- đệm cho enzyme EcoRI 2 ộl Enzyme EcoRI 1,5 ộl
5.DH-EG-2000 6 NC
6. NC 30 60 90 120 GGTGATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAGCCGGTTTGCTTTCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTCAAACACCTGTTTGGGAGGCAATGG S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V K H L F G R Q W> ___ ___ ____________________________________________________VP1 - NC -DHAV1 ______________________________________________> 150 180 210 240 TTAGTTAGGACTGTGCAACACGCCTCAACTGTGCAAGAGCTCGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATCCGGCTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAGATCATTCTTACC L V R T V Q H A S T V Q E L D L Q V P D R G H A S L I R L F A Y F S G E I I L T > __________________________________________________________VP1 - NC- DHAV1 ______________________________________________> 270 300 330 360 ATTGTCAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCTTATTCTATGGATGACCTCACTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAA I V N N G T T P A M V A H S Y S M D D L T S E Y A V T A M G G V M I P A N S A K> __________________________________________________________VP1- NC - DHAV1 ______________________________________________> 390 420 450 480 AATATTTCTGTGCCATTCTACTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTT N I S V P F Y S V T P L R P T R P I P G T S E A T F G R L F M W T Q S G S L S V > __________________________________________________________VP1 - NC - DHAV1 ______________________________________________> 510 540 570 600 TTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCTCCTACCTCCACAACATCATCACGGAGATCCAATGATGCTATTCCCACATTGAATCAGTCTGGGGATGAAGTAGAT F M G L K K P A L F F P L P A P T S T T S S R R S N D A I P T L N Q S G D E V D > __________________________________________________________VP1 - NC - DHAV1 ______________________________________________> 630 660 690 C H F C E I C S K M K R R W K P R G H F R F C F R L K T L A F E L N L E I E> __________________________________________________VP1- NC - DHAV1 ________________________________________________> G D TGTCACTTCTGCGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGAGGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCTTTAGACTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAATCTGGAAATTGAA 30 60 90 120 GGTGATTCCAACCAGTTGGGGGATGATGAGCCGGTTTGCTTTCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTCAAACACCTGTTTGGGAGGCAATGG G D S N Q L G D D E P V C F L N F E T A N V P I Q G E S H T L V N H L F G S Q W> __________________________________________________________VP1-DH-EG-2000-DHAV1 ______________________________________________> 150 180 210 240 TTAGTTAGGACTGTGCAACACGCCTCAACTGTGCAAGAGCTCGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATCCGGCTCTTTGCCTATTTCTCTGGAGAGATCATTCTTACC L V S T V Q H A S T V Q E L D L Q V P D S G H A S L I R L F A Y F S G E I I L T> __________________________________________________________VP1 -DH-EG-2000-DHAV1 ______________________________________________> 270 300 330 360 ATTGTCAACAATGGCACTACACCAGCAATGGTAGCACACTCTTATTCTATGGATGACCTCACTTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAACAGTGCCAAA _______________________________ ___________________________VP1 - DH-EG-2000- DHAV1 ______________________________________________> 390 420 450 480 AATATTTCTGTGCCATTCTACTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAGGCAACTTTTGGCAGACTGTTTATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTT N I S V P F Y S V T P L S P T R P I P G T S E A T F G S L F M W T Q S G S L S V> __________________________________________________________VP1- -DHAV1 ______________________________________________> 510 540 570 600 TTTATGGGTCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTCTTTCCACTCCCTGCTCCTACCTCCACAACATCATCACGGAGATCCAATGATGCTATTCCCACATTGAATCAGTCTGGGGATGAAGTAGAT F M G L N K P A L F F P L P A P T S T T S S R S S N D A I P T L N Q S G D E V D> __________________________________________________________VP1- DH-EG-2000- DHAV1 _______________________________________> 630 660 690 TGTCACTTCTGCGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGAGGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCTTTAGGCTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAATCTGGAAATTGAA C H F C E I C S N M K S S W K P S G H F S F C F S L N T L A F E L N L E I E> ____________________________________________________ VP1 - DH-EG-2000 - DHAV1 ____________________________________________>
Hình 4.7. Trình tự Nucleotit và axit amin tương ứng của vùng gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt lần lượt là: DN2, DN1, NB, HY, DH-
EG-2000 và NC.
