Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả và độc tố tả còn hoạt tính bằng phương pháp ELISA nhằm làm cơ sở cho đánh giá chất lượng kháng thể và bào chế chế phẩm dùng đường uống từ nguồn nguyên liệu này.
Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 NGHIấN CU XY DNG PHNG PHP NH LNG KHÁNG THỂ IgY KHÁNG VI KHUẨN TẢ (Vibrio cholera) VÀ ĐỘC TỐ TẢ CỊN HOẠT TÍNH BẰNG ELISA Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương*; Ngơ Xn Trình* Hồ Bá Ngọc Minh*; Ngơ Thị Tuyết Mai*; Nguyễn Thị Hồng Thanh** TĨM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng vi khuẩn (VK) tả độc tố tả hoạt tính Đối tượng: kháng thể IgY kháng VK tả kháng độc tố tả sản xuất Học viện Quân y Phương pháp: thẩm định theo Hướng dẫn ICH, Bộ Y tế Việt Nam Kết quả: xác định điều kiện phân tích phương pháp ELISA nhờ phản ứng tạo màu phức hợp kháng thể - HRP với cromogen đo bước sóng 450 nm Phương pháp thẩm định, bảo đảm yêu cầu phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) Kết luận: xây dựng thẩm định phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả hoạt tính phương pháp ELISA * Từ khóa: Vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng vi khuẩn tả; Kháng thể IgY kháng độc tố tả; ELISA Determination of Activation of Anti-vibrio Cholera and Anti-vibrio Cholera Toxin IgY by ELISA Method Summary Objectives: Establishment and validation of IgY anti-vibrio and anti-vibrio toxin by ELISA Materials: IgY anti-vibrio and IgY anti-vibrio toxin were prepared at Vietnam Military Medical University Methods: Using ELISA method based on colourimetry of complex IgY-HRP-cromogen at 450 nm The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline Results: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ Conclusions: The quantification method of IgY anti-vibrio cholera and anti-vibrio cholera toxin was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health * Key words: Cholera; Anti-vibrio cholera IgY; Anti-vibriocholera toxin IgY; ELISA ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tả gây VK tả (Vibrio cholera) độc tố tả (Vibrio cholera toxin), đặc biệt nước nhiệt đới Việt Nam, mối đe dọa lớn sức khỏe cộng đồng Theo báo cáo WHO năm 2007, toàn giới có 177.963 trường hợp * Học viện Quân y ** Đại học Y khoa Vinh Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbd2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/08/2016 Ngày báo c ng: 07/09/2016 110 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 mc dch t v số tử vong 4.301 người [5] Hàng năm, có 100.000 người mắc tả 90% tập trung khu vực châu Á châu Phi Để điều trị tả, ngồi sử dụng biện pháp dự phòng điều trị kinh điển vắc xin, bù nước điện giải, kháng sinh…, việc sử dụng kháng thể kháng VK tả độc tố tả đường uống biện pháp hữu hiệu [4] Kháng thể IgY immunoglobin có tác dụng tốt để điều trị dịch bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc đường tiêu hóa [6, 7, 8] Hiện nay, Học viện Quân y chế tạo thành công kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả có nguồn gốc từ trứng gà mái gây miễn dịch [2] Nhằm làm sở cho đánh giá chất lượng kháng thể bào chế chế phẩm