3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus
RNA tổng số là toàn bộ RNA ựược tách chiết từ mẫu nghiên cứu. Muốn thu RNA thì cần loại bỏ DNA, vì nếu lẫn DNA trong hỗn hợp sẽ ảnh hưởng ựến hiệu quả RT-PCR. RNA tổng số này có thể bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt ựộng (RNA thông tin, RNA vận chuyển) của tế bào và virus. Mục ựắch là thu nhận ựược RNA của hệ gen virus viêm gan vịt ựạt hàm lượng cao, ựảm bảo ựủ làm khuôn cho RT-PCR. Tuy nhiên, vì sử dụng cặp mồi ựặc hiệu cho virus khi thu nhận RNA tổng số làm khuôn nên dù lẫn các loại RNA khác thì vẫn thu ựược sản phẩm từ hệ gen virus.
Quy trình chiết tách RNA virus theo KIT QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer (AVL + AVE-carrier RNA ựể dùng cho kit) (5600ộl AVL + 56ộl AVE-carrier RNA cho mẫu)
- Bước 1: Hút 560 ộl dung dịch AVL/carrier vào ống Eppendorf loại 1,5 ml. - Bước 2: Thêm 140 ộl dung dịch mẫu ựã xử lý là nước trứng chứa virus vào ống Eppendorf trên, sau ựó lắc ựều nhanh trong 15 giây rồi ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 10 phút.
- Bước 3: Thêm 560 ộl dung dịch Ethanol (96 - 100oC), lắc ựều nhanh trong 15 giây.
- Bước 4: Chuyển 630 ộl huyễn dịch trên sang cột QIAampspin. Li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút, giữ cột, bỏ nước dưới.
- Bước 5: Lặp lại bước 4.
- Bước 6: Thêm 500 ộl dung dịch AW1, li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
phút, giữ cột, bỏ nước dưới. Sau ựó ly tâm lại thêm một lần nữa 13000vòng/phút, trong 1 phút.
- Bước 8: Chuyển cột sang một ống Eppendorf sạch mới. Thêm 60 ộl dung dịch AVE, ựể ở nhiệt ựộ phòng trong 1 phút. Sau ựó li tâm 8000 vòng/phút, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới. Dịch lỏng bên dưới chắnh là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20oC.