Chuyển nạp sản phẩm RT- PCR vào tế bào E. coli chủng DH5α-T1 và tiến hành trải đĩa trên mơi trường LB agar cĩ bổ sung kanamycin và X-gal, để ở 370C qua đêm.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………54
Hình 3.3. ðĩa nuơi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh
Chọn lọc các khuẩn lạc trắng (cĩ khả năng chứa đoạn DNA sản phẩm RT-PCR được gắn nối vào DNA plasmid và được chuyển nạp vào tế bào E. coli) nuơi cấy vào mơi trường LB lỏng, tốc độ lắc 200 vịng/phút ở 370C qua đêm. Tế
bào tái tổ hợp được thu lại bằng cách ly tâm và tách chiết DNA plasmid tái tổ
hợp bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep (hãng Bioneer, Hàn Quốc), kiểm tra sản phẩm DNA plasmid bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn EcoRI và điện di trên thạch agarose 1%. Kết quảđược trình bày ở Hình 3.4.
6 5 4 3 2 1 M 3,9 kb 1,1 kb 4,3 kb 2 kb 564 kb
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra DNA của gen GP5 từ plasmid tái tổ hợp
Ghi chú: Giếng M là chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thểλđược cắt bằng HindIII. Giếng 1, 2, 3 là sản phẩm DNA plasmid tách dịng cĩ chứa gen GP5 của TXMT1 sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI.
Giếng 4, 5, 6 là sản phẩm DNA plasmid tách dịng cĩ chứa gen GP5 của TX196 sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………55
Trên Hình 3.4 cho thấy xuất hiện hai băng sáng ở cả 6 giếng. Do vector được bố trí hai điểm cắt của enzyme EcoRI tại hai đầu biên của
đoạn DNA gài vào, nên khi cắt bằng EcoRI sẽ cho ra 2 băng DNA: một
đoạn cĩ kích thước 3,9 kb của vector và một đoạn 1,1 kb của DNA gài vào. Như vậy, chứng tỏ đoạn DNA cĩ chứa gen GP5 của TX196 và TXMT1 đã được gài vào vector tách dịng thành cơng.
3.4 Kết quả giải trình tự gen GP5 của các chủng TX196 và TXMT1
Sau khi thu nhận được dịng plasmid tái tổ hợp, chúng tơi sử dụng DNA của các plasmid tái tổ hợp làm nguyên liệu cho phản ứng giải trình tự để thu nhận chuỗi nucleotide của vùng gen GP5-M, trong đĩ cĩ tồn bộ
chuỗi gen GP5. Quá trình giải trình tự được thực hiện trên máy ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (ABI-3100 automated sequencer) của hãng ABI (Mỹ), cĩ tại Viện Cơng nghệ sinh học. Kết quả được biểu thị bằng chương
trình Chromas, thể hiện ở Hình 3.5.
Hình 3.5 cho thấy chất lượng giải trình tự tốt, mỗi đỉnh màu của
giản đồ (chromatogram) đều xác nhận một loại nucleotide, chứng tỏ chuỗi nucleotide của vùng gen GP5-M thu nhận sau quá trình dịng hĩa cĩ chất lượng tốt, được giải trình tự hồn chỉnh.
Chuỗi nucleotide thu được sau khi giải trình tự được xử lý bằng chương trình SeqEd1.03, sau đĩ sử dụng chương trình AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh để so sánh, kết quả thu được chuỗi nucleotide cĩ độ dài 1112 bp giới hạn giữa hai mồi TX3F-TXGPR. Sau khi phân tích, chúng tơi thu
được tồn bộ gen GP5 (cĩ độ dài 603 bp) và sử dụng chuỗi gen GP5 để
phân tích. Bằng chương trình BLAST so sánh với trình tự các chuỗi gen GP5 (ORF5) của virus PRRS đã được cơng bố trong Ngân hàng gen chúng tơi khẳng định đoạn DNA độ dài 603 bp này từ chủng TMTX1 và
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………56
TX196 của Việt Nam chính xác là gen GP5. Trình tự nucleotide và amino acid của gen GP5 (chủng TXTM1 và TX196) được trình bày ở Hình 3.6.
Hình 3.5. Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotide của đoạn gen GP5 chủng TX196 và TXMT1
Chú thích: Các nucleotide tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi đọc bằng tia lase cho hiển thị Adenine cĩ màu xanh lá cây (green), Thymine cĩ màu đỏ (red), Guanine cĩ màu đen (black) và Cytosine cĩ màu xanh nước biển (blue).