Ghi chú: - Dòng trên: Trình tự xắp xếp của các Nucleotit của gen VP1 - Dòng dưới: Trình tự xắp xếp của các axit amin tương ứng ựược hiển thị bằng một chữ cái qui ựịnh của các axit amin
Sau khi giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp tách dòng, chúng tôi ựã thu ựược gen kháng nguyên VP1 của các chủng DN1, DN2 và NB có ựộ dài 720 bp, ựược xác ựịnh thuộc genotype III (DHAV-3); và gen VP1 của các chủng HY, DH-EG-2000 và NC có ựộ dài 714 bp ựược xác ựịnh thuộc genotype I (DHAV-1). Sau khi truy cập Ngân hàng gen sử dụng các chuỗi nucleotide mới thu nhận, chúng tôi nhận thấy tất cả 5 chủng cung cấp gen VP1 ựều thuộc virus viêm gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), bao gồm cả hai loại genotype: genotype III (DHAV-3) và genotype I (DHAV-1).
Bằng phương pháp giám ựịnh phân tử sử dụng gen VP1, chúng tôi ựã xác ựịnh ựược một số chủng virus viêm gan cường ựộc và chủng virus vacxin DH-EG-2000 có tại Việt Nam. Như vậy là ựã có sự xuất hiện của cả loại genotype: genotype III (DHAV-3) và genotype I (DHAV-1) ở cả miền Nam và miền Bắc của Việt Nam.
4.6 So sánh sự ựồng nhất nucleotide, sự tương ựồng amino acid của vùng gen vp1 giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ựộc nb, dn1, nc và gen vp1 giữa các chủng virus viêm gan vịt cường ựộc nb, dn1, nc và chủng virus vacxin dh-eg-2000.
Sau khi giải ựược trình tự vùng gen mã hóa cho protein VP1 của các chủng virus viêm gan vịt cường ựộc DN1, NB, NC và chủng virus vacxin viêm gan vịt nhược ựộc DH-EG-2000 chúng tôi ựưa vào chương trình GeneDoc 2.5 ựể phân tắch sự ựồng nhất về thành phần nucleotide và tương ựồng về amino acid. Kết quả so sánh ựược trình bày ở Bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tỷ lệ (%) ựồng nhất về nucleotide (trên ựường chéo) và tương ựồng axit amin (dưới ựường chéo) giữa các chủng virus viêm gan vịt
cường ựộc NB, DN1, NC và chủng virus vacxin DH-EG-2000.
DHAV-3 DHAV-1 Chủng DN1 NB DH-EG- 2000 NC DN1 99 92 92 NB 99 91 91 DH-EG-2000 89 87 99 NC 89 87 99
Kết quả so sánh cho thấy:
- Tỷ lệ ựồng nhất về nucleotide và tương ựồng về amino acid giữa 2 chủng trong cùng một genotype là rất cao, cụ thể là: 99% về nucleotide và 99% về amino acid giữa 2 chủng của DHAV-3, DN1 và NB; 99% cả về nucleotide và amino acid giữa 2 chủng của DHAV-1 là NC và DH-EG-2000.
- Từng cặp chủng thuộc về một genotype biểu hiện thống nhất khi so sánh tỷ lệ ựồng nhất về nucleotide và tương ựồng về amino acid với các cặp chủng thuộc genotype khác. Cụ thể: 91-92% (nucleotide) và 87-89% (amino acid) giữa cặp chủng DN1/NB (DHAV-3) và DH-EG-2000/NC (DHAV-1).
Hiện nay, genotype II mới chỉ phát hiện có 2 chủng (40G và 90D) tại đài Loan nên vấn ựề quan tâm về dịch tễ học, kháng nguyên và vaccine ựối với genotype này là chưa lớn. Ngược lại, sự xuất hiện DHAV-3 ngày càng nhiều ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam bên cạnh sự phân bố khá rộng ở nhiều quốc gia của DHAV-1 ựã làm tăng mối quan tâm về vấn ựề phòng chống bệnh viêm gan vịt (đoàn Thị Thanh Hương, 2010). Sai khác 9% về amino acid của vùng gen VP1 giữa genotype I và III là một chênh lệch lớn nếu sử dụng vaccine hay chế phẩm chẩn ựoán huyết thanh học thuộc DHAV-
1 ựể phòng bệnh và chẩn ựoán các trường hợp do DHAV-3 gây ra.
điều này có ý nghĩa khi chúng tôi so sánh chủng virus cường ựộc ựang lưu hành với chủng virus nhược ựộc vacxin ựang sử dụng tại Việt Nam về tương quan nucleotide và amino acid. Sự chênh lệch về thành phần amino acid của chủng vacxin genotype I với chủng cường ựộc thuộc genotype III có thể sẽ không cho miễn dịch tốt mặc dù vịt vẫn ựược tiêm phòng bằng loại vacxin hiện có.