3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.5Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen
3.3.5.1 Kỹ thuật gắn sản phẩm RT-PCR và tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm RT-PCR tinh sạch (vùng gen VP1) ựược ựưa vào một vector dẫn truyền Ờ plasmid mang DNA (thường dùng vector pCR 2.1-TOPO) ựể nhân ựoạn gen thành lượng lớn bản sao DNA plasmid (DNA tái tổ hợp). Các DNA plasmid này ựược dùng ựể giải trình tự và lưu giữ nguồn gen.
Dưới xúc tác của enzyme Taq-polymerase, sản phẩm phản ứng RT- PCR sẽ ựược gắn thêm nucleotit Adenin (A) ở ựầu 3Ỗ. Vector pCR 2.1-TOPO ựược thiết kế có ựầu lồi Thymin (T). Do vậy, khi nối ựoạn DNA (sản phẩm của RT-PCR) với vector pCR 2.1-TOPO thì ựầu lồi A của sản phẩm sẽ ựược gắn vào ựầu lồi T của vector theo nguyên tắc bổ sung nhờ enzyme nối T4- DNA ligase ựể tạo nên vector tái tổ hợp mang ựoạn AND ngoại lai.
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR (gen VP1) ựược kiểm tra trên thạch agarose 1% nếu có các sản phẩm có ựộ dài như dự kiến sẽ ựược gắn vào vector pCR 2.1-TOPO của bộ kit TOPO-TA cloning (Invitrogen). Phản ứng ựược tiến hành như sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch - Nước tinh khiết 2.5 ộl - Vector pCR 2.1-TOPO 0.5 ộl - Sản phẩm RT-PCR 2 ộl - Dung dịch muối 1 ộl Tổng thể tắch 6 ộl
để hỗn hợp trên ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút. Bảo quản mẫu ở -200C.
3.3.5.2 Chuyển nạp vào tế bào khả biến E.coli
Sau khi sản phẩm RT-PCR ựược gắn vào plasmid pCR2.1-TOPO, plasmid tái tổ hợp ựược chuyển nạp vào tế bào khả biến thắch ứng DH5α-T1 của hãng Invitrogen. Qui trình chuyển nạp vắn tắt như sau:
Bước 1: Lấy 3 ộl hỗn hợp nối plasmid tái tổ hợp ựem trộn với 100 ộl tế bào khả biến E.coli DH5α-T1 (108 - 109 tế bào/ml), ủ trong ựá lạnh 45 phút, ựể cho plasmid xuyên màng và chuyển nạp vào tế bào.
Bước 2: Hỗn hợp ựược xử lý sốc nhiệt (heat-shock) ở 420C trong 45 giây, rồi ngay lập tức chuyển qua ủ ựá trong 2 phút.
Bước 3: Bổ sung 200 ộl môi trường dinh dưỡng SOC, lắc các ống tế bào với tốc ựộ 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 370C ựể các tế bào ổn ựịnh và nhân lên trong vài chu kỳ ựầu.
Bước 4: Sau khi ủ xong, lấy khoảng 200 ộl dung dịch ựã ựược chuyển nạp trải ựều trên ựĩa thạch LB-agar 1,5% (Luria-Bertani agar) có bổ sung 100 ộl kháng sinh Kanamycin (40mg/ml) và 200 ộl X-gal (40mg/ml).
Bước 5: Các ựĩa Petri chứa thạch LB ựược ựặt trong tủ ấm 370C/18 - 20 giờ, sau ựó ựể ở 40C/2-3 giờ cho việc phân biệt màu ựược rõ ràng.
3.3.5.3 Chọn lọc và nuôi cấy vi khuẩn tái tổ hợp
Sau 18 Ờ 20 giờ, các ựĩa thạch sẽ ựược lấy ra ựể chọn lọc các vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp thực hiện bằng hai phương pháp: Chọn lọc theo phương pháp kháng kháng sinh (Kanamycin hoặc Ampicillin) nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp ựược bất kỳ vector nào và các loại vi khuẩn tạp nhiễm khác; Và chọn lọc theo phản ứng cơ chất (với X-Gal), nhằm loại trừ những vi khuẩn không chuyển nạp thành công vector tái tổ hợp. Vi khuẩn tái tổ hợp chứa vector pCR 2.1-TOPO có gen sản xuất enzyme kháng lại kháng sinh (vắ dụ: kanamycin) và gen lacZ ựã bị sản phẩm RT-PCR chèn vào nên không còn gen hoàn chỉnh ựể sản xuất enzyme β-galactosidase, enzyme có tác dụng xúc tác thủy phân một loại hóa chất có tên gọi là X-gal ựể tạo nên các dẫn chất có màu xanh. Vi khuẩn không mang plasmid tái tổ hợp sẽ tạo nên khuẩn lạc màu xanh. Khi sản phẩm ựược nối vào vị trắ nối thành công, thì ựoạn DNA ngoại lai làm bất hoạt gen lacZ không cho nó sản xuất ra enzyme β-galactosidase, và do vậy, vi khuẩn mang
plasmid tái tổ hợp sẽ không có enzyme phân hủy cơ chất X-gal và khuẩn lạc sẽ mang màu trắng khi nuôi trên môi trường có chứa X-gal. Do vậy, khuẩn lạc trắng ựược chọn lọc ựể nuôi cấy.
