Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính và định lượng orcinol o β d glucosid trong thân rễ cây sâm cau

Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp để định tính nhanh các hoạt chất chính trong dược liệu sâm cau cũng như xác định hàm lượng của chúng, nên việc đánh giá chất lượng dược liệu sâm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

THÂN RỄ CÂY SÂM CAU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh

(Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội) và T.S

Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) là

những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo em, luôn góp ý và giúp đỡ em, đưa

ra những ý kiến quý báu để hoàn thiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và PGS.T.S

Phương Thiện Thương đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để

em hoàn thành khóa luận đúng hạn

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích –

Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt là anh Nguyễn Đình Quân và chị

Hoàng Thị Tuyết – là những người đã luôn theo sát, hướng dẫn cho em trong

suốt quá trình thực hiện đề tài

Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã

luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên

cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!

Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Từ Minh Thảo

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về sâm cau 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học 3

1.1.3 Tác dụng dược lý 7

1.2 Tổng quan về chất orcinol-O-β-D-glucosid 9

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 9

1.2.2 Tác dụng dược lý 10

1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng OG 11

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng 12

1.3.1 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng 12

1.3.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng 19

2.2.2 Định lượng OG bằng HPLC 19

2.2.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu sâm cau thực 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp xử lý sơ bộ mẫu thử 20

2.3.2 Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng 20

2.3.3 Định lượng OG bằng HPLC 21

2.3.4 Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu thực 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Định tính OG bằng TLC 27

3.1.1 Khảo sát thuốc thử phát hiện vết 27

3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động: 29

3.2 Định lượng OG bằng HPLC 30

3.2.1 Lựa chọn bước sóng phân tích: 30

3.2.2 Khảo sát thành phần pha động 31

3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33

3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 36

3.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu thực 42

3.3.1 Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng 43

3.3.2 Định lượng OG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 44

3.4 Bàn luận 46

3.4.1 Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm cau ở Việt Nam 46

3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính 46

3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lượng 47

3.4.4 Phương pháp định lượng 48

3.4.5 Kết quả phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tên tiếng Việt

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà Hóa

phân tích

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng

cao

LOQ Limid of Qualification Giới hạn định lượng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương

đối

nền

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng UV-VIS Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại - khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ 31

Bảng 3.2 Hàm lượng OG khi thay đổi phương pháp và thời gian chiết 35

Bảng 3.3 Khảo sát số lần chiết 35

Bảng 3.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 38

Bảng 3.5 Quan hệ giữa nồng độ và diện tích pic của OG 40

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại 41

Bảng 3.7 Kết quả độ thu hồi 42

Bảng 3.8 Kết quả định lượng OG trên một số mẫu thân rễ sâm cau thực 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Phần trên mặt đất và thân rễ của cây sâm cau 2

Hình 3.1 Sắc ký đồ trước khi phun thuốc thử 27

Hình 3.2 Khảo sát định tính trên 2 nhóm thuốc thử 28

Hình 3.3 Khảo sát hệ dung môi TLC, quan sát ở ánh sáng thường 29

Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV của dung dịch OG trong MeOH 30

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha dộng 32

Hình 3.6 Khảo sát dung môi chiết 34

Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu 36

Hình 3.8 Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp 37

Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOQ, LOD 39

Hình 3.10 Đường chuẩn của OG 40

Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính OG trên các mẫu thân rễ sâm cau thực 43

Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu thực 44

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sâm cau có tên khoa học là Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ Tỏi

voi lùn (Hypoxidaceae); bộ phận dùng làm thuốc là thân rễ Sâm cau là một trong những vị thuốc quý, các nghiên cứu đã công bố chỉ ra rất nhiều tác dụng

có lợi cho sức khỏe như: chống loãng xương; bảo vệ, chống độc cho gan; tăng cường chức năng sinh lý; điều hòa miễn dịch; chống oxy hóa; kháng khuẩn; chống tăng đường huyết…

Nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong loài C.orchioides là các hợp chất phenolic glycosid và saponin Orcinol-O-β-D-glucosid thuộc nhóm

hợp chất phenolic glycosid, có hàm lượng khá cao trong dược liệu sâm cau Chất này đã được chứng minh có tác dụng chống suy nhược, giảm căng thẳng

và chống oxy hóa, từ đó góp phần không nhỏ vào tác dụng điều trị của dược liệu

Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp để định tính nhanh các hoạt chất chính trong dược liệu sâm cau cũng như xác định hàm lượng của chúng, nên việc đánh giá chất lượng dược liệu sâm cau trên thị trường còn gặp nhiều khó khăn, chất lượng của dược liệu chưa được đảm bảo Việc phát

triển phương pháp phân tích hoạt chất chính nói chung và

orcinol-O-β-D-glucosid nói riêng trong dược liệu sâm cau là vô cùng cần thiết Xuất phát từ

nhu cầu thực tế, khóa luận “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính

và định lượng orcinol-O-β-D-glucosid trong thân rễ cây sâm cau” được

thực hiện với các mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định tính nhanh và định lượng

orcinol-O-β-D-glucosid trong thân rễ cây sâm cau

- Áp dụng phương pháp phân tích trên các mẫu thân rễ cây sâm cau

thực

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sâm cau

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae

Tên gọi khác: Ngải cau, tiên mao, cỏ nốc lan Họ Tỏi voi lùn

Cây thảo, sống lâu năm cao 30 cm hoặc hơn Thân rễ hình trụ dài, dạng

củ to bằng ngón tay út, có rễ bên nhỏ Lá mọc tụ hợp thành túm từ thân rễ, xếp nếp như lá cau, hình mũi mác hẹp, dài 20 – 30 cm, rộng 2,5 – 3cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, gân song song, bẹ lá to và dài, cuống lá dài khoảng 10 cm Hoa màu vàng, mọc thành từng cụm 3 – 5, không cuống trên một trục ngắn, nằm trong bẹ lá Quả nang, thuôn dài 12 –

15 mm, hạt 1 – 4 phình ở đầu [1], [6], [7] Bộ phận dùng: Thân rễ

Phân bố: ở Việt Nam: Hà Nội (Chùa Hương, Ba Vì), Ninh Bình, Đà Nẵng, Kon Tum, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu Còn có ở các nơi khác trên thế giới như: Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Thái Lan, Philippines, Malaysia, Indonexia, Papua New Guinea [7]

Hình 1.1 Phần trên mặt đất và thân rễ của cây sâm cau

3

1.1.2 Thành phần hóa học

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới đã công bố và cho biết thành phần hóa học chính và có tác dụng dược lý trong dược liệu sâm cau bao gồm: Hợp chất phenolic glycosid, hợp chất aliphatic hydroxy-keton, saponin, flavonoid, alcaloid Ngoài những hợp chất trên, trong thân rễ cây còn chứa các thành phần hóa học khác như glycosid, steroid, polysaccharid, đường tự

do như glucose, mannose, xylose; acid glucuronic; nhựa; tanin; chất béo; chất nhầy [28]

Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Bích Ngọc (2015) về loài sâm cau thu hái ở Kon Tum, Tây Nguyên, kết quả định tính cho thấy thân rễ sâm cau chứa hợp chất phenolic, saponin, alcaloid, phytosterol, đường khử tự do, chất béo [2]

1.1.2.1 Hợp chất phenolic glycosid

Năm 1983, Michinor Kubo và cộng sự đã phân lập được từ thân rễ sâm

cau một phenolic glucosid mới đặt tên là curculigoside A (1) [15] Năm

2006, ngoài hai hợp chất cũ là curculigoside A (1) và curculigoside B (2),

Josep Valls và cộng sự đã phân lập được hai benzylbenzoat mới là

4

Trong nghiên cứu của Dall’Acqua (2009) đã phân lập và xác định được

cấu trúc hai hợp chất: curculigoside E (5) và orchioside D – đồng phân quang

học của crassifoside B (một hợp chất phenolic được tìm thấy trong thân rễ

loài Curculigo crassifolia) (6) [18]

