Luận văn khảo sát đặc tính sinh học phân tử của một số chủng virus viêm gan vịt cường độc phân lập được trên đàn vịt ở một số địa phương và so sánh với chủng virus vacxin DH EG 2000

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------------------- LÊ VĂN BIÊN KHẢO SÁT ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG ðỘC PHÂN LẬP ðƯỢC TRÊN ðÀN VỊT Ở MỘT SỐ ðỊA PHƯƠNG VÀ SO SÁNH VỚI CHỦNG VIRUS VACXIN DH – EG – 2000 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI – 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, do chính tôi thực hiện và chưa từng ñược công bố hay bảo vệ trong một học vị nào. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 8 tháng 9 năm 2011 Tác giả luận văn Lê Văn Biên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… ii LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập và nghiên cứu, ñến nay tôi ñã hoàn thành khóa học. Nhân dịp hoàn thành luận văn thạc sỹ nông nghiệp chuyên ngành Thú y cho phép tôi ñược bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới các Thầy, Cô giáo. Xin ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất ñến Thầy TS. Nguyễn Bá Hiên, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội, người thầy ñã tận tình hướng dẫn trực tiếp và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi ñược học tập, thực hành thí nghiệm và giúp ñỡ tôi hoàn thành ñề tài nghiên cứu này. ðồng thời tôi cũng bày tỏ sự biết ơn ñến các Thầy, Cô trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Khoa Thú y – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội và các anh chị phòng Thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y (B213 & B214) ñã nhiệt tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện giúp tôi hoàn thành ñề tài một cách tốt nhất. Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến cơ quan, những người thân trong gia ñình, bạn bè ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày 8 tháng 09 năm 2011 Học viên Lê Văn Biên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Các chữ cái viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii 1. MỞ ðẦU 49 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Bệnh viêm gan virus ở vịt 3 2.2. Một số ñặc tính của virus viêm gan vịt 12 2.3 Sinh học phân tử của virus viêm gan vịt 14 2.4 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 19 2.5 Các kỹ thuật sinh học phân tử 20 2.6 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan vịt trên thế giới và việt nam 24 3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Nội dung nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.3. Phương pháp nghiên cứu 31 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 4.1. Kết quả phân lập virus viêm gan vịt cường ñộc 46 4.1.1. Phân lập trên phôi vịt 46 4.1.2 Nghiên cứu biến ñổi bệnh lý của phôi vịt khi phân lập virus. 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… iv 4.2 Kết quả tách chiết rna tổng số 52 4.3 Kết quả phản ứng rt-pcr 53 4.4 Kết quả dòng hóa và tách dòng sản phẩm 56 4.4.1 Kết quả dòng hóa sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli 56 4.4.2 Kết quả kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp 58 4.5 Kết quả giải trình tự nucleotide và axit amin của gen kháng nguyên vp1 ở các chủng virus viêm gan vịt phân lập ñược và chủng virus vacxin dh-eg-2000 59 4.6 So sánh sự ñồng nhất nucleotide, sự tương ñồng amino acid của vùng gen vp1 giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ñộc nb, dn1, nc và chủng virus vacxin dh-eg-2000. 64 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.2 ðề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… v CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DHV Duck Hepartitis Virus DNA Acid Deoxyribonucleic RNA Acid Ribonucleic VP Viral Protein PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Revese Transcription- Polymerase Chain Reaction EDTA Ethylen Dimine Tetra Acetic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate X-gal 5-Bromo- 4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside Taq Polymerase Thermus aquaticus polymerase LB Luria Bertani-agar UTR Untranslated Region cs Cộng sự tr Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên hình Trang 3.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm viêm gan vịt sử dụng trong nghiên cứu 29 3.2 Các ñoạn mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR 29 3.