- Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen GeneDoc là một chương trình do Nicholas và Nicholas (1997) [48] lập trình cho máy tính PC sử dụng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………35
hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng .msf (multiple sequence file). GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể, đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp vào Mega cho phân tích phả hệ. Hiện nay, GeneDoc đang được cung cấp miễn phí (GeneDoc2.5 và GeneDoc2.7) và là các chương trình phân tích so sánh giúp Mega4.0 xây dựng phả hệ tiến hĩa cĩ giá trị
(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/).
- Chương trình biên tập chuỗi Chromas xử lý/biên tập chuỗi trên đồ thị
hoặc xuất chuỗi nucleotide ra dạng chữ (.txt), chuyển đổi nucleotide sang amino acid, thu nhận hình ảnh giải trình tự và nhiều ứng dụng khác. http://www.technelysium.com.au/chromas.html.
- Chương trình biên tập chuỗi nucleotide SeqEd do hãng Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA) lập trình cho máy tính Macintosh, sử dụng
để mở, quan sát, biên tập, so sánh và xử lý nucleotide của chuỗi gen (chromatogram), sau khi giải trình tự. Chuỗi nucleotide giải trình tự được cung cấp ở dạng file .ab1 và sau khi đối chiếu từng nucleotide trùng khớp với chronmatogram, chuỗi nucleotide cĩ thể được lấy ra ở dạng file .txt (dạng chữ) để so sánh đối chiếu với các chuỗi khác [33]. SeqEd là chương trình cung cấp riêng biệt hoặc cùng với chương trình AssemblyLIGN trong tổng hệ
chương trình MacVector (Accelrys Inc).
- Hệ chương trình MacVector là một hệ tổng hợp các chương trình do hãng MacVector thiết kế và do Cơng ty Accelrys Inc phân phối độc quyền. Kèm với MacVector là các chương trình sắp xếp chuỗi gen AssemblyLIGN hoặc Assembler. MacVector là hệ chương trình nổi sử dụng cho máy tính Macintosh, trong đĩ cĩ chương trình so sánh đối chiếu (Clustal X), chương trình phân tích nucleotide và amino acid và nhiều chương trình tin-sinh học
khác cĩ thể trình diện sử dụng cùng lúc
(http://www.macvector.com/index.html). ðây là một hệ chương tình đa năng bao gồm xử lý phân tích chuỗi thơ, biên tập chuỗi đầu vào, thiết kế primer, tìm kiếm tra cứu chuỗi gen trên mạng và các cơ sở dữ liệu, phân tích protein.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………36
Trong xây dựng phả hệ của nghiên cứu này chúng tơi dựa vào chương trình MEGA (MEGA4.0), sử dụng phương pháp kết nối liền kề (neighbour- joining) NJ với độ tin tưởng ước lượng 1000 bootstrap [32]. MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) là một hệ chương trình nổi (interface application), nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh
đối chiếu các chuỗi gen đồng chủng, được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu chức năng từ các chủng cùng lồi, từ các chủng khác lồi trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ. MEGA cung cấp kết quả xử lý số liệu với mục đích nhấn mạnh mối quan hệ xác lập trên phương diện so sánh biến đổi nucleotide (hoặc/và amino acid) của 2 hay nhiều chuỗi gen từ đĩ suy ra mối quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở gĩc độ tiến hĩa phân tử [56]; [35]; (http://www.megasoftware.net/).
1.5 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu tìm hiểu gen GP5
Trong số các protein chức năng của virus, protein vỏ (GP5) mã hố bởi ORF5 của virus. ORF5 cĩ sự thay đổi gen di truyền của một số virus khi phân tích trình tự gen đích về dịch tễ học virus. GP5 của virus khác nhau rất cĩ thể
khác nhau về di truyền, được phân tích khi xác định dịch tễ học bằng phương pháp sinh học phân tử [16]. GP5 cĩ trọng lượng phân tử khoảng 24 - 25 kDa, là một protein được glycosyl hố gắn với vỏ của virus, cĩ tính kháng nguyên và cĩ vai trị quan trọng trong quá trình gây bệnh của virus. Do vậy, GP5
được coi là protein đích trong nghiên cứu miễn dịch học vaccine và chẩn đốn huyết thanh học [34]; [51].
Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của các kháng thể trung hồ (neutralizing antibodies), tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV. GP5 ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào cĩ thẩm quyền miễn dịch trong cảđáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (CMI) [28]. GP5 làm giảm sự phát triển của kháng thể trung hồ - một phương thức lẩn tránh
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………37
đáp ứng miễn dịch dịch thể của PRRSV. Protein GP5 chứa tối đa 4 vị trí glycosyl hố, được định vị ở trong hoặc gần với epitope trung hồ. Epitope B là epitope trung hồ chủ yếu của virus PRRS, định vịở vùng xa đầu N tận của GP5 (aa 37 - 44) [51]. Epitope A cĩ tác dụng làm gia tăng đáp ứng miễn dịch, nằm ở vùng gần đầu N tận của GP5 (aa 27 và 31) và cĩ những đặc điểm của một epitope dạng lưới, tương tự như virus gây hội chứng suy giảm đáp ứng miễn dịch mắc phải type I ở người (HIV) [51]; [41]. Epitope dạng lưới này cĩ thể ngăn cản đáp ứng miễn dịch của những vùng epitope B trung hồ chủ yếu, kết quả là làm giảm đáp ứng của kháng thể trung hồ, trạng thái cấu trúc khơng gian của epitope A và B là rất quan trọng trong việc giảm đáp ứng kháng thể trung hồ.
Bên cạnh đĩ, GP5 của PRRSV liên quan đến hiện tượng chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ thể nhiễm. Vùng gây ra hiện tượng apoptosis của protein GP5 đã được sơđồ hố ởđầu N - tận gồm 119 aa [56]; [46].
Như vậy, sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp do làm giảm hiệu quả phịng bệnh của các vaccine đang lưu hành [51].
Chính vì vậy, nghiên cứu giải mã gen GP5 (OFR5) của PRRSV đương nhiễm hiện nay là thực sự cần thiết, giúp cho chẩn đốn xác định bệnh nhằm sớm khống chế bệnh dịch và khoanh vùng dịch tễ giảm thiệt hại do bệnh dịch gây ra. Nghiên cứu sinh học phân tử GP5 cịn cho phép xác định mức độ tiến hĩa của PRRSV đương nhiễm với các chủng trước đĩ tại Việt Nam và trên thế giới, quan trọng hơn đĩ là cung cấp dữ liệu di truyền học của GP5 giúp cho việc nghiên cứu điều chế sản xuất các vaccine thế hệ mới phù hợp với PRRSV đang lưu hành. Hơn nữa, tìm hiểu thành phần gen của gen GP5 cho phép xác định mức độ tiến hĩa, cung cấp cứ liệu xác định chính xác chủng/genotype PRRS của PRRSV đương nhiễm với các chủng trước đĩ tại Việt Nam và trên thế giới.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………38
2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung nghiên cứu
ðể đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tơi đặt ra một số nội dung nghiên cứu như sau:
1. Giải trình tự vùng DNA chứa tồn bộ gen GP5 của một số chủng virus PRRS phân lập trên lợn mắc bệnh tại Việt Nam.
2. Phân tích gen GP5, so sánh sự đồng nhất (nucleotide) và tương đồng (amino acid) giữa gen GP5 của virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam với các chủng của thế giới.
3. Xác định mối quan hệ phả hệ của virus PRRS Việt Nam với một số
chủng của thế giới trên cơ sở dữ liệu gen GP5.
2.2 Nguyên liệu
Mẫu bệnh phẩm phân lập từ:
- Dịch phổi của lợn bị nhiễm PRRS tại Hải Dương năm 2007 sau đĩ
được chuyển lên mơi trường tế bào thích hợp, ký hiệu: TX196.
- Phế quản của lợn chứa virus PRRS tại một tỉnh miền Trung năm 2007, ký hiệu mẫu: TXMT1.
Mẫu được bảo quản ở -700C.
2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hố chất nghiên cứu
2.3.1 Dụng cụ, trang thiết bị
- Máy PCR (máy PTC-100) của MJ. Research Inc. Máy ly tâm lạnh. - Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- DOC (Wealtech- Mỹ).
- Bộđiện di DNA (Bio-Rad).
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………39
- Lị vi sĩng Samsung. - Box Laminair vơ trùng.
- Tủ lạnh -200C và -700C (SANYO - Nhật Bản).
- Bộ pipetman (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) và đầu cơn các loại, đĩa Petri, lọđựng mơi trường, ống nuơi vi khuẩn,...
2.3.2 Hĩa chất
- Hố chất bao gồm:
+ Yeast Extract và trypton (DIFCO-Mỹ). + EDTA, SDS, Tris-HCl (Sigma-Mỹ). + Acid acetic (Merck-ðức).