Garg cùng cộng sự (1989) đã tìm ra hợp chất phenolic glycosid mới đặt

tên là corchioside A (7) [19] Nghiên cứu của Zuo A.X (2010) công bố phân lập được các hợp chất phenolic glycosid là orcinoside A, B, C [50]

6

trong đó curculigosaponin A  J đều mang khung chung của curculigenin A; curculigosaponin K  M có phần genin là curculigenin B [46], [47]

Misra Triguna N., Singh Ram S (1990) đã phân lập được curculigol từ

thân rễ loài C orchioides Gaertn Cấu trúc của hợp chất này được xác định là: 24-methylcycloart-7-en-3β,20-diol

3',4',5'-trimthoxy-Rao và cộng sự (1978) phân lập được 1 alcaloid duy nhất là lycorin

(28) [38] Ngoài ra đã phân lập được các hợp chất chứa nitơ từ thân rễ cây

sâm cau như: N,N,N’,N’-tetramethylsuccinamid (29),

methyl-N-acetyl-N-Curculigenin C (25) 24-methylcycloart-7-en-3β,20-diol [6], [33]

7

hydroxycarbamat (30), oxatetrazin (31)

3-acetyl-5-carbomethoxy-2,4,4,6-tetrahydro-1,2,3,5,6-Dịch chiết dầu từ thân rễ loài C orchioides chứa nhiều acid béo gồm:

palmitic (32), oleic (33), linoleic (34), arachidic (35) và behenic acid (36)

[30] Có 3 hợp chất steroid tìm được từ thân rễ C.orchioides là: sitosterol

(37) , stigmasterol (38) , yuccagenin (39) [28]

1.1.3 Tác dụng dược lý

1.1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết methanol của thân rễ Curculigo

orchioide có hiệu quả rất tốt trong việc dọn các gốc tự do nhóm superoxid,

có tác dụng trung bình đối với các gốc tự do DPPH, nitric oxid và có tác dụng ức chế quá trình peroxid lipid [11] Theo Wu và cộng sự, các hợp chất phenolic

glycosid là yếu tố chính tạo nên tác dụng chống oxy hóa của C orchioides

[45]

1.1.3.2 Tác dụng chống loãng xương

Các thử nghiệm in vivo và in vitro đã chứng minh dịch chiết từ thân rễ

C orchioides có tác dụng chống loãng xương Cao ethanol nói chung và hợp

chất phenolic glycosid nói riêng kích thích sự tăng sinh nguyên bào xương tạo cốt bào, thúc đẩy hoạt động của ALP, đồng thời làm giảm vùng tế bào hủy xương tại hố tiêu xương [13]

1.1.3.3 Tác dụng bảo vệ, chống độc cho gan

Nhóm tác giả Rao và cộng sự (1996) cho rằng C orchioides có tác

dụng chống viêm và bảo vệ gan là do sâm cau có tác dụng đối kháng với một số chất gây độc cho gan như rifampicin [36], [37] Thêm vào đó,

8

curculigenin A và curculigol đã được nghiên cứu và sàng lọc thấy chúng đối kháng với độc tính trên gan của thioacetamid và galactosomin [15]

1.1.3.4 Tác dụng điều hòa miễn dịch

Nhóm nghiên cứu của Lakshmi và cộng sự đã quan sát thấy tác dụng điều hòa miễn dịch rõ rệt của phân đoạn giàu glycosid tinh khiết trong cao ethylacetat [25] Các phenolic làm tăng hàm lượng kháng thể dịch thể [10] Curculigosaponin kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho lách trên chuột nhắt trắng nhưng không có ảnh hưởng rõ rệt đến kháng thể [24], [49]

1.1.3.5 Hoạt tính tăng cường chức năng sinh lý

Cao ethanol của thân rễ C.orchioides có tác dụng kích thích sinh dục

đáng kể ở thỏ đực, làm tăng lượng glycogen, tăng độ ẩm ở tử cung của chuột cái trưởng thành, tăng nồng độ hormon FSH, LH và hormon testosteron trên chuột cống; tác dụng làm tăng số lần, tăng tần suất giao phối trên động vật [42]