Nuôi cấy các khuẩn lạc vào môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kanamycin hoặc Ampicillin, thường chọn 3 Ờ 6 khuẩn lạc của mỗi ựĩa thạch. Các ống nuôi cấy ựược lắc ựều nhiệt với tốc ựộ 200 vòng/phút ở 370C trong 18 Ờ 20 giờ ựể cho các tế bào sinh trưởng và nhân lên tạo nhiều bản sao mang vector tái tổ hợp.
3.3.5.4 Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp
Bộ hóa chất ựược chúng tôi sử dụng ựể tách chiết plasmid tái tổ hợp là bộ kit của hãng Bioneet (AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit). Thực hiện tách chiết DNA plasmid nhờ các dung dịch có khả năng ly giải màng tế bào vi khuẩn, loại bỏ DNA hệ gen vi khuẩn khỏi DNA plasmid bằng các loại muối vô cơ có trong dung môi của bộ Kit. Sau ựó, chuyển dung dịch chứa DNA plasmid sang cột lọc có cấu tạo màng lọc tắch ựiện dương (+), chỉ giữ lại DNA plasmid tắch ựiện âm (-) và qua nhiều lần li tâm. Quá trình ựược thực hiện theo các bước sau:
- Bước 1: Lắc ựều lọ nuôi cấy, ựổ vào ống eppendorf sạch loại 2 ml, li tâm 8.000 vòng/phút trong 2 phút. Lặp lại bước này một lần nữa. Dùng pipet hút bỏ nước trong và giữ lại cặn tế bào.
- Thêm 250 ộl buffer, khuấy nhẹ cho tan cặn tế bào.
- Thêm 250 ộl buffer vào hỗn dịch ựể ly giải tế bào (tức là phá màng tế bào), ựảo nhẹ và nhanh, ựậy nắp, lắc xuôi ngược toàn bộ ống vài lần, ựể toàn bộ hỗn dịch trong ống ở nhiệt ựộ phòng trong 4 phút (không ựược quá 5 phút Ờ vì lâu hơn thì dung môi sẽ phá tiếp màng nhân).
- Bước 4: Thêm 350 ộl buffer, lắc nhanh sau ựó li tâm lạnh 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút toàn bộ nước trong chuyển qua cột. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ nước dưới, giữ cột.
- Bước 5: Thêm 500 ộl buffer D (tác dụng rửa màng lọc có DNA của plasmid tái tổ hợp), ựể nhiệt ựộ phòng 5 phút (không ựược ựể quá 5 phút). Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ nước dưới, giữ cột.
- Bước 6: Thêm 700 ộl buffer, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút (lặp lại 2 lần), giữ cột bỏ nước dưới, rồi chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml sạch.
- Bước 7: Thêm 50 ộl buffer, ựể ở nhiệt ựộ phòng 2 phút. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột giữ nước dưới Ờ là dung dịch chứa DNA plasmid.
Ký hiệu mẫu và bảo quản ở - 200C.
3.3.5.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI
Plasmid pCR 2.1-TOPO của hãng Invitrogen có ựộ dài là 3,9 kb. Tại hai ựầu của vùng tiếp nhận DNA ngoại lai ựược bố trắ ựiểm cắt của enzyme giới han EcoRI.
Vị trắ cắt của enzyme EcoRI:
5ỖẦGAATTCẦ3Ỗ 3ỖẦCTTAAGẦ5Ỗ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI thì sẽ có 2 ựoạn DNA: một ựoạn có kắch thước là 3,9 kb của vector pCR 2.1-TOPO và một ựoạn có kắch thước tương ựương với ựoạn DNA sản phẩm của phản ứng RT-PCR gài vào vùng nhân dòng của vector (với ựiều kiện trong chuỗi DNA của PCR không có ựiểm cắt khác của EcoRI). Nếu trong ựó có một hay vài ựiểm cắt
EcoRI thì ựộ dài của PCR khi ựược kiểm tra sẽ bằng ựộ dài tổng số của các băng DNA.
Phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI ựược ủ ở 370C trong 2 giờ. Sau ựó ựiện di trên thạch agarose 1% ựể kiểm tra ựoạn DNA ngoại lai. Kết quả ựược chụp ảnh ựể xem xét và lưu trữ. Nếu ựiện di cho kết quả tương ứng với ựộ dài của sản phẩm RT-PCR thì DNA vector tái tổ hợp sẽ ựược thu nhận
và tiến hành giải trình tự.
Thành phần của phản ứng cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
EcoRI bao gồm những thành phần như sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch - Nước tinh khiết 16 ộl