dùng đường uống từ nguồn nguyên liệu này, xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả hoạt tính phương pháp ELISA NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Kháng thể chuẩn IgY kháng VK tả (Vibrio cholera) IgY kháng độc tố tả (chuẩn đối chiếu) Virusys Corporation (Mỹ) cung cấp (10 µg/ml; 0,1 ml) - Kháng thể IgY kháng VK tả IgY kháng độc tố tả Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y cung cấp - Kháng nguyên: chủng VK tả (Vibrio cholerae) Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 cung cấp, phân lập từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân mắc bệnh tả Việt Nam giai đoạn 2010 - 2015 Độc tố tả Sigma (Mỹ > 98,0%) cung cấp - Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phân tích dược học vi sinh Phương pháp nghiên cứu Định lượng hoạt tính kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả phương pháp ELISA Thẩm định phương pháp theo dẫn ICH Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn định lượng giới hạn phát [1, 3] - Mẫu chuẩn: chuẩn bị chuẩn làm việc có nồng độ 1,56 - 50 ng/ml pha loãng chuẩn gốc IgY kháng VK tả độc tố tả (10 µg/ml) với dung mơi pha lỗng - Mẫu thử: sử dụng dung mơi pha lỗng kháng thể để chuẩn bị mẫu thử có nồng độ khoảng 10 ng/ml - Mẫu trắng: dung dịch đệm pha lỗng khống thể IgY (Virusys Corporation, Mỹ, IgY Sample Diluent 1x, chứa 10 mM Tris, pH 7,4 150 mM NaCl) * Tiến hành: kháng nguyên VK tả độc tố tả chuẩn bị nồng độ 7,5 x 106 CFU/ml 10 µg/ml 100 µl loại dung dịch gắn lên đĩa 96 giếng dung dịch đệm 0,1 M carbonatbicarbonat pH 9,6 40C để qua đêm Sau đó, thêm 200 µl dung dịch PBS chứa 0,05 Tween 20 1% BSA Các giếng sau ủ với 100 µl kháng thể IgY kháng độc tố tả VK tả với nồng độ khác nhiệt độ phòng Sau đó, ủ giếng với phức hợp HRP kháng thể IgG cừu kháng IgY gà Ở bước, rửa giếng với 200 µl dung dịch PBS chứa 0,05% Tween 20 Màu phản ứng khai triển cách thêm 100 µl dung dịch cromogen 1x (IAV_TMB chứa 3,3', 5,5;-tetramethylbenzidine) ủ tiếp 15 phút bóng tối Dừng phản ứng thêm 100 µl dung dịch axít HCl 1N Đem đọc mật độ quang bước sóng 450 nm 111 T¹p chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 KT QU NGHIấN CU Tớnh c hiu ca phương pháp (a) (b) (c) Hình 1: Kết quét phổ dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng VK tả (a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng (a) (b) (c) Hình 2: Kết quét phổ dung dịch đem đo quang định lượng IgY kháng độc tố tả (a) Dung dịch thử; (b) Dung dịch chuẩn; (c) Mẫu trắng Quét phổ để xác định cực đại hấp thụ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng Kết cho thấy phổ chuẩn phổ thử xuất cực đại hấp thụ bước sóng 450 nm Trên mẫu trắng khơng có cực đại hấp thụ này, cho thấy phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu Khoảng tuyến tính Chuẩn bị dãy chuẩn từ 1,56 - 100,0 ng/ml pha loãng dung dịch chuẩn gốc với dung dịch pha loãng (chứa 10 mM Tris, pH 7,4 150 mM NaCl) Thực phản ứng theo mô tả phương pháp nghiên cứu Đánh giá mối tương quan nồng độ IgY độ hấp thụ quang đo Kết trình bày bảng 1, hình 3, 112 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Bng 1: Mi tng quan gia mt độ quang nồng độ IgY kháng VK tả Nồng độ IgY kháng VK tả (ng/ml) Mật độ quang X SD 50 2,212 2,21 2,196 2,206 0,009 25 1,115 1,102 1,106 1,108 0,007 12,5 0,572 0,565 0,582 0,573 0,009 6,25 0,307 0,301 0,303 0,304 0,003 3,13 0,161 0,161 0,164 0,162 0,002 1,56 0,098 0,093 0,102 0,098 0,005 Độ hấp thụ lgY kháng VK tả Nồng độ (ng/ml) Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan mật độ quang nồng độ IgY kháng VK tả Bảng 2: Mối tương quan mật độ quang nồng độ kháng thể IgY kháng độc tố tả Nồng độ IgY kháng độc tố tả (ng/ml) Mật độ quang X SD 50 2,201 2,145 2,189 2,178 0,029 25 1,146 1,123 1,133 1,134 0,012 12,5 0,567 0,545 0,572 0,561 0,014 6,25 0,302 0,311 0,305 0,306 0,005 3,13 0,165 0,161 0,163 0,163 0,002 1,56 0,095 0,091 0,087 0,091 0,004 113 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 hp th lgY kháng độc tố tả Nồng độ (ng/ml) Hình 4: Đồ thị biểu diễn mối tương quan mật độ quang nồng độ IgY kháng độc tố tả Kết bảng 1, 2; hình cho thấy: nồng độ IgY nồng độ kháng thể IgY kháng độc tố tả mật độ quang có tương quan chặt chẽ với nhau, hệ số tương quan tuyến tính xấp xỉ Độ lặp lại Tiến hành xử lý mẫu với mẫu chuẩn kháng thể IgY kháng độc tố tả VK tả có nồng độ khác nhau: LQC (3,13 ng/ml), MQC (6,25 ng/ml)) HQC (25 ng/ml) Phân tích ngày, để bảo quản, sau phân tích sau ngày để xác định độ lặp lại phương pháp phân tích Bảng 3: Kết xác định độ lặp lại ngày khác ngày định lượng IgY kháng VK tả độc tố tả Loại LQC (3,13 ng/ml) IgY kháng VK tả 3,08 ± 0,04 IgY kháng độc tố tả 3,06 ± 0,05 1,29% 1,52% a c c 3,06 ± 0,04 1,23% a MQC (6,25 ng/ml) c 3,06 ± 0,05 1,64% b c 6,33 ± 0,07 1,11% b c 6,38 ± 0,11 1,67% a c 6,40 ± 0,09 1,40% a HQC (25 ng/ml) c 6,41 ± 0,08 1,24% b c a 24,82 ± 0,15 0,62% b c 0,57% a 25,59 ± 0,27 1,05% c b 24,85 ± 0,14 c b 25,67 ± 0,14 0,55% c (a Độ lặp lại ngày tính ± SD, n = 3; b) Độ lặp lại khác ngày (sau ngày) tính ± SD, n = 6; c) RSD tính SD/ × 100% Kết cho thấy, RSD mức nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn, kể ngày khác ngày < 2,0% Với kết này, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu độ lặp lại Độ Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ phương pháp định lượng Thêm lượng kháng thể IgY chuẩn vào mẫu thử biết hàm lượng Tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp lựa chọn Sau đó, đo mật độ quang bước sóng 450 nm dựa vào đường chuẩn để ngoại suy lượng thêm vào 114 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Bng 4: Kt qu xỏc nh định lượng IgY kháng VK tả độc tố tả LQC (3,13 ng) Loại MQC (6,25 ng) HQC (25 ng) Lượng tìm thấy (ng) Độ thu hồi (%) Lượng tìm thấy (ng) Độ thu hồi (%) Lượng tìm thấy (ng) Độ thu hồi (%) IgY kháng VK tả 3,10 ± 0,09 98,9 ± 2,7 6,26 ± 0,05 100,2 ± 0,8 25,22 ± 0,38 100,9 ± 1,5 IgY kháng độc tố tả 3,13 ± 0,08 100,1 ± 2,6 6,32 ± 0,05 101,2 ± 0,7 25,66 ± 0,20 102,6 ± 0,8 Ở mức thêm chuẩn, độ thu hồi mẫu đạt ≥ 98% Như vậy, phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu độ Giới hạn định lượng giới hạn phát Có nhiều phương pháp để xác định giới hạn định lượng giới hạn phát phương pháp Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp ngoại suy từ độ dốc đường tuyến tính độ lệch chuẩn mẫu trắng để xác định LOD LOQ, LOD = 3,3 × SD/δ LOQ = 10 × SD/δ; với SD độ lệch chuẩn mẫu trắng δ độ dốc đường tuyến tính Kết nghiên cứu xác định LOD LOQ IgY kháng VK tả IgY kháng độc tố tả 0,04 ng/ml 0,13 ng/ml * Áp dụng đánh giá số mẫu kháng thể IgY: Chúng áp dụng phương pháp định lượng để xác định lượng kháng thể IgY hoạt tính số mẫu sản xuất Học viện Quân y Bảng 5: Kết xác định lượng IgY kháng VK tả độc tố tả số mẫu Mẫu % IgY kháng VK tả hoạt tính % IgY kháng độc tố tả hoạt tính 67,6 ± 5,3% - 80,5 ± 7,3% - 96,1 ± 5,3% - - 88,5 ± 4,2% - 56,7 ± 8,3% - 94,5 ± 5,3% Như vậy, lượng IgY hoạt tính số mẫu sản xuất Học viện Quân y dao động mức khoảng ≥ 60% Điều mẫu lấy phân đoạn với phương pháp tách chiết tinh chế khác KẾT LUẬN Đã xây dựng phương pháp định lượng IgY hoạt tính kháng VK tả độc tố tả phương pháp ELISA Phương pháp thẩm định theo quy định chung ICH Bộ Y tế Việt Nam, đảm bảo yêu cầu tính đặc hiệu, độ (98,9 - 102,6%), độ xác (RSD < 2%), độ lặp lại, giới hạn định lượng giới hạn phát Xác định lượng IgY kháng VK tả độc tố tả mt s mu 115 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 cho thy lng khỏng thể hoạt tính IgY kháng VK tả từ 67,6 - 96,1%, IgY kháng độc tố tả từ 56,7 - 94,5%, tùy thuộc vào phương pháp tinh chế, tách chiết khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Cục Quản lý Dược - Bộ Y tế Sổ tay Hướng dẫn tạm thời đăng ký thuốc Ban hành kèm theo định số 229/QĐ-QLD ngày 12 tháng 08 năm 2010 2010 Hoàng Trung Kiên CS Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng VK tả (Vibrio cholerae) gà mái 2013, số ICH Validation of analytical procedures: text and methodology Q2R1 2005 Kazuyuki Hirai et al Passive oral immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY) to Vibrio cholerae effectively prevents 116 cholera Acta Med Okayama 2010, 64 (3), pp 163-170 World Health Organization., Cholera 2007 Wkly Epidemiol Rec Geneva 2008, 83, pp.269283 Xiao-Yu Li et al Chitosan-alginate microcapsules for oral delivery of egg yolk immunoglobulin (IgY): in vivo evaluation in a pig model of enteric colibacillosis Veterinary Immunology and Immunopathology 2009, 129 (1), pp.132-136 Xiao-Yu Li et al Chitosan-alginate microcapsules for oral delivery of egg yolk immunoglobulin (IgY) Journal of Agricultural and Food Chemistry 2007, 55 (8), pp.29112917 Yoshinori Mine, Jennifer Kovacs-Nolan Chicken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric infectious disease: a review Journal of Medicinal Food 2002, (3), pp.159-169 ... này, xây dựng phương pháp định lượng kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả hoạt tính phương pháp ELISA NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Kháng thể chuẩn IgY kháng. .. tích dược học vi sinh Phương pháp nghiên cứu Định lượng hoạt tính kháng thể IgY kháng VK tả độc tố tả phương pháp ELISA Thẩm định phương pháp theo dẫn ICH Bộ Y tế Vi t Nam gồm: tính đặc hiệu,... số mẫu kháng thể IgY: Chúng áp dụng phương pháp định lượng để xác định lượng kháng thể IgY hoạt tính số mẫu sản xuất Học vi n Quân y Bảng 5: Kết xác định lượng IgY kháng VK tả độc tố tả số mẫu