Điều này đã gợi ý cho các nhà nghiên cứu có thể dùng thân rễ sâm cau như một vị thuốc để điều trị chứng rối loạn cương dương [14], [49]

1.1.3.6 Tác dụng ổn định tế bào mast, kháng histamin và chống hen

Dịch chiết cồn có tác dụng ức chế đáng kể quá trình mất hạt của tế bào mast trên các tế bào mast thuộc màng bụng chuột đơn độc và cả trên chuột bị quá mẫn do phơi nhiễm với hợp chất 48/80 [41] Các nghiên cứu sâu hơn chỉ

ra rằng cao cồn của thân rễ C.orchioides có thể có tác dụng trong điều trị hen

[35]

1.1.3.7 Tác dụng khác

Dịch chiết dầu của thân rễ sâm cau có tác dụng kháng với các chủng vi

khuẩn Bacillus anthracis, B.subtilis, Salmonella pullorum, S.newport,

Staphylococcus aureus và một số chủng nấm [23] Dịch chiết nước của C

9

orchioides có tác dụng kháng một số chủng tụ cầu Gram (+) như: S.aureus, S.epidermidis; các chủng Gram (-) như: E.coli, Pseudomonas aeruginosa, S.typhimurium [34]

Cả cao nước và cao ethanol đều có tác dụng chống tăng đường huyết trong điều kiện bình thường và trong điều kiện tăng đường huyết do alloxan trên chuột [14]

Curculigoside làm tăng sự biểu hiện protein procolagen typ 1 và giảm biểu hiện protein MMP-1 của các nguyên bào sợi da người, do vậy curculigoside có thể hữu ích trong điều trị lão hóa da [26]

Một số nghiên cứu khác cho thấy sâm cau có thể được sử dụng như một sản phẩm tự nhiên điều trị chứng giảm thính lực do tiếng ồn ở chuột [22]

1.2 Tổng quan về chất orcinol-O-β-D-glucosid

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Công thức cấu tạo: C13H18O7

- Tên khoa học (IUPAC): hydroxy-5-methylphenoxy)oxane-3,4,5-triol

(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 Tên gọi khác: 3(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 Hydroxy(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 5(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 methylphenyl β(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 D(2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(3 glucopyranosid

- Tính chất:

+ Trọng lượng phân tử: 286,28 g/mol

+ Điểm sôi: 570.6±50.0 °C ở 760 mmHg

+ Bột trắng ở nhiệt độ phòng; tan trong dung môi: hỗn hợp MeOH –

H2O, DMSO, MeOH nóng; khó tan trong dung môi: ether dầu hỏa, chloroform

10

+ Thuộc nhóm hợp chất phenolic glycosid, thể hiện tính chất hóa học của nhóm OH phenol: pKa = 9,8; phản ứng với dung dịch FeCl3 tạo phức màu tím; tác dụng với các chất oxy hóa tạo các hợp chất quinon có màu

1.2.2 Tác dụng dược lý

Các kết quả đã công bố chỉ ra rằng orcinol-O-β-D-glucosid có tác dụng

chống suy nhược, giảm căng thẳng và chống oxy hóa

1.2.2.1 Tác dụng chống suy nhược

Nghiên cứu của Jin-Fang Ge và các cộng sự (2014) trên mô hình chuột suy nhược do bị căng thẳng trường diễn mức độ trung bình không đoán trước trong 3 tuần liên tiếp (CUMS) cho kết quả: ocinol glucosid (OG) cải thiện hành vi trầm cảm trên chuột CUMS bằng cách giảm tính hoạt động mạnh của trục HPA và tăng biểu hiện của BDNF và ERK 1/ 2 phosphoryl hóa ở vùng dưới đồi [20]

