Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính và định lượng orcinol o β d glucosid trong thân rễ cây sâm cau

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TỪ MINH THẢO MÃ SINH VIÊN: 1201553 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ORCINOL-O-β-D-GLUCOSID TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM CAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TỪ MINH THẢO MÃ SINH VIÊN: 1201553 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ORCINOL-O-β-D-GLUCOSID TRONG THÂN RỄ CÂY SÂM CAU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Thị Thùy Linh Ts Nguyễn Thị Phƣơng Nơi thực hiện: Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện Dƣợc liệu HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh (Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội) T.S Nguyễn Thị Phƣơng (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) người thầy hướng dẫn, bảo em, góp ý giúp đỡ em, đưa ý kiến quý báu để hoàn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu PGS.T.S Phƣơng Thiện Thƣơng nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận hạn Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt anh Nguyễn Đình Quân chị Hoàng Thị Tuyết – người theo sát, hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2017 Sinh viên Từ Minh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sâm cau 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan chất orcinol-O-β-D-glucosid 1.2.1 Cấu trúc hóa học tính chất 1.2.2 Tác dụng dược lý 10 1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng OG 11 1.3 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng 12 1.3.1 Tổng quan sắc ký lớp mỏng 12 1.3.2 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao 13 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 19 2.2.2 Định lượng OG HPLC 19 2.2.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG mẫu sâm cau thực 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp xử lý sơ mẫu thử 20 2.3.2 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 20 2.3.3 Định lượng OG HPLC 21 2.3.4 Ứng dụng phương pháp để xác định OG mẫu thực 26 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Định tính OG TLC 27 3.1.1 Khảo sát thuốc thử phát vết 27 3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động: 29 3.2 Định lƣợng OG HPLC 30 3.2.1 Lựa chọn bước sóng phân tích: 30 3.2.2 Khảo sát thành phần pha động 31 3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33 3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 36 3.3 Ứng dụng phƣơng pháp để xác định OG mẫu thực 42 3.3.1 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 43 3.3.2 Định lượng OG sắc ký lỏng hiệu cao 44 3.4 Bàn luận 46 3.4.1 Tính cấp thiết việc tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm cau Việt Nam 46 3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính 46 3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lượng 47 3.4.4 Phương pháp định lượng 48 3.4.5 Kết phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh tên khoa học Tên tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội nhà Hóa Chemists phân tích DAD Diod Array Detector Detector mảng diod DMSO Dimethyl sulfoxide EtOH Ethanol Ethanol High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao AOAC HPLC Khối lượng/ khối lượng kl/ kl LOD Limid of Detection Giới hạn phát LOQ Limid of Qualification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectrometry Phổ khối OG Orcinol glucoside Orcinol glucosid OM Orcinol monohydrate Orcinol monohydrat RSD Relative Standard Deviation S/N Signal/Noise STT Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/nhiễu đường Số thứ tự TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng UV-VIS Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại - khả kiến v/v Volume/volume Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ 31 Bảng 3.2 Hàm lượng OG thay đổi phương pháp thời gian chiết 35 Bảng 3.3 Khảo sát số lần chiết 35 Bảng 3.