của 24 chủng cũng cho thấy sự phân chia nhĩm và phân nhĩm hồn tồn giống như kết quả khi phân tích phả hệ sử dụng dữ liệu là chuỗi nucleotide của GP5 (Hình 3.10).
Như vậy, phân tích phả hệ nguồn gốc các chủng PRRSV của Việt Nam, Trung Quốc và một số chủng của thế giới dựa trên chuỗi gen GP5 đều cho kết quả tương tự nhau, giúp chúng ta đánh giá chính xác genotype và mối quan hệ giữa các chủng thuộc dịng Bắc Mỹ.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………71 JXA1-CN NX06-CN JSyx-CN HEN13-CN HUB2-CN HUB1-CN GD-CN 07NM-CN TXMT1-VN TX196-VN HUN4-CN YN02-CN 07QN-VN BQ-CN CH1a-CN 07NP4-TL PrimePac-US LMY-KR VR2332-ATCC S1-CN PRRSV01-CN MLV-USA Fuzhou-CN MLVvac-USA 90 90 100 100 90 90 80 30 20 80 100 100 100 90 60 90 100 90 90 100 100 50 100 0.01 I b I a II I Acid amin (GP5)
Hình 3.10. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần
amino acid của chuỗi polypeptide GP5
Từ những kết quả phân tích phả hệ trên đây, chúng tơi cĩ một số nhận xét như sau:
Mặc dù, cĩ một số sai khác nhất định, nhưng các chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam mà chúng tơi nghiên cứu (TX196, TXMT1) và các chủng PRRS của Trung Quốc phân lập những năm 2006-2007, cùng với chủng VR2332 của Bắc Mỹ cĩ chung nguồn gốc tiến hố. Kết quả này phù hợp với sự phân loại về nguồn gốc phát sinh chủng loại PRRSV của thế giới trong các nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả trên thế giới [54]; [62]; [59]; [64]; [29]; [38]. Kết quả phân tích phả hệ một lần nữa cho thấy, các chủng của Việt Nam (phân lập năm 2007) cùng nguồn gốc với các chủng mới xuất hiện tại các tỉnh
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………72
phía Nam Trung Quốc. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen GP5 ở hai chủng TX196, TXMT1 (Việt Nam) và thành phần amino acid của chuỗi polypeptide do gen này quy định mã hố đã trình bày ở các phần trước.
3.9 Bàn luận chung
- Gen GP5 là một gen cĩ tính kháng nguyên và chịu trách nhiệm gây bệnh (biểu hiện độc lực) của virus PRRS, sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng gây bệnh của virus [41]; [38].
- Cả ba chủng phân lập tại Việt Nam là: TX196-VN, TXMT1-VN và 07QN-VN cĩ độ tương đồng rất cao so với các chủng độc lực cao phân lập gần
đây của Trung Quốc (98-100%). ðặc biệt, chủng TX196 cĩ độ tương đồng 100% cả về nucleotide và amino acid với hai chủng HUB1-CN và HUB2-CN.
ðiều đĩ cho thấy, cĩ khả năng PRRSV từ Trung Quốc đã lây truyền vào Việt Nam. Mầm bệnh cĩ thể vào nước ta qua rất nhiều con đường. Do Việt Nam và Trung Quốc cĩ biên giới giáp nhau nên việc nhập lậu gia súc thường xuyên diễn ra mặc dù sự vẫn cĩ sự kiểm tra, giám sát hay kiểm dịch. Ngồi ra, sự lây lan mầm bệnh từ nước ngồi vào qua con đường nhập khẩu là một nguy cơ lớn, do động vật và thực phẩm nhập khẩu khơng được kiểm dịch chặt chẽ. Do đĩ, virus PRRS dễ dàng xâm nhập và việc khống chế bệnh dịch là một điều vơ cùng khĩ khăn do tính chất lây lan nhanh và gây chết nhiều của bệnh.