1.2.2.2 Tác dụng giảm căng thẳng

Năm 2014, Xiaohong Wang và các cộng sự đã làm một nghiên cứu về tác dụng giảm căng thẳng trên chuột Kết quả cho thấy: orcinol glucosid (OG) và orcinol monohydrat (OM) là các tác nhân giảm căng thẳng không gây hiệu ứng an thần, trên cơ sở đó có thể hướng đến khả năng cao dùng chất này để điều trị chứng căng thẳng [43]

1.2.2.3 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2013, Xiu Liu và cộng sự đã chứng minh được tác dụng chống

oxy hóa của orcinol glucosid trong thân rễ loài C.orchioides [27]

11

1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng OG

Hiện nay các tài liệu dược điển: Việt Nam, Trung Quốc, Hong Kong, chúng tôi nhận thấy chưa có tài liệu nào công bố bổ sung phương pháp định tính và định lượng chất OG trong dược liệu sâm cau

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu định lượng các hợp chất phenolic glycosid trong đó có OG:

* Phương pháp 1: HPLC – DAD [12]

- Xử lý mẫu: hòa tan trong MeOH, siêu âm, ly tâm

- Chất đối chiếu: Hỗn hợp 4 chất: OG; orcinol; acid 2,6-dimethoxybenzoic; curculigosid

- Điều kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: cột Alltima C18 ODS

+ Pha động: Acetonitril (0,02% TFA) : H2O (0,05% TFA)

+ Detector: DAD

- Kết quả: phép phân tích với OG

+ Thời gian lưu: 11,375 phút

+ Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 13,463x – 44,257; R2

=0,9991 + LOD = 1,25 µg/ml, LOQ = 5,10 µg/ml

+ Độ lặp lại trung bình = 1,73 mg/g, RSD = 2,40%

+ Độ thu hồi trung bình = 102,82%, RSD = 2,66%

* Phương pháp 2: UHPLC – ESI-Q-TOF/MS [21]

- Xử lý mẫu: chiết với EtOH dưới áp suất giảm ở 60oC

- Chất đối chiếu: Hỗn hợp các chất phân lập được từ thân rễ cây sâm cau, bao gồm các chất:

+ 5-hydroxymethylfurfural

+ 2-hydroxy-5-(2-hydroxyethyl)phenyl-β-D-glucopyranosid

+ anacardosid

+ Pha tĩnh: cột Waters UHPLC Acquity HSS T3

+ Pha động: Acetonitril: H2O (0,1% acid fomic)

+ Detector: MS-Q-TOF

- Kết quả: phép phân tích với OG

+ Thời gian lưu: 4,633 phút

+ Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0032x - 60,632; R = 0,9993 + LOD = 0,25 μg ml-1, LOQ = 0,5μg ml-1

+ Độ lặp lại có RSD = 1,78%

+ Độ thu hồi trung bình: 104,8%, RSD = 1,6%

Từ kết quả các nghiên cứu trên chúng tôi nhận định OG là một trong những hợp chất chính trong thân rễ cây sâm cau, tuy nhiên tại thời điểm hiện tại chưa có phương pháp phân tích riêng OG trong dược liệu quý này Vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định tính nhanh OG bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng OG bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao để tạo tiền đề hướng tới đánh giá chất lượng sâm cau như việc phát hiện nhanh và chính xác dược liệu giả, dược liệu kém chất lượng trên thị trường

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng

1.3.1 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng

Quá trình tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ

13

bằng nhôm, thủy tinh hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp thụ, trao đổi ion… Pha động là hỗn hợp dung môi

Loại bản mỏng có chất hấp phụ có thêm bột bó (thạch cao ngậm 1,5

H2O) là chất kết dính, có ký hiệu chữ G, nếu được trộn thêm chất chỉ thị

huỳnh quang ký hiệu chữ F (ví dụ: silica gel GF254)

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất là hệ số lưu giữ

Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động

Trong đó: dR, dM tương ứng là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích và đến mức dung môi pha động (tính bằng cm)