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 38 Bảng 3.5 Quan hệ nồng độ diện tích pic OG 40 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại 41 Bảng 3.7 Kết độ thu hồi 42 Bảng 3.8 Kết định lượng OG số mẫu thân rễ sâm cau thực 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Phần mặt đất thân rễ sâm cau Hình 3.1 Sắc ký đồ trước phun thuốc thử 27 Hình 3.2 Khảo sát định tính nhóm thuốc thử 28 Hình 3.3 Khảo sát hệ dung môi TLC, quan sát ánh sáng thường 29 Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV dung dịch OG MeOH 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha dộng 32 Hình 3.6 Khảo sát dung môi chiết 34 Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu 36 Hình 3.8 Khảo sát tính chọn lọc phương pháp 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOQ, LOD 39 Hình 3.10 Đường chuẩn OG 40 Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính OG mẫu thân rễ sâm cau thực 43 Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu thực 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm cau có tên khoa học Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae); phận dùng làm thuốc thân rễ Sâm cau vị thuốc quý, nghiên cứu công bố nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như: chống loãng xương; bảo vệ, chống độc cho gan; tăng cường chức sinh lý; điều hòa miễn dịch; chống oxy hóa; kháng khuẩn; chống tăng đường huyết… Nhóm chất có hoạt tính sinh học loài C.orchioides hợp chất phenolic glycosid saponin Orcinol-O-β-D-glucosid thuộc nhóm hợp chất phenolic glycosid, có hàm lượng cao dược liệu sâm cau Chất chứng minh có tác dụng chống suy nhược, giảm căng thẳng chống oxy hóa, từ góp phần không nhỏ vào tác dụng điều trị dược liệu Hiện Việt Nam chưa có phương pháp để định tính nhanh hoạt chất dược liệu sâm cau xác định hàm lượng chúng, nên việc đánh giá chất lượng dược liệu sâm cau thị trường gặp nhiều khó khăn, chất lượng dược liệu chưa đảm bảo Việc phát triển phương pháp phân tích hoạt chất nói chung orcinol-O-β-Dglucosid nói riêng dược liệu sâm cau vô cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tế, khóa luận “ Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định tính định lƣợng orcinol-O-β-D-glucosid thân rễ sâm cau” thực với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định tính nhanh định lượng orcinol-O-β-Dglucosid thân rễ sâm cau - Áp dụng phương pháp phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực 13 Cao D.P., Zheng Y.N., et al (2008), "Curculigo orchioides, a traditional Chinese medicinal plant, prevents bone loss in ovariectomized rats", Maturitas, 59(4), pp 373-380 14 Chauhan N.S., Rao C.V., et al (2007), "Effect of Curculigo orchioides rhizomes on sexual behaviour of male rats", Fitoterapia, 78(7-8), pp 530-534 15 Chauhan NS, Sharma V, et al (2010), "Curculigo orchioides: the black gold with numerous health benefits", Journal of Chinese Integrative Medicine, 8(7), pp 612-623 16 Chen CX, Ni W, et al (1999), "The Glycosides from Curculigo orchiodes", Acta Botanica Sinica, 21(4), pp 521-524 17 Da-Xu F, Guang-Qing L, et al (2004), "Curculigosid C, a New Phenolic Glucoside from Rhizomes of Curculigo orchioides", Acta Botanica Sinica, 46(5), pp 621-624 18 Dall'Acqua S, Shresthe BB, et al (2009), "Two phenolic glycosides from Curculigo orchioides Gaertn", Fitoterapia, 80(5), pp 279-282 19 Garg SN, Misra LN, et al (1989), "Corchioside A, an orcinol glycoside from Curculigo orchioides", Phytochemistry, 28, pp 1771-1772 20 Ge Jin-Fang, Gao Wen-Chao, et al (2014), "Orcinol glucoside produces antidepressant effects by blocking the behavioural and neuronal deficits caused by chronic stress", European Neuropsychopharmacology, 24(1), pp 172-180 21 He Yj, Dong X, et al (2015), "Qualitative and quantitative analysis on chemical constituents from Curculigo orchioides using ultra high performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 102, pp 236-245 22 Hong B.N., You Y.O., et al (2011), "Curculigo orchioides, Natural compounds for the treatment of noise-induced hearing loss in mice", Archives of Pharmacal Research, 34(4), pp 653-659 23 Jaiswal K, Batra KA, et al (1984), "The antimicrobial efficiency of root oil against human pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi", Journal of Phytopathology, 109(1), pp 90-93 24 Lacaille-Dubois M.A., Wagner H (1996), " A review of the biological and pharmacological activities of saponins.", Phytomedicine, 2(4), pp 363–386 25 Lakshmi V, Pandey K, et al (2003), "Immunostimulant principles from Curculigo orchioides", Journal of Ethnopharmacology, 89(2-3), pp 181-184 26 Lee S.Y., Kim M.R., et al (2009), "The effect of curculigoside on the expression of matrix metalloproteinase-1 in cultured human skin fibroblasts", Archives of Pharmacal Research, 32, pp 1433–1439 27 Liu X, Hu Y, et al (2014), "Optimization of enzyme-based ultrasonic/microwave-assisted extraction and evaluation of antioxidant activity of orcinol glucoside from the rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn", Medicinal Chemistry Research, 23(5), pp 2360-2367 28 M Asif (2012), "A Review on Phytochemical and Ethnopharmacological Activities of Curculigo orchioides", Mahidol University Journal of Pharmaceutical Sciences, 39(3-4), pp 1-10 29 Mehta B.K., Dubey A., et al (1983), "4-acetyl-2-methoxy-5methyltriacontane, a new aliphatic long-chain methoxy-ketone from Curculigo orchioides roots", Indian Journal of Chemistry, 22B(3), pp 282-283 30 Mehta BK, Bokadia MM, et al (1980), "Study of root oil compound fatty acids of Curculigo orchioides roots.", Indian Drugs, 18(3), pp 109-110 31 Misra T.N., Shingh R.S., et al (1984), "Aliphatic compounds from Curculigo orchioides rhizomes", Phytochemistry, 23(10), pp 23692371 32 Misra T.N., Shingh R.S., et al (1984), "Aliphatic hydroxylketones from Curculigo orchioides rhizomes", Phytochemistry, 23(8), pp 16431645 33 Misra T.N., Singh R.S, et al (1990), "Curculigol, a cycloartane triterpene alcohol from Curculigo orchioides", Phytochemistry, 29(3), pp 929-931 34 Nagesh K.S., Shanthamma C (2009), "Antibacterial activity of Curculigo orchioides rhizome extract on pathogenic bacteria", African Journal of Microbiology Research, 3(1), pp 5-9 35 Pandit P., Singh A., et al (2008), "Evaluation of antiasthmatic activity of Curculigo orchioides Gaertn rhizomes", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 70(4), pp 440-444 36 Rao K.S., Mishra S.H (1996), "Effect of rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn on drug induced hepatoxicity", Indian Drugs, 33(9), pp 458-461 37 Rao K.S., Mishra S.H (1996), "Studies on Curculigo orchioides Gaertn for antiinflammatory and hepatoprotective activities", Indian Drugs, 33(1), pp 20-25 38 Rao R., Ali N, et al (1978), "Occurrence of both sapogenins and alkaloid lycorine in Curculigo orchioides", Indian Journal of Pharmceutical Sciences, 40, pp 104–105 39 Tiwari R.D., Misra G (1976), " Strutural studies of the constitutents of the rhizomes of Curculigo orchioides", Planta Medica, 29, pp 291294 40 Valls J, Richard T, et al (2006), "Two new benzylbenzoate glucoside from Curculigo orchioides", Fitoterapia, 77(6), pp 416-419 41 Venkatesh P., Mukherjee P.K., et al (2009), "Mast cell stabilization and antihistaminic potentials of Curculigo orchioides rhizomes", Journal of Ethnopharmacology, 126(3), pp 434–436 42 Vijayanarayana K., Rodrigues R.S., et al (2007), "Evaluation of estrogenic activity of alcoholic extract of rhizomes of Curculigo orchioides", Journal of Ethnopharmacology, 114(2), pp 241-245 43 Wang Xiaohong, Li Guiyun, et al (2015), "Anxiolytic effects of orcinol glucoside and orcinol monohydrate in mice", Pharmaceutical Biology, 53(6), pp 876-881 44 Wang ZH, Huang J, et al (2013), "Phenolic glycosides from Curculigo orchioides Gaertn.", Fitoterapia, 86, pp 64-69 45 Wu Q Fu D.X., Hou A.J., et al (2005), "Antioxidative phenols and phenolic glycosides from Curculigo orchioides", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 53, pp 1065-1067 46 Xu JP, Xu RS (1992), "Cycloartane type sapogenins and their glycosides from Curculigo orchioides", Phytochemistry, 31(7), pp 2455-2458 47 Xu JP, Xu RS, et al (1992), "Four New Cycloartane Saponins from Curculigo orchioides", Planta Medica, 58(2), pp 208-210 48 Xu JP, Xu RS, et al (1992), "Glycosides of a cycloartane sapogenin from Curculigo orchioides", Phytochemistry, 31(1), pp 233-236 49 Yan N, Xin D, et al (2013), "Medicinal plants of genus Curculigo: Traditional uses and a phytochemical and ethnopharmacological review", Journal of Ethnopharmacology, 147(3), pp 547-563 50 Zuo AX, Shen Y, et al (2010), "Four new trace phenolic glycosides from Curculigo orchioides", Journal of Natural Products Research, 12, pp 43-50 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát phƣơng pháp chiết thời gian chiết Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ khác Phụ lục 5: Sắc ký đồ đánh giá độ thu hồi Phụ lục 1: Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết Phụ lục 2: Sắc ký đồ khảo sát phƣơng pháp chiết thời gian chiết Phụ lục 3: Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết Phụ lục 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn nồng độ khác Phụ lục 5: Sắc ký đồ đánh giá độ thu hồi ... pháp định tính định lƣợng orcinol- O- β- D- glucosid thân rễ sâm cau thực với mục tiêu: - Xây d ng phương pháp định tính nhanh định lượng orcinol- O- β- Dglucosid thân rễ sâm cau - Áp d ng phương pháp. .. hạn định lượng MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectrometry Phổ khối OG Orcinol glucoside Orcinol glucosid OM Orcinol monohydrate Orcinol monohydrat RSD Relative Standard Deviation S/N Signal/Noise... 5-hydroxymethylfurfural + 2-hydroxy-5-(2-hydroxyethyl)phenyl -β- D- glucopyranosid + anacardosid 11 + OG + orcinol- 1 -O- β- D- apiofuranosyl-(1 → 6) -β- D- glucopyranosid + 2,6-dimethoxybenzoic acid + curculigosid + curculigine