TX196
TXMT1 TX196
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………57 PRRS Vietnam (ORF5-gen GP5) chủng TX196 30 60 90 ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTATCTTGCTGTGCTCGTCAAC M L G K C L T A C C C S R L L F L W C I V P F Y L A V L V N> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 120 150 180 GCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTT A S N N N S S H I Q L I Y N L T L C E L N G T D W L A Q K F> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 210 240 270 GACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGCCATTTCCTTGACACA D W A V E T F V I F P V L T H I V S Y G A L T T S H F L D T> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 300 330 360 GTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTG V G L A T V S T A G Y Y H G R Y V L S S I Y A V C A L A A L> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 390 420 450 ATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTTTGGACACTAAAGGC I C F V I R L A K N C M S W R Y S C T R Y T N F L L D T K G> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 480 510 540 AGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTG R L Y R W R S P V I V E K G G K V E V E G H L I D L K R V V> _____________________________________ORF5(GP5)-TX196______________________________________> 570 600 CTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAG L D G S A A T P L T R V S A E Q W G R L *> ________________________ORF5(GP5)-TX196______________________> PRRS Vietnam (ORF5-gen GP5) chủng TXMT1 30 60 90 ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTATCTTGCTGTGCTCGTCAAC M L G K C L T A C C C S R L L F L W C I V P F Y L A V L V N> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 120 150 180 GCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTT A S N N N S S H I Q L I Y N L T L C E L N G T D W L A Q K F> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 210 240 270 GACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCACTCACCACCAGTCATTTCCTTGACACA D W A V E T F V I F P V L T H I V S Y G A L T T S H F L D T> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 300 330 360 GTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGCAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTG V G L A T V S T A G Y Y H G R Y V L S S I Y A V C A L A A L> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 390 420 450 ATTTGCTTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTCTGGACACTAAGGGC I C F V I R L A K N C M S W R Y S C T R Y T N F L L D T K G> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 480 510 540 AGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTG R L Y R W R S P V I V E K G G K V E V E G H L I D L K R V V> ______________________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________________________> 570 600 CTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAG L D G S A A T P L T R V S A E Q W G R L *> _________________________ORF5(GP5)-TXMT1_____________________>
Hình 3.6. Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 thu nhận sau giải trình tự
Chú thích: Dịng trên là trình tự nucleotide, dịng dưới là trình tự amino acid, được
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………58
Kết quả giải trình tự và phân tích cấu trúc đoạn gen của TX196 và
TXMT1 (Hình 3.6) cho thấy đĩ là gen GP5 của virus PRRS, cĩ độ dài 603 nucleotide mã hố cho 200 amino acid. Như vậy, việc tách chiết RNA tổng số, nhân đoạn, dịng hố và giải trình tự chính xác gen GP5 đã được thực hiện thành cơng. Chuỗi gen GP5 này là cơ sở để chúng tơi so sánh, đánh giá, xác
định mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc giữa các chủng TX196 và TXMT1 với các chủng PRRSV đã được phân lập trước đây tại Việt Nam và thế giới.
3.5 Kết quả truy cập Ngân hàng gen
Chuỗi gen GP5 cĩ kích thước 603 bp của 2 chủng virus PRRS đang nghiên cứu (TX196 và TXMT1) được dùng làm chuỗi truy cập trong chương trình BLAST của Ngân hàng gen quốc tế nhằm tìm kiếm các chuỗi đích đã
được đăng ký trong Ngân hàng gen dựa vào mức độ tương ứng về nucleotide. Kết quả truy cập được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1 cho thấy các chủng virus PRRS cĩ kết quả tương đồng về
chuỗi gen GP5 với chủng TX196 và TXMT1 khi truy cập Ngân hàng gen (GenBank). ðiều đĩ cho phép chúng tơi khẳng định một lần nữa: chuỗi gen mà chúng tơi phân lập được là chuỗi gen GP5 của virus PRRS. Gen GP5 của chủng TX196 và TXMT1 cĩ mức độ tương đồng rất cao với các chủng cĩ nguồn gốc Trung Quốc, đặc biệt đĩ là các chủng cĩ độc lực cao mới phân lập gần đây [62]; [64]; [38] và một chủng của Việt Nam đã cơng bố [29]. Chuỗi gen GP5 của PRRSV gây bệnh phân lập ở Việt Nam ký hiệu 07QN, đã đăng ký năm 2008, được sử dụng để phân tích các chủng của Trung Quốc và Việt Nam gây bệnh "Tai xanh" năm 2007 [29].