1.3.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.2.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh là các hạt chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Có 4 kỹ thuật HPLC cơ bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion và rây phân tử (loại cỡ)

* Dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh để phân loại sắc ký:

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn.Chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần

14

Trong phạm vi khóa luận này chúng tôi xin trình bày về sắc ký phân bố pha đảo

1.3.2.2 Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC

* Thời gian lưu tR:

Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, tR của mỗi chất là hằng định Vì vậy

* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N:

Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:

( ) (

)Trong đó W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

15

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic

* Hệ số kéo đuôi As:

Trong đó W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Yêu cầu: As nằm trong khoảng 0,8 – 1,5

* Hệ số bất đối AF

Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:

Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic, a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic

* Độ phân giải RS: là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

( ) ( )

Trong đó t(R)A; t(R)B: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)

WA; WB: độ rộng pic đo ở các đáy pic Yêu cầu: RS >1; giá trị tối ưu RS = 1,5

1.3.2.3 Các phương pháp định lượng bằng HPLC

Nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic Có 4 phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong phạm vi khóa luận này, tôi xin trình bày chi tiết về phương pháp chuẩn ngoại

16

Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó

cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất cần phân tích trong mẫu thử

Có 2 phương pháp là chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm

- Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

Trong đó CX, CS tương ứng là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn

SX, SS tương ứng là diện tích của pic mẫu thử và mẫu chuẩn

- Chuẩn hóa nhiều điểm:

+ Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích (hoặc chiều cao) của pic ở mỗi điểm chuẩn

+ Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất chuẩn

+ Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất thử bằng cách: Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) của pic với nồng độ của chất cần xác định

Trong đó y là diện tích pic

a là giao điểm của đường chuẩn với trục tung

b là độ dốc của đường chuẩn

CX là nồng độ của chất thử

17

Từ đó tìm được CX Chú ý rằng độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) của pic mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [4], [5]

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu thân rễ cây Sâm cau được trồng và thu hái ở một số vùng khác nhau ở Việt Nam

2.1.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị

khoảng 2 – 8oC, tránh ánh sáng Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau để thu được các dung dịch xây dựng đường chuẩn

- Dung dịch chuẩn trung gian 176,4 μg/ml: Hút chính xác 200 μl dung dịch chuẩn 882 μg/ml vào lọ vial và thêm 800μl MeOH, đậy nắp, lắc đều

- Dung dịch chuẩn trung gian 88,2 μg/ml: Hút chính xác 100 μl dung dịch chuẩn 88,2 μg/ml vào lọ vial và thêm 900 μl MeOH, đậy nắp, lắc đều

- Dung dịch chuẩn trung gian 17,64 μg/ml: Hút chính xác 20 μl dung dịch chuẩn 892 μg/ml vào lọ vial và thêm 800 μl MeOH, đậy nắp, lắc đều

- Dung dịch chuẩn trung gian 8,82 μg/ml: Hút chính xác 10 μl dung dịch chuẩn 882 μg/ml vào lọ vial và thêm 900 μl MeOH, đậy nắp, lắc đều Các dung dịch chuẩn trung gian được bảo quản ở 2-8oC, tránh ánh sáng

2.1.2.2 Hóa chất, dung môi

- Các dung môi, hóa chất sử dụng đều là hóa chất tinh khiết phân tích

19

- Các dung môi: ethanol, methanol, dichlomethan, toluen, ethylacetat, aceton, acid fomic, chloroform, amoniac, acid sulfuric, sắt (III) clorid đạt tiêu chuẩn phân tích

- Các dung môi dùng cho phân tích HPLC của hãng Merck (hoặc tương đương) bao gồm: acetonitril, methanol, nước cất hai lần đã qua loại ion và siêu âm khử khí trước khi dùng

2.1.2.3 Trang thiết bị

- Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO)

- Cân phân tích (Sartorius, BP – 221S)

- Cân kỹ thuật điện tử (Precise, XT – 220A)

- Tủ sấy (Memmert, ULM 500)

- Cân xác định độ ẩm (Precisa, XM 60 – HR)

