Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng một số chất phân lập được của cây bảy lá một hoa (paris polyphylla var chinensis franchet)

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MÃ VÂN KIỀU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var chinensis Franchet) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MÃ VÂN KIỀU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var chinensis Franchet) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu PGS.TS Đỗ Thị Hà Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Dƣợc liệu Bảy hoa 1.1.2 Vị trí phân loại chi Paris L 1.1.3 Đặc điểm thực vật .3 1.1.4 Sinh thái phân bố 1.1.5 Công dụng 1.1.6 Thành phần hóa học 1.1.7 Tình hình nghiên cứu định tính, định lƣợng .7 1.1.8 Tác dụng sinh học .8 1.2 MỘT SỐ HỢP CHẤT SẼ NGHIÊN CỨU TỪ BẢY LÁ MỘT HOA 10 1.2.1 Paris saponin I 10 1.2.2 Paris saponin II 11 1.2.3 Paris saponin V 12 1.2.4 Paris saponin VII 13 1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 14 1.3.1 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao .14 1.3.2 Máy HPLC 15 1.3.3 Các thông số đặc trƣng trình sắc ký 15 1.3.4 Ứng dụng kỹ thuật HPLC 16 1.3.5 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 18 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 20 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 20 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 20 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 21 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 22 2.3.2 Chuẩn bị chất đối chiếu 23 2.3.3 Khảo sát tìm điều kiện sắc ký .23 2.3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 24 2.3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .26 CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .27 3.1 ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27 3.1.1 Độ ẩm dƣợc liệu .27 3.1.2 Chiết xuất 27 3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .28 3.2.1 Lựa chọn cột sắc ký 28 3.2.2 Lựa chọn pha động 28 3.2.3 Lựa chọn tốc độ dòng 29 3.2.4 Lựa chọn bƣớc sóng phát 29 3.3 NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU 31 3.4 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA 33 3.4.1 Kiểm tra phù hợp hệ thống sắc ký .37 3.4.2 Độ lặp lại phƣơng pháp 39 3.4.3 Khoảng nồng độ tuyến tính .41 3.4.4 Độ 45 3.4.5 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) .43 3.5 ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG BẢY LÁ MỘT HOA 44 3.5.1 Xác định hàm lƣợng chất phần thân rễ Bảy hoa 44 3.5.2 Xác định hàm lƣợng chất phần thân rễ Bảy hoa thu hái đƣợc 45 3.5.3 Xác địn hàm lƣợng chất có số sản phẩm phân lập đƣợc từ Bảy hoa 47 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 51 4.1 VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 51 4.2 VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 51 4.3 VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 51 4.4 VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN CÁC DỊCH CHIẾT 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55 KẾT LUẬN 55 ĐỀ XUẤT .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AEPPC: Dịch chiết Bảy hoa (aqueous extracts of Paris polyphylla var chinensis) DAD: HPLC: Detector mảng diod (Diod Array Detector) Sắc ký lỏng hiệu cao (High-Performance Liquid Chromatography) HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ (High- Performance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry) LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification) NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) S/N: Tín hiệu/nhiễu đƣờng (Signal/Noise) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự PS I: Paris saponin I PS II: Paris saponin II PS VI: Paris saponin VI PS VII: Paris saponin VII PPC: Paris polyphylla var chinensis cs: Cộng DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm bột dƣợc liệu 27 Bảng 3.2 Sự phù hợp hệ thống HPLC thời gian lƣu .33 Bảng 3.3 Sự phù hợp hệ thống HPLC diện tích pic 34 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ lặp lại với PS VII 35 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ lặp lại với PS VI 36 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại với PS II 36 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ lặp lại với PS I 37 Bảng 3.8 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính PS VII 37 Bảng 3.9 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính PS VI 38 Bảng 3.10 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính PS II 39 Bảng 3.11 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính PS I 39 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ với PS VII 41 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ với PS VI 41 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ với PS II 42 Bảng 3.15 Kết khảo sát độ với PS I 42 Bảng 3.16 Tổng hợp kết khảo sát độ 43 Bảng 3.17 Kết khảo sát LOD LOQ 43 Bảng 3.18 Kết xác định nồng độ chất phân tích phần thân rễ Bảy hoa .….44 Bảng 3.19 Kết xác định hàm lƣợng chất phân tích phần thân rễ Bảy hoa .