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………59
Bảng 3.1. Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế, sử dụng chuỗi nucleotide của gen GP5 của chủng TXMT1 làm chuỗi truy cập
Sốđăng ký Chủng virus cĩ độđồng nhất ðiểm Tổng số % so sánh Giá trị E % đồng
nhất
Ghi chú: Chương trình sử dụng là BLAST của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Dãy số và ký tự bên trái là sốđăng ký; ở giữa là tên virus; năm dãy cuối cho biết mức độ chính xác của kết quả theo phân tích tin-sinh học trong chương trình BLAST.
3.6 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 với một số chủng trên thế giới
3.6.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide
ðể nghiên cứu cụ thể hơn mức độ biến đổi thành phần nucleotide của gen GP5 và thành phần amino acid do gen đĩ mã hố ở chủng TX196 và TXMT1, chúng tơi chọn lựa một số chủng virus PRRS đại diện đã được phân lập trước đây, gồm các chủng PRRS phân lập ở Trung Quốc và Bắc Mỹ và một số chủng châu Á khác (Bảng 2.4) cĩ đặc tính thích ứng gây bệnh trên lợn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………60 Kết quả được lựa chọn và so sánh bằng chương trình GENEDOC2.5, thể hiện ở Hình 3.7. A. GP5-NUCLEOTIDE * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 * 120 TX196-VN : ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGTTGCTCGCGATTGCTTTTTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTATCTTGCTGTGCTCGTCAACGCCAGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTT : 122 TXMT1-VN : ... : 122 07QN-VN : ...C... : 122 07NM-CN : ... : 122 GD-CN : ... : 122 HUB1-CN : ... : 122 HUB2-CN : ... : 122 HEN13-CN : ... : 122 HUN4-CN : ... : 122 JSyx-CN : ... : 122 JXA1-CN : ... : 122 NX06-CN : ... : 122 BQ-CN : ...C... : 122 YN02-CN : ...A...A...C...C... : 122 S1-CN : ...A...A...GA...A...C...G.T...C...G...G...C...C.A...C. : 122 PRRSV01-CN : ...A...A...GA...A...C...G.T...C...G...G...C...C.A...C. : 122 Fuzhou-CN : ...A...A...G...A...C...G.T...C...C...G...G...C...C.A...C. : 122 CH1a-CN : ...A...A..G...C...G.T...A..G...G...T... : 122 07NP4-TL : ...A...G...C...C...T.T...A...C..G...T... : 122 LMY-KR : ...A...G...A...CT.G.T...T..C.A...G...A...G..G...AA..T.A...C. : 122 MLV-USA : ...A...A...G...A...C...G.T...C...G...G...C...C.A...C. : 122 MLVvac-USA : ...A...A...G...A...C...G.T...C...G...G...C...C.A...C. : 122 PrimePac-U : ...A...G.T..C...C...T...G.T...T...G..G...T.A... : 122 VR2332-ATC : ...A...A...G...C...G.T...C...G...G...C...C.A...C. : 122 * 140 * 160 * 180 * 200 * 220 * 240 TX196-VN : GATTTATAACTTAACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGACTTTTGTCATCTTCCCCGTGTTGACTCACATTGTTTCCTATGGGGCAC : 244 TXMT1-VN : ... : 244 07QN-VN : ...T... : 244 07NM-CN : ... : 244 GD-CN : ...A... : 244 HUB1-CN : ... : 244 HUB2-CN : ... : 244 HEN13-CN : ... : 244 HUN4-CN : ... : 244 JSyx-CN : ... : 244 JXA1-CN : ... : 244 NX06-CN : ... : 244 BQ-CN : ... : 244 YN02-CN : ...T... : 244 S1-CN : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 PRRSV01-CN : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 Fuzhou-CN : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 CH1a-CN : ...G...TA.C...T... : 244 07NP4-TL : ...G...C...T..GA...A..TA.C...T...G...T..T..T..AC.A...CA...T..T. : 244 LMY-KR : ...C...G...A..TA.C.G...G...TG...T..T..T..T..A...C..T...T..C. : 244 MLV-USA : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 MLVvac-USA : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 PrimePac-U : ...G...T...TA.T...T...G...T..T...C...C...T.... : 244 VR2332-ATC : ...C...G...A..TA.C...T...G...T...T...C...T..C. : 244 * 260 * 280 * 300 * 320 * 340 * 360 TX196-VN : TCACCACCAGCCATTTCCTTGACACAGTTGGTCTGGCCACTGTGTCCACCGCCGGATATTATCACGGGCGGTATGTCTTGAGTAGCATTTACGCAGTCTGTGCTCTGGCTGCGCTGATTTGC : 366 TXMT1-VN : ...T...C... : 366 07QN-VN : ... : 366 07NM-CN : ... : 366 GD-CN : ... : 366 HUB1-CN : ... : 366 HUB2-CN : ... : 366 HEN13-CN : ... : 366 HUN4-CN : ... : 366 JSyx-CN : ... : 366 JXA1-CN : ... : 