+ X-gal (Sigma-Mỹ).
+ Kanamycin (Merck-ðức). + Agar (Sigma-Mỹ).
+ Agarose (Sigma-Mỹ). + Cồn tuyệt đối.
+ BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ).
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số “QIAamp Viral RNA Mini Kit”. - Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR.
- Bộ kit tách dịng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen).
- Bộ kit tách plasmid tái tổ hợp “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng BIONEER cung cấp.
- BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ).
- Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng QIAGEN cung cấp: QIAquick PCR Purification kit.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………40
- Các mồi dùng cho phản ứng RT-PCR đặt của hãng Sigma-Mỹ. - Các loại enzyme giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI (BioLabs - Mỹ).
2.3.3 Dung dịch sử dụng trong tách dịng
Dung dịch giàu dinh dưỡng SOC: Trypton: 20g/l; dịch chiết nấm men: 5g/l; NaCl: 10mM; KCl: 2,5mM; MgCl2: 10mM; MgSO4: 10mM; glucose: 20 mM.
Mơi trường LB (Luria-Bertani): 1% Trypton; 0,5% cao nấm men; 1% NaCl.
Mơi trường chọn lọc: mơi trường LB đặc: thành phần như mơi trường LB và bổ sung thêm agar 1,5%, Kanamycin 50 µg/ml, 40 µl X-gal (20mg/ml).
2.3.4 Các dung dịch dùng đểđiện di trên thạch agarose
- Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100ml): Tris-kiềm: 24,2%; Acid axetic: 5,71 ml; EDTA 0,5M (pH=8,0): 10 ml.
- Dung dịch đệm TAE 1X: pha lỗng từ TAE 50X.
- ðệm tra mẫu (6X) (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25%; Glycerol: 30%.
- Dung dịch nhuộm gel: ethidium bromide (EtBr): 0,5 mg/ml.
2.4 Phương pháp nghiên cứu
Thực hiện theo quy trình như sơ đồở Hình 2.1
2.4.1 Tách chiết RNA tổng số
- Mục đích: Thu nhận RNA hệ gen của virus PRRS với hàm lượng cao, và đảm bảo độ tinh khiết làm khuơn cho phản ứng RT-PCR.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………41 THU NHẬN MẪU BỆNH PHẨM TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ THỰC HIỆN PHẢN ỨNG RT-PCR DỊNG HĨA SẢN PHẨM RT-PCR GIẢI TRÌNH TRÌNH TỰDNA PLASMID TÁCH DỊNG
TRUY CẬP NGÂN HÀNG GEN
XỬLÝ THÀNH PHẨM VÀ THU NHẬN CHUỖI GEN
PHÂN TÍCH, ðỐI CHIẾU, SO SÁNH ðẶC TÍNH SINH HỌC
PHÂN TỬ
XÁC ðỊNH PHẢHỆNGUỒN GỐC PHÁT SINH CHỦNG LOẠI, XÁC ðỊNH TƯƠNG ðỒNG KHÁNG NGUYÊN - MIỄN DỊCH
Hình 2.1. Sơđồ quy trình nghiên cứu
- Tiến hành: Chúng tơi sử dụng bộ hĩa chất QIAamp Viral RNA kit (QIAGEN) để tách chiết RNA tổng số (gồm cả RNA của virus và của tế
bào chủ). Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất với quy trình tĩm tắt như sau:
Bước 1: Lấy 560 µl AVL/carrier RNA cho vào ống Eppendorf 2,0 ml. Bước 2: Thêm 140 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm vào ống Eppendorf đã chứa sẵn AVL, trộn đều trên máy vortex 15 giây, đểở nhiệt độ phịng 10 phút.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………42
Bước 3: Thêm 560 µl cồn tuyệt đối, vortex 15 giây.
Bước 4: Chuyển 630 µl hỗn dịch trên sang cột cĩ màng lọc (QIAamp Mini Spin colum), ly tâm với tốc độ 8.000 vịng/phút trong 1 phút. Thu cột, bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Chuyển nốt 630 µl hỗn dịch cịn lại sang cột, và thực hiện như
bước 4.
Bước 6: Thêm 500 µl đệm AW1 vào cột, ly tâm 8.000 vịng/phút trong 1 phút. Thu cột, bỏ dịch ở dưới.