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 34 3.4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 35 4.1 Kết quả phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt trên phôi vịt 48 4.2 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể của phôi vịt phân lập virus 50 4.3 Tỷ lệ (%) ñồng nhất về nucleotide (trên ñường chéo) và tương ñồng axit amin (dưới ñường chéo) giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ñộc NB, DN1, NC và chủng virus vacxin DH-EG- 2000. 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Tư thế chết ñiển hình của vịt khi bị nhiễm virus viêm gan vịt (a) Gan vịt xuất huyết (b) 7 2.2 Cấu trúc không gian của picornavirus 15 2.3 Sơ ñồ hệ gen và chuỗi polypeptide của virus viêm gan vịt 16 2.4 Mô hình các bước của phản ứng PCR 21 2.5 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 22 3.1 Sơ ñồ vị trí bám của mồi ñể thu nhận ñoạn DNA (~0,8kb) chứa gen VP1 (714bp) và chiến lược giải mã gen VP1 của virus viêm gan vịt bằng cặp mồi DH3F-DH4R (ảnh minh hoạ) 30 3.2 Sơ ñồ qui trình nghiên cứu, lưu giữ và giải mã vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt. 44 4.1 Kiểm tra RNA tổng số tách chiết từ các mẫu 53 4.2 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR (~ 800 bp) của mẫu virus cường ñộc viêm gan vịt DN1, DN2 và NB trên thạch agarose 1,2%. 54 4.3 Kết quả ñiện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của mẫu HY, DH- EG-2000 và NC trên thạch agarose 1%. 55 4.4 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp trên ñĩa thạch (LB-agar 1,5%) có chứa kháng sinh Kanamycin và X-gal, bao gồm các khuẩn lạc xanh và trắng cần chọn lọc. 56 4.5 Kết quả tách dòng vùng gen VP1 của virus viêm gan vịt ñược ñiện di kiểm tra trên thạch agarose 1,2%, các sản phẩm DNA plasmid ñược kiểm tra bằng cách cắt với enzyme EcoRI. 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… viii 4.6 Giản ñồ giải trình tự (chromatogram) thành phần nucleotide của vùng gen VP1 virus viêm gan vịt của các chủng lần lượt là DN2, DN1, NB, HY, DH-EG-2000 và NC Các nucleotide tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye), khi ñọc bằng tia laze cho hiển thị Adenine có màu ñỏ (red), Thymine có màu xanh nước biển (blue), Guanine có màu xanh lá cây (green) và Cystosine có màu ñen (black). 60 4.7 Trình tự Nucleotit và axit amin tương ứng của vùng gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt lần lượt là DN2, DN1, NB, HY, DH-EG-2000 và NC. 64 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Việt Nam là một nước ñang phát triển với ngành nông nghiệp luôn giữ vai trò then chốt nhằm cung cấp lương thực - thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước và từng bước xuất khẩu. Trong ñó ngành chăn nuôi gia cầm, ñặc biệt ngành chăn nuôi vịt trở thành ngành sản xuất hàng hóa quan trọng góp phần vào chương trình xóa ñói giảm nghèo cho bà con nông dân. Xuất phát từ những ñặc ñiểm riêng biệt về ñịa hình và tập quán canh tác ñiều kiện thuận lợi cho việc chăn thả tự nhiên nên vịt là loài thủy cầm ñược người nông dân ưa chuộng vì chúng dễ nuôi, qui mô ñàn ña dạng phù hợp với tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ. Tuy nhiên song song với việc phát triển của ñàn vịt thì dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều và diễn biến rất phức tạp. Một trong những bệnh thường gặp và gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi phải kể ñến bệnh viêm gan vịt, bệnh chỉ xẩy ra ở vịt con dưới 6 tuần tuổi nhưng thường thấy ở vịt con từ 1 – 3 tuần tuổi mà nặng nhất lại ở vịt con từ 1 – 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm, chết lên tới 95 - 100%. Tuy vậy những nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt do virus ở nước ta chưa nhiều, ñặc biệt là nghiên cứu về hệ gen của các chủng virus thuộc các vùng khác nhau ở nước ta. Các nghiên cứu chỉ ra rằng hệ gen của virus gây bệnh viêm gan vịt chứa axit ribonucleic (RNA), sợi ñơn dương có ñộ dài khoảng 7600 – 7700 Nucleotide. Trong hệ gen của virus viêm gan vịt thì vùng ñược quan tâm nhiều nhất là vùng gen mã hóa cho protein cấu trúc VP1. Vùng gen này ñã ñược chứng minh là gen kháng nguyên thiết yếu, nó vừa quyết ñịnh tính kháng nguyên, vừa quyết ñịnh tính gây bệnh của virus (Mulder và cs 2000). Mặt khác, các nghiên cứu gần ñây về hệ gen và sinh học phân tử phân loại virus ñều cho thấy virus viêm gan vịt thuộc về một nhóm mới trong họ