366 NX06-CN : ... : 366 BQ-CN : ... : 366 YN02-CN : ... : 366 S1-CN : ....T..T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366 PRRSV01-CN : ....T..T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366 Fuzhou-CN : ....T..T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366 CH1a-CN : ...T...G.T...C...G...T... : 366 07NP4-TL : ...A...C..C....TT.T...T.T..G...C...T..G.C... : 366 LMY-KR : .A...T...C...C...T...T...T...T.GT...T...G...C...T... : 366 MLV-USA : ....T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366 MLVvac-USA : ....T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366 PrimePac-U : .A...C...TT...T...G.T...T...C...C...G...C...T.A... : 366 VR2332-ATC : ....T...C.C.T.A.T...T...G.T.GT...C.A...C...G...C...T...C.... : 366
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………61 * 380 * 400 * 420 * 440 * 460 * 480 TX196-VN : TTTGTCATTAGGCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTTTGGACACTAAAGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAA : 488 TXMT1-VN : ...C...G... : 488 07QN-VN : C...C...G...A... : 488 07NM-CN : ...C...G... : 488 GD-CN : ...C...G... : 488 HUB1-CN : ... : 488 HUB2-CN : ... : 488 HEN13-CN : ...C...G... : 488 HUN4-CN : ...C...G... : 488 JSyx-CN : ...C...G... : 488 JXA1-CN : ...C...G... : 488 NX06-CN : ...C...G... : 488 BQ-CN : ...C...G...A... : 488 YN02-CN : ...C...G...A... : 488 S1-CN : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...G...T...CA.A... : 488 PRRSV01-CN : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...G...T...CA.A... : 488 YN02-CN : ...C...G...A... : 488 Fuzhou-CN : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...G...T...CA.A... : 488 CH1a-CN : ..C...C...G...T...A... : 488 07NP4-TL : ..C...T.G...A...T...C...G....A...A...T...CA.A... : 488 LMY-KR : ..C...T...A...T...C.A..T..C..G...C...T...A.A... : 488 MLV-USA : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...G...T...CA.A... : 488 MLVvac-USA : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...G...T...CA.A... : 488 PrimePac-U : ..C...T.G...T...A..C...C...T...C...G...T...CA.A... : 488 VR2332-ATC : ..C...T....A...T...G.G...T...C...G...T...CA.A... : 488 * 500 * 520 * 540 * 560 * 580 * 600 TX196-VN : AGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGTCACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAG : 603 TXMT1-VN : ... : 603 07QN-VN : ...T...G... : 603 07NM-CN : ... : 603 GD-CN : ... : 603 HUB1-CN : ... : 603 HUB2-CN : ... : 603 HEN13-CN : ... : 603 HUN4-CN : ... : 603 JSyx-CN : ... : 603 JXA1-CN : ...T... : 603 NX06-CN : ... : 603 BQ-CN : ... : 603 YN02-CN : ... : 603 S1-CN : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 PRRSV01-CN : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 Fuzhou-CN : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 CH1a-CN : ...G...A...T... : 603 07NP4-TL : ...C.GA...G..A...T..C...T..A...A...C.... : 603 LMY-KR : .A....C..A...G...A..A...C...A...C...G...A..CT... : 603 MLV-USA : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 MLVvac-USA : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 PrimePac-U : ...A...A.C..T...A...G...C.... : 603 VR2332-ATC : .A....C..A...T...A...T...A...CT... : 603 Hình 3.7. So sánh thành phần nucleotide 603 bp chuỗi gen GP5 của virus
gây Hội chứng sinh sản và hơ hấp (PRRSV) ở lợn phân lập tại Việt Nam với một số chủng của thế giới
Ghi chú: Sai khác trình tự của các chủng PRRSV so với chủng TX196-VN (Việt Nam) biểu thị bằng chính ký hiệu nucleotide; dấu (.) biểu thị giống với nucleotide của chủng TX196-VN; ký hiệu các chủng được liệt kê ở Bảng 2.4
Kết quả so sánh trên Hình 3.7 về thành phần nucleotide của hai gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 chúng tơi nghiên cứu với gen tương ứng của các chủng PRRS trên thế giới được lựa chọn so sánh, thấy rằng:
- Hai đoạn gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 cĩ cùng độ dài là 603 bp với các chủng phân lập từ Trung Quốc và chủng Bắc Mỹ.