- Đèn UV 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (CAMAG Reprostar 3)

- Máy chấm sắc ký (CAMAG Linomat 5)

- Máy quang phổ UV-VIS (Shimadzu, UV – 1800)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – LC 20A (Shimadzu)

- Máy ly tâm (Hettich Zentrifugen, Universal – 320)

- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng

- Lựa chọn quy trình chiết, lựa chọn thể tích mẫu

- Khảo sát điều kiện phát hiện

- Khảo sát hệ dung môi pha động

2.2.2 Định lượng OG bằng HPLC

2.2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng

- Khảo sát điều kiện chạy sắc ký

20

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu

+ Dung môi chiết

+ Phương pháp chiết và thời gian chiết

+ Số lần chiết

2.2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng

- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

- Tính phù hợp hệ thống

- Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Độ lặp lại, độ đúng của phương pháp

2.2.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu sâm cau thực

Áp dụng phương pháp phân tích mới xây dựng để định tính và xác định hàm lượng OG trong mẫu thân rễ sâm cau thực

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý sơ bộ mẫu thử

Thời gian lấy mẫu: Từ 01/12/2016 đến 31/3/2017

Các mẫu do Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội cung cấp

Mẫu sau khi thu hái được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô, nghiền thành bột thô mịn và bảo quản trong túi nilon kín để sử dụng cho quá trình phân tích, đánh giá chất lượng

2.3.2 Định tính OG bằng sắc ký lớp mỏng

* Lựa chọn quy trình chiết:

Vì OG tan tốt trong MeOH nên chúng tôi quyết định chọn MeOH làm dung môi chiết Phương pháp chiết chúng tôi lựa chọn là chiết siêu âm với thời gian 30 phút

Hệ pha động A: Toluen: Ethylacetat: Aceton: Acid fomic (5:2:2:1, v/v/v/v)

Hệ pha động B: Dichlomethan: Methanol (4:1, v/v)

Hệ pha động C: Chloroform: Methanol: Amoniac (65:35:10, v/v/v)

- Khảo sát điều kiện phát hiện:

Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô trong không khí Sau

đó phun thuốc thử, sấy ở 105o

C, quan sát dưới ánh sáng thường Dựa vào tính chất hóa học của OG thể hiện ở nhóm OH phenol, chúng tôi tiến hành khảo sát trên 2 nhóm thuốc thử là:

Thuốc thử 1: Acid sulfuric 10% trong ethanol

Thuốc thử 2: Sắt (III) clorid 3% trong ethanol

2.3.3 Định lượng OG bằng HPLC

2.3.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng

* Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng

Phép phân tích được thực hiện trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu kết nối với hệ bơm LC – 20A, bộ điều khiển, cột Eclipse XDB – C18 (250 x 4,6mm; 5µm) của hãng Agilent, bộ trộn dung môi và detector UV/VIS SPD – 20A

Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR) của chất phân tích, độ phân giải (RS), và hệ số kéo đuôi của pic (AS) RS ≥ 1,5; As nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; tR của các chất phân tích không quá dài nhưng phải đảm bảo tách xa nhau

* Khảo sát quy trình xử lý mẫu:

Chiết OG từ mẫu thân rễ cây sâm cau đã qua xử lý sơ bộ:

- Khảo sát dung môi chiết

- Khảo sát phương pháp và thời gian chiết

- Khảo sát số lần chiết

2.3.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng

 Tính chọn lọc của phương pháp

- Tính chọn lọc của phương pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ

ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khắc như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện: trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn và các mẫu phân tích, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp

- Xác định: Chuẩn bị:

+ Mẫu chuẩn orcinol glucosid trong MeOH

+ Mẫu thử

+ Mẫu thử thêm chuẩn

So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên

 Tính phù hợp hệ thống

23

Tính phù hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn

hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị, cách tiến hành, mẫu thử Các thông số dùng để đánh giá tính thích hợp hệ thống bao gồm: độ phân giải RS của các pic, độ lệch chuẩn tương đối RSD của các tín hiệu đo được của chất phân tích khi tiêm mẫu lặp lại Pha một mẫu chuẩn có nồng độ thích hợp, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện đã lựa chọn Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic yêu cầu là RSD ≤ 2