- So sánh về nucleotide và amino acid cho thấy, chủng vaccine của Mỹ
(MLVvac-USA) cĩ độ tương đồng cao (99%) so với chủng VR2332 (Bắc Mỹ) thuộc nhĩm độc lực thấp, nhưng MLVvac-USA lại cĩ sự sai khác lớn so với các chủng mới xuất hiện tại Trung Quốc và Việt Nam (87-88%). Vaccine này nếu được sử dụng đối với vùng dịch do các chủng độc lực cao gây ra, rất cĩ thể chỉ cĩ tác dụng bảo hộ tốt cho các chủng cũ độc lực thấp mà cĩ thể
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………73
- Gen GP5 của những chủng virus PRRS cĩ độc lực cao, tuy cĩ khả
năng biến đổi mạnh mẽ dẫn đến sự sai khác lớn so với các chủng cũ cĩ độc lực thấp nhưng nĩ khơng phải type mới và sự biến đổi trong cùng nhĩm độc lực cao là khơng lớn (≤ 2%). ðiều này cĩ lợi cho việc sử dụng vaccine sản xuất từ các chủng mới xuất hiện gần đây, đối với việc phịng chống các chủng
độc lực cao. Như vậy, vaccine lưu hành hiện nay đang sử dụng tại Việt Nam (xuất xứ từ Trung Quốc) vẫn cĩ khả năng bảo hộ miễn dịch cao đối với các chủng của Trung Quốc và Việt Nam. Tuy nhiên, hiệu quả thực tế như thế nào thì cần phải cĩ những nghiên cứu cụ thể để đánh giá chính xác về sự bảo hộ
miễn dịch của các loại vaccine này.
- Kết quả nghiên cứu sinh học phân tử gen GP5 của các chủng độc lực cao phân lập tại Việt Nam cho thấy, cho đến nay, tại nước ta, chưa cĩ sự trộn lẫn nhiều dịng PRRSV, sự biến đổi nucleotide và amino acid giữa các chủng so sánh là hồn tồn theo quy luật tự nhiên, tuy nhiên, những biến đổi đĩ cĩ
ảnh hưởng đến tính kháng nguyên và độc lực là vấn đề cần nghiên cứu để cĩ những đánh giá xác định mối quan hệ genotype và phenotype, giữa các chủng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………74
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tơi rút ra một số kết luận sau: 1. Thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi TX3F – TXGPR, dịng hố và giải trình tự thành cơng đoạn gen GP5 (ORF5) của PRRSV từ mẫu bệnh phẩm phân lập ở lợn cĩ nguồn gốc từ Hải Dương (ký hiệu mẫu: TX196) (2007) và ở một tỉnh miền Trung Việt Nam (2007) (ký hiệu: TXMT1). Giải mã thành cơng gen GP5 cĩ độ dài 603 bp, cung cấp một số thơng tin về
gen học của PRRSV gây bệnh tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam. 2. Gen GP5 của hai chủng TX196 và chủng TXMT1 cĩ sự tương đồng cao với các chủng PRRSV được lựa chọn so sánh ở Trung Quốc cả về thành phần nucleotide và thành phần amino acid (98-100%).
3. TX196 và TXMT1 cùng với các chủng mới xuất hiện và được phân lập tại Trung Quốc, với sự thay đổi các nucleotide và amino acid của chuỗi polypeptide do gen GP5 mã hố đã tạo một nhĩm mới so với các chủng cũ
phân lập tại Mỹ và một số nước khác được lựa chọn so sánh
4. Hai chủng TX196 và TXMT1 cĩ chung nguồn gốc phát sinh với các chủng PRRSV của Trung Quốc được phân lập gần đây và thuộc nguồn gốc dịng Bắc Mỹ.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………75
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự, nếu cĩ điều kiện, tồn bộ hệ gen của hai chủng TX196 và TXMT1 và một số chủng PRRSV khác gây bệnh