Bước 7: Thêm 500 µl đệm AW1 vào cột, ly tâm 13.000 vịng/phút trong 1phút. Bỏ dịch phía dưới, và ly tâm lại một lần nữa với tốc độ 13.000 vịng/phút trong 1 phút để làm khơ hồn tồn màng lọc.
Bước 8: Chuyển cột ở trên sang ống Eppendorf 1,5 ml sạch, thêm 60 µl
đệm AVE vào cột để thơi RNA, ly tâm 13.000 vịng/phút trong 1 phút thu dịch ở dưới được RNA tổng số. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -200C hoặc -800C.
2.4.2 Kỹ thuật điện di để kiểm tra RNA tổng số
Kiểm tra RNA tổng số trên thạch (gel) agarose nồng độ 0,8-1,5%, trong
điện trường hiệu điện thế 100V, cường độ 250mA, trong thời gian 30-35 phút. Do mang điện tích âm, DNA của sản phẩm RT-PCR sẽ dịch chuyển từ cực âm
đến cực dương. Chỉ thị phân tử (DNA Marker) được dùng là DNA của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn HindIII [λ(HindIII)] tạo thành 8 phân đoạn cĩ độ dài gồm: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,5 kb; 4,3 kb; 2,3 kb; 2,0 kb; 0,564 kb và 0,125 kb, với lượng sử dụng là 7-10 µl. Nhờ chỉ thị phân tử này mà người ta cĩ thể xác định được độ dài của đoạn DNA cần nghiên cứu [4].
Sau khi kết thúc, đưa bản gel vào khay nhuộm Ethidium bromide để
nhuộm, đặt trên máy lắc 100 vịng/phút trong 10 phút, sau đĩ đưa bản gel rửa sơ bộ qua nước, rồi đặt vào máy soi gel, cĩ nguồn tia cực tím xuyên qua (máy soi gel DOLPHIN của hãng Wealtec, Mỹ) và chụp ảnh lưu giữ mẫu kiểm tra.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………43
2.4.3 Phản ứng RT-PCR
2.4.3.1 Thiết kế mồi
Sơ đồ hệ gen và giải mã vùng mã hố protein chức năng của virus gây Hội chứng hơ hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) polyA (15353bp) TX3F 5 5 5 5’’’’UTRUTRUTRUTR
ORF2-3-4-5-6(M)-N ORF1a ORF1b TXGPR ORF6(M) GP2 GP3 GP4 GP5 N chủng GD-CN (EU109503) (1,1 kb) Gen GP5 (603bp)
Hình 2.2. Sơđồ vị trí ORF5 vùng mã hố protein chức năng của virus PRRS
Việc thiết kế mồi nhân vùng gen GP5-M thu nhận tồn bộ gen GP5
được tiến hành dựa theo đặc điểm cấu trúc của hệ gen của PRRSV và những trình tự hệ gen PRRSV đã biết được lưu giữ trong Ngân hàng gen thế giới, theo sơđồ sau (Hình 2.2).
Dựa trên sơ đồ hệ gen và thành phần cấu trúc gen GP5 của các chủng PRRSV đã được giải mã trước đây của thế giới, chúng tơi thiết kế các đoạn mồi cho vùng mã hố protein chức năng của PRRS, trong đĩ cĩ cặp mồi TX3F và TXGPR đặc hiệu để nhân đoạn vùng gen GP5 (ORF5) - M (ORF6),
độ dài khoảng 1,1 kb, cĩ thành phần nhưở Bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần nucleotide của các mồi dùng trong phản ứng RT-PCR Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’->3’) Tm (0C) Nồng độ sử dụng ðộ dài của sản phẩm thu được TX3F AGGTGGGCAACCGTTTTAG 53,8 10 pM TXGPR TTTCTGCCACCCAACACGAG 58,0 10 pM 1,1 kb
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………44
Trên sơ đồ bố trí, cặp mồi cho phép thu nhận vùng gen được nhân đoạn giữa hai mồi cĩ độ dài khoảng 1,1 kb cĩ chứa gen GP5 và gen M. Từ chuỗi nucleotide thu được đĩ, chúng tơi sử dụng phân tích riêng biệt gen GP5 và gen M, mà trong luận văn này, phân tích tồn bộ gen GP5 cĩ độ dài 603 bp, là mục tiêu nghiên cứu của chúng tơi.
2.4.3.2 Thực hiện phản ứng RT-PCR một bước
* Mục đích: Thu nhận một lượng lớn các phân tử DNA của vùng gen