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có

trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: khoảng nồng độ ở

đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

24

Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất)

- Đường chuẩn: đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại

lượng đo được và nồng độ các chất phân tích

Xác định: Phân tích các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo

sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị hệ số tương quan R và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ) Theo đó

và giá trị Δ không vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

 Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng)

- Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của

các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD ≤ 2

- Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa

các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được

so với giá trị lý thuyết

25

Thêm vào mẫu thân rễ sâm cau đã được xác định hàm lượng orcinol glucosid một lượng chính xác chất chuẩn (3 mức thêm chuẩn) sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ thu hồi được tính theo công thức:

( ) Trong đó:

- R: độ thu hồi (%)

- Ct: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (μg/ml)

- Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (μg/ml)

Theo tiêu chuẩn của AOAC: độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,1 - 1 là: 95 - 105% [3]

2.3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Chúng tôi sử dụng phần mềm LC Solution và phương pháp xử lý thống

kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel để xử lý số liệu

26

- Phương tình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện

tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: y = ax + b, sử dụng phần mềm

Microsoft Excel để xử lý và vẽ đồ thị

2.3.4 Ứng dụng phương pháp để xác định OG trong mẫu thực

Áp dụng phương pháp phân tích định tính và định lượng các mẫu thân

rễ sâm cau thực Mỗi mẫu tiến hành định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình

Mẫu đối chiếu: Cân khoảng 1mg chất đối chiếu OG, hòa tan trong khoảng 2 ml methanol (ký hiệu mẫu đối chiếu: C)

Đưa mẫu thử và mẫu đối chiếu lên trên cùng một bản mỏng

* Lựa chọn thể tích tiêm mẫu: chúng tôi tiêm tương ứng 5 μl dung dịch mẫu thử và 5 μl dung dịch mẫu chuẩn, sử dụng máy chấm sắc ký để đưa mẫu lên bản mỏng

3.1.1 Khảo sát thuốc thử phát hiện vết

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)

- Pha động: Hệ dung môi dichloromethan: methanol (4:1, v/v)

Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, quan sát dưới đèn UV 254 nm và 366 nm Kết quả thu được như sau:

Hình 3.1 Sắc ký đồ trước khi phun thuốc thử

28

Chúng tôi nhận thấy với điều kiện quan sát sắc ký đồ dưới đèn tử ngoại

2 bước sóng 254 nm và 366 nm rất khó để nhận biết vết OG Vì vậy chúng tôi quyết định sử dụng thuốc thử phát hiện để vết OG trên bản mỏng hiện rõ hơn Khảo sát trên 2 nhóm thuốc thử:

- Thuốc thử 1: H2SO4 10%/ EtOH

H2SO4 là tác nhân oxy hóa, sau phản ứng với OG sản phẩm tạo thành là các hợp chất quinon có màu

- Thuốc thử 2: FeCl3 3%/ EtOH

FeCl3 là thuốc thử cho các hợp chất phenolic glycosid, sau phản ứng tạo phức màu tím

Sau khi nhúng thuốc thử, sấy bản mỏng ở 105oC trong vài phút, quan sát ở ánh sáng thường Kết quả sắc ký đồ thu được như sau:

Thuốc thử 1

H2SO4 10%/ EtOH

Thuốc thử 2 FeCl3 3%/ EtOH

Hình 3.2 Khảo sát định tính trên 2 nhóm thuốc thử

Qua khảo sát với 2 nhóm thuốc thử đã nêu trên nhận thấy nhóm thuốc thử 1 cho vết OG màu tím đen rõ, đậm dễ nhận biết trên nền bản mỏng Nhóm thuốc thử 2 cho vết OG mờ nhạt, khó nhận biết trên nền bản mỏng Vì vậy,