- Kết quả cho thấy cĩ tất cả 145 vị trí sai khác về nucleotide giữa 24 chủng so sánh. ðiều đặc biệt là các chủng của Trung Quốc và Việt Nam mới phát hiện và phân lập gần đây (14 chủng: từ 1-14 ở Hình 3.7, là các chủng thuộc nhĩm cĩ độc lực cao, gây chết lợn với tỷ lệ rất cao [29], chỉ cĩ 14 vị trí
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………62
sai khác về nucleotide so với các chủng được phát hiện và phân lập trước đĩ (10 chủng) cĩ tới 125 vị trí sai khác (Hình 3.7). Như vậy, trong các chủng so sánh ở nghiên cứu này, cĩ thể phân các chủng thành hai nhĩm, nhĩm cổ điển (nhĩm cũ) cĩ độc lực thấp, gồm các chủng: S1-CN, PRRSV01-CN, Fuzhou- CN, CH1a-CN, 07NP4-TL, LMY-KR, MLV-USA, MLVvac-USA, PrimePac(a)-USA, VR2332-ATCC; và nhĩm độc lực cao (nhĩm mới), gồm các chủng: TX196-VN, TXMT1-VN, 07QN-VN, 07NM-CN, GD-CN, HUB1-CN, HUB2-CN, HEN13-CN, HUN4-CN, Jsyx-CN, JXA1-CN, NX06- CN, BQ-CN, YN02-CN. Hai chủng trong nghiên cứu của chúng tơi phân lập tại Hải Dương và một tỉnh miền Trung năm 2007, nằm trong nhĩm mới cĩ
độc lực cao.
- Trình tự gen GP5 của chủng TX196 cĩ 4 sai khác về thành phần nucleotide so với TXMT1 ở các vị trí: 255 (C ↔ T), 327 (T↔C), 436 (T↔C), 447 (A ↔ G).
- Gen GP5 của hai chủng chúng tơi nghiên cứu cĩ sự sai khác rất ít so với một số chủng Trung Quốc và một chủng Việt Nam phân lập gần đây.
+ So với chủng 07QN-VN (Việt Nam) thì TXMT1 cĩ 6 sự sai khác
ở các vị trí 87 (T ↔ C), 183 (C ↔ T), 367 (T ↔ C), 471 (G ↔ A), 528 (C ↔
T), 579 (A ↔ G); TX196 cĩ 8 vị trí sai khác, ngồi 6 vị trí trên cịn thêm 2 vị
trí: 436 (T ↔ C) và 447 (A ↔ G).
+ So với 11 chủng cĩ độc lực cao khác thì gen GP5 của TX196 cĩ 10 vị trí sai khác: 8 (G ↔ A) (YN02-CN), 12 (G ↔ A) (YN02-CN), 87 (T ↔
C) (BQ-CN, YN02-CN), 103 (A ↔ C) (YN02-CN), 147 (G ↔ A) (GD-CN), 204 (C ↔ T) (YN02-CN), 436 (T ↔ C) và 447 (A ↔ G) (ở hầu hết các chủng), 471 (G ↔ A) (BQ-CN, YN02-CN), 587 (A ↔ T) (JXA1-CN); TXMT1 cĩ 8 vị trí sai khác: 8 (G ↔ A) (YN02-CN), 12 (G ↔ A) (YN02-
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ………63
CN), 87 (T ↔ C) (BQ-CN, YN02-CN), 103 (A ↔ C) (YN02-CN), 147 (G ↔
A) (GD-CN), 204 (C ↔ T) (YN02-CN), 471 (G ↔ A) (BQ-CN, YN02-CN), 587 (A ↔ T) (JXA1-CN).
+ ðặc biệt, chủng TX196 khơng cĩ sự sai khác nào về nucleotide so