….45 Bảng 3.20 Kết xác định nồng độ chất có thân rễ số mẫu Bảy hoa 46 Bảng 3.21 Kết xác định hàm lƣợng chất có thân rễ số mẫu Bảy hoa 47 Bảng 3.22 Kết xác định nồng độ hàm lƣợng chất phân tích dung dịch thử phần mặt đất Bảy hoa 48 Bảng 3.23 Kết xác định hàm lƣợng chất phân lập PS II 49 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây bảy hoa - Paris polyphylla var chinensis Franchet Hình 1.2 Cấu trúc aglycon nhóm saponin steroid chi Paris.5 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học số hợp chất saponin steroid số loài thuộc chi Paris Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC 15 Hình 1.5 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 18 Hình 3.1 Phổ UV – Vis với detector DAD chất nghiên cứu .29 Hình 3.2 SKĐ hỗn hợp chất nghiên cứu 30 Hình 3.3 SKĐ dịch chiết Bảy hoa 31 Hình 3.4 SKĐ chất đối chiếu PS VII 31 Hình 3.5 SKĐ chất đối chiếu PS VI 32 Hình 3.6 SKĐ chất đối chiếu PS II 32 Hình 3.7 SKĐ chất đối chiếu PS I 32 Hình 3.8 SKĐ mẫu trắng 34 Hình 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PS VII 38 Hình 3.10 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PS VI 38 Hình 3.11 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PS II 39 Hình 3.12 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PS I 40 Hình 3.13 SKĐ dung dịch thử Bảy hoa thu hái Cao Bằng (trái) hỗn hợp chuẩn (phải) 46 Hình 3.14 SKĐ dung dịch thử phần mặt đất Bảy hoa (trên) hỗn hợp chuẩn (dƣới) 48 Hình 3.15 SKĐ dung dịch thử sản phẩm PS II phân lập đƣợc (a) dung dịch đối chiếu PS II (b) 50 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng số hợp chất phân lập từ Bảy hoa– Paris polyphylla var chinensis Franchet”, làm việc nghiêm túc, cố gắng, nỗ lực thân, tơi nhận đƣợc nhiều khích lệ từ phía thầy cơ, gia đình, bạn bè nhà trƣờng Trƣớc hết, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu PGS TS Đỗ Thị Hà ngƣời dành nhiều thời gian tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để hồn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS.ThS Cao Ngọc Anh cho tơi đóng góp q giá đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị em Khoa Vật lý – Đo lƣờng, Khoa Hóa thực vật, Viện Dƣợc liệu Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng Đã hỗ trợ tạo điều kiện cho tơi q trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt thời gian học tập trƣờng Tác giả trân trọng cám ơn tài trợ phần kinh phí từ Ngân sách nghiệp Khoa học Bộ Y tế, tên đề tài “Nghiên cứu Bảy hoa (Paris polyphylla var chinensis Smith theo hƣớng hỗ trợ điều trị ung thƣ vú, Đề tài cấp Bộ Y tế; 50/HĐ-K2ĐT, ngày 11/8/2017” Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè động viên mặt giúp đỡ tận tình trình học tập, nghiên cứu, động lực không nhỏ để có kết ngày hơm Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2018 Mã Vân Kiều ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xu hƣớng trở với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc sử dụng thuốc từ thảo dƣợc ngày tăng Ở Việt Nam, với lợi địa hình khí hậu tạo nguồn tài nguyên cỏ vô phong phú nhƣ nguồn dƣợc liệu dồi dào, với tri thức sử dụng cỏ làm thuốc lâu đời Bảy hoa (Paris polyphylla var chinensis Franchet) thuốc quý Việt Nam Bảy hoa (Paris chinensis) có vài khu rừng nguyên sinh vùng núi cao, có Vƣờn Quốc gia Pù Mát (Nghệ An), Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai) Trên giới, chi Paris biết có 22 lồi, phân bố Bhutan, Trung Quốc, India, Japan, Korea, Lào, Mongolia, Myanmar, Nepal, Nga, Sikkim, Thái Lan, Việt Nam Với thành phần hóa học Saponin steroid Polyphyllin, Bảy hoa (Paris chinensis) đƣợc chứng minh có tác dụng điều trị ung thƣ, cầm máu, giảm đau, chống viêm, cầm máu, kích thích miễn dịch, chữa rắn độc cắn, Ở Việt Nam, NCS Nguyễn Thị Duyên ngƣời nghiên cứu toàn diện thành phần hóa học tác dụng sinh học Bảy hoa (Paris chinensis), nhận biết, chiết xuất phân lập đƣợc môt số thành phần từ Bảy hoa gracillin, paris saponin D, paris saponin H, paris saponin I, paris saponin II, paris saponin VI, paris saponin VII, diosgenin, pennogenin, dioscin… Tuy nhiên chƣa có tài liệu xây dựng đƣợc tiêu chuẩn để kiểm nghiệm chất lƣợng dƣợc liệu sản phẩm có chứa Để đánh giá tiềm góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng số chất phân lập đƣợc Bảy hoa – Paris polyphylla var chinensis Franchet” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định tính định lượng HPLC số hợp chất phân lập từ Bảy hoa Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng số chất phân lập dược liệu sản phẩm chiết xuất từ Bảy hoa thu hái Việt Nam Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu PS VII 75 Sắc ký đồ giới hạn phát PS I 76 Sắc ký đồ giới hạn phát PS II 77 Sắc ký đồ giới hạn phát PS VI PS VII 78 Phổ UV-VIS Paris saponin I 79 Phổ UV-VIS Paris saponin II 80 Phổ UV-VIS Paris saponin VI 81 Phổ UV-VIS Paris saponin VII 82 Sắc ký đồ chồng phổ dung dịch chuẩn – thử Paris saponin I 83 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Paris saponin II 84 Sắc ký đồ dung dịch thử Paris saponin II 85 Chứng phân tích chất đối chiếu Paris saponin I 86 Chứng phân tích chất đối chiếu Paris saponin II 87 Chứng phân tích chất đối chiếu Paris saponin VI 88 Chứng phân tích chất đối chiếu Paris saponin VII 89 ... pháp định lƣợng số chất phân lập đƣợc Bảy hoa – Paris polyphylla var chinensis Franchet” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định tính định lượng HPLC số hợp chất phân lập từ Bảy hoa. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MÃ VÂN KIỀU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA (Paris polyphylla var chinensis Franchet) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC... II phân lập đƣợc (a) dung dịch đối chiếu PS II (b) 50 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng số hợp chất phân lập từ Bảy hoa Paris polyphylla var