3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
3.3.3.1 Tiến hành phản ứng RT-PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl) 2X Reaction Mix 12.5 Mẫu RNA 5 Primer Forward 0.5 Primer Reverse 0.5 Enzyme 0.5 Nước cất 6 Tổng thể tắch 25
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt ở bảng 3.4.
Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (0C) Thời gian Chu kỳ Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 15 phút 1 Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 1 phút 2
Tổng hợp sợi mới 72 30 giây
35
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
3.3.3.2 điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR
* Chuẩn bị thạch
- Chuẩn bị bình thủy tinh nấu thạch - Thêm 1,2 g thạch Agarose
- Bổ sung 100 ml TBE 1x - Hấp thạch 1000C/ 10Ỗ - để nguội ựến 60 Ờ 700C
- Bổ sung 5 - 8ộl Ethidium bromide, trộn ựều - đổ thạch ra khay gắn lược
- Chờ 30Ỗ cho thạch ựông lại
- Rút lược, cắt thành miếng thạch mong muốn.
* Chạy ựiện di
- đặt thạch vào bể ựiện di
- Dùng pipet hút bỏ hết không khắ tại các giếng thạch
- Trộn 8 ộl sản phẩm RT-PCR với 2 ộl Loading dye và lần lượt tra vào từng giếng
- Tra 7 ộl market/ 1 giếng riêng biệt ựể làm thang ựo
- đậy nắp, nối cực dòng ựiên (màu ựen là cực -, màu ựỏ là cực +) - Cắm ựiện, bật nguồn
- điều chỉnh máy ựiện di chạy ở 120V trong 30 phút
- Quan sát kết quả ựiện di sản phẩm PCR trên máy ảnh gel và chụp ảnh.