- đệm cho enzyme EcoRI 2 ộl Enzyme EcoRI 1,5 ộl
3.3.6Thực hiện phản ứng giải trình tự
Phương pháp giải trình tự (sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân ựoạn DNA cần nghiên cứu. Phương pháp này dựa vào hoạt ựộng của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, enzyme DNA-polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch ựơn DNA ựang tổng hợp ở vị trắ 3Ỗ có chứa nhóm ỜOH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3Ỗ-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trắ cacbon 3 và 4) ựể dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các ựoạn DNA sợi ựơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các ựiều kiện thắch hợp. Mồi sử dụng là mồi ựơn dài khoảng 20-24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP ựược sử dụng ựể làm cho phản ứng nối dài chuỗi ựơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên). Chuỗi DNA sản phẩm ựược xác ựịnh trình tự theo chiều 5Ỗ→ 3Ỗ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) ựể ựánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi ựể ựọc trình
tự, phân tắch tự ựộng bằng máy với các chương trình phần mềm tin Ờ sinh học. Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận ựược bao giờ cũng ựược xác ựịnh theo chiều 5Ỗ→ 3Ỗ. Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban ựầu chưa ựược xử lý) có ựộ dài khoảng vài trăm ựến vài nghìn nucleotide; thông thường là 500-2000 nucleotide nếu ựược giải trình tự trên máy giải trình trình tự tự ựộng.
Quá trình giải trình tự trực tiếp ựoạn DNA sản phẩm thu nhận sau tinh sạch ựược tiến hành với một loại mồi, hoặc mồi xuôi (hoặc với mồi ngược) là các chuỗi oligonucleotide ựược thiết kế bám vào các trình tự ựầu tiên của sản phẩm, mà các mồi này cũng chắnh là các mồi tham gia thực hiện phản ứng RT-PCR. Nếu DNA ựưa vào giải trình tự là DNA plasmid vector tái tổ hợp chứa ựoạn chèn PCR ngoại lai, thì mồi là chuỗi nucleotide bám ở vùng biên hai ựầu ựoạn DNA ngoại lai ựược gài vào, trên chuỗi nucleotide của vector. Mồi dùng ựể giải trình tự DNA plasmid tái tổ hợp gồm:
- Mồi xuôi (M13F): 5Ỗ-GTAAAACGACGGCCAG-3Ỗ hoặc - Mồi ngược (M13R): 5Ỗ-CAGGAAACAGCATTGAC-3Ỗ Thành phần của phản ứng giải trình tự bao gồm:
Thành phần của phản ứng Thể tắch
- Big dye 1 ộl
- Mồi 3.2 ộl
- Mẫu nghiên cứu 3 ộl - Nước tinh khiết 2,8 ộl - Thành phần kắch hoạt 10 ộl Tổng thể tắch 20 ộl
Các thành phần này ựược cho cùng vào một ống eppendorf 0,5ml, sau ựó tiến hành phản ứng giải trình tự với chu trình nhiệt:
960C Ờ 5 phút 960C Ờ 30 giây 500C Ờ 5 giây 30 chu kỳ 600C Ờ 4 phút 4 0C
Khi kết thúc, nhiệt ựộ ựược giảm xuống 40C và sản phẩm ựược bảo quản ở nhiệt ựộ này cho tới khi làm sạch.