- đệm cho enzyme EcoRI 2 ộl Enzyme EcoRI 1,5 ộl
4.3Kết quả phản ứng rt-pcr
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3Kết quả phản ứng rt-pcr
VP1 ựược cho là protein cấu trúc quan trọng nhất, chiếm hầu hết phắa ngoài vỏ virus và chi phối tất cả các protein bề mặt, có chứa các motif có vai trò tương tác với các thụ thể của tế bào và các kháng thể trung hòa ựơn dòng. Chắnh vì vậy mà gen kháng nguyên VP1 ựược coi là chỉ thị phân tử trong nghiên cứu giám ựịnh virus viêm gan vịt.
Vì thế chúng tôi ựã tiến hành giám ựịnh phân tử sử dụng gen VP1 của các chủng virus viêm gan vịt bằng kỹ thuật RT- PCR với mồi thắch hợp. Tất cả các thành phần (mồi, khuôn, thành phần của kit) ựược cho vào cùng một lúc và thực hiện liên tục cả hai giai ựoạn: giai ựoạn chuyển ựổi (RT) chuyển RNA thành cDNA và giai ựoạn nhân gen (PCR).
Thu nhận gen VP1 và xác ựịnh genotype III (DHAV-3) của một số chủng cường ựộc viêm gan vịt phân lập tại Việt Nam (DN1, DN2 và NB): Sử dụng cặp mồi DHAV3F Ờ DHAV3R ựể nhân ựoạn gen kháng nguyên VP1 có ựộ dài 720 nucleotide từ vị trắ nucleotide thứ 2106 Ờ 2826, thực hiện phản ứng RT-PCR với chu trình nhiệt như ựã trình bày. Kết quả phản ứng ựược kiểm tra bằng cách chạy ựiện di trên thạch agarose 1,2% thể hiện trên hình 4.2.
1 2 3 M
800 bp
516 bp2.0 kb 2.0 kb
Hình 4.2: Kết quả ựiện di sản phẩm RT-PCR (~ 800 bp) của mẫu virus cường ựộc viêm gan vịt DN1, DN2 và NB trên thạch agarose 1,2%.
M: Chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lamda ựược cắt bằng enzyme HindIII; 1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu DN1; 2: Sản phẩm RT-PCR
của mẫu DN2; 3: Sản phẩm RT-PCR của mẫu NB.
Thu nhận gen VP1 và xác ựịnh genotype I (DHAV-1) của chủng cường ựộc viêm gan vịt HY, NC và chủng nhược ựộc viêm gan vịt ựang sử dụng làm vacxin DH-EG-2000: Sử dụng cặp mồi DH3F Ờ DH4R ựể nhân ựoạn gen kháng nguyên VP1 có ựộ dài 714 nucleotide từ vị trắ nucleotide thứ 2106 Ờ 2819, thực hiện phản ứng RT-PCR với chu trình nhiệt như ựã trình bày. Kết quả
phản ứng ựược kiểm tra bằng cách chạy ựiện di trên thạch agarose 1,2% thể hiện trên hình 4.3.
Hình 4.3: Kết quả ựiện di sản phẩm RT-PCR (~800 bp) của mẫu HY, DH-EG-2000 và NC trên thạch agarose 1%.
Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lamda ựược cắt bằng enzyme HindIII, 1: sản phẩm RT-PCR của mẫu HY, 2: sản phẩm RT-
PCR của mẫu DH-EG-2000, 3: sản phảm RT-PCR của mẫu NC
Trên hình 4.2 và 4.3, khi so sánh với các băng của chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lamda ựược cắt bằng enzym HindIII thấy xuất hiện băng DNA rõ nét, ựơn băng, có ựộ dài khoảng 0,8 kb. điều này cho phép kết luận ựó là sản phẩm PCR của vùng gen VP1 trong hệ gen virus viêm gan vịt, với kắch thước khoảng 0,8 kb như dự kiến. Vùng gen VP1 ựã ựược nhân lên một cách ựặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất, không có sản phẩm ỘgiảỢ và không bị ựứt gãy. Với kết quả như vậy ựã chứng minh các cặp mồi ựược lựa chọn trong nghiên cứu là hoàn toàn ựặc hiệu với vùng gen VP1 trong hệ gen của virus viêm gan vịt. đồng thời, chúng tôi thấy rằng toàn bộ qui trình phản ứng PCR là chắnh xác từ việc thiết kế mồi, chu trình nhiệt, tiến trình thực hiện và kết quả phản ứng hoàn toàn ựặc hiệu.
4,4 kb 2,3 kb 2,0 kb 0,54 kb M 1 2 3 4 0,8 kb
Từ kết quả phản ứng RT-PCR, một lần nữa khẳng ựịnh chắc chắn năm chủng virus nghiên cứu là virus cường ựộc viêm gan vịt.