1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng resveratrol trong cốt khí củ, trong rượu vang nho và trong một số thực phẩm chức năng

119 301 1

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 119
Dung lượng 13,4 MB

Nội dung

DANH MỤC CÁC BẢNG1.2 Hàm lượng resveratrol trong sản phẩm từ đậu phộng 10 3.3 Ket quả khảo sát độ tuyến tính của resveratrol 44 3.7 Giới hạn phát hiện và định lượng của resveratrol trong

Trang 1

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N< • • • «

LUẬN VĂN THẠC SỸ • • Dược HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng

PGS.TS Vũ Đình

M Ã SỐ: 607315

T H Ư V Ị

TRƯỜNG ĐH ĐỮÍ

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kỉnh trọnọ, và biêt ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn TS Trần Việt Hùng - Trưởng Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiêm nghiệm thuôc Trung ương và PGS TS Vũ Đình H oàng - Phó tnrởng Phòng Quản lý Khoa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, những người thầy đã tận tình chỉ báo, hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gử i lời cảm ơn chân thành tới: PGS TS Thái Duy Thìn- Trường Đại học Dược Hà Nội, D S D ương Minh Tân- Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiêm nghiệm thuốc Trung ương, đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ quí báu của p h òn g quán lý sau Đại học, các thầy cô giáo Trường Đ ại học Dược Hà Nội, các bạn đồng nghiệp của Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ và góp ỷ kiến cho tôi hoàn thành luận văn.

Đê tài luận văn được hoàn thành với sự trợ giúp của Đe tài K H C N cấp Nhà nước, thuộc chương trình Hóa dược - mã sổ CN H D D D T021/10-1 l,tô i xin trân trọng cảm ơn chủ nhiệm âề tài và nhóm thực hiện đề tài.

Cuối cũng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quả trình học tập- nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

DS N G U YỄN THỊ THỦY HẰNG

Trang 3

MỤC LỤC

Trang bìa phụ

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Trang ĐẬT VẤN Đ È I

PHẦN 1 TỎNG Q U A N 3

1.1 TỐNG QUAN VÈ R E SV E R A T R O L 3

1.1.1 Công t h ứ c 3

1.1.2 Tính ch ấ t 3

1.1.3 ứ n g dụng của resveratrol trong y h ọ c 4

1.2 CÁC THẢO DƯỢC VÀ SẢN PHẨM CHỨA R E SV E R A T R O L 9

1.3 MỘT SÓ H Ư Ớ NG CẢI THIỆN HÀM LƯỢNG RESVERATRO L TRONG CÁC NGUYÊN L I Ệ U 12

1.4 MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP S Ủ D Ụ N G TRONG PHÂN TÍCH R E SV E R A T R O L 14

1.5 TÓNG QUAN VÈ PHƯƠNG PHÁP 18 1.5.1 Phương pháp xử lý m ẫ u 18

1.5.2 Phương pháp phân tích resveratrol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC ) và sắc ký lỏng khối phổ (LC - M S) 18

1.5.2.1 Sắc ký long hiệu năng c a o 18

1.5.2.2 Sắc kỷ lỏng khối p h ổ 22

PHẦN 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 27

Trang 4

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIÉT BỊ NGHIÊN c ứ u 27

2.2 ĐÓI TƯ Ợ N G , NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u 28 2.2.1 Đối tưọ'ng 28

2.2.2 Nội dung và phưong pháp nghiên cứ u 29

2.2.2.1 X ử lý m ẫ u 29

2.2.2.2 X ây dựng chương trình sắc kỹ HPLC- PDA và L C - M S 32

2.2.23 Thầm định phư ơng plìáp phân tích đã xây d ự n g 33

2.2.2.4 Định tính và định lư ợ n g 35

2.2.2.5 Tính toán kết quả và x ử lý số liệ u 35

PHẢN 3: KÉT QUẢ TH Ụ C N G H IỆ M 37

3.1 ĐỊNH TÍNH , ĐỊNH LƯỢNG RESV ERATRO L BẦNG SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG C A O 37

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc k ý 37

3.1.1.1 Lựa chọn cột sắc kỷ H PL C - P D A 37

3.1.1.2 Lựa chọn ph a đ ộ n g 37

3.1.1.3 Lựa chọn bước s ó n g 38

3.1.2 Thấm định chương trình sắc ký đã xây d ự n g 43

3.1.2.1 Đánh g iá tính ph ù hợp của hệ th ốn g 43

3.1.2.2 Khảo sá t độ lặp lại của phư ơng pháp 45

3.1.2.3 Khảo sá t độ đ ú n g 46

3.1.2.4 Giới hạn định lượng (LOQ) và giớ i liạn p h á t hiện (L O D ) 46

3.1.3 Định lượng resveratrol trong các đối tu ọng nghiên c ứ u 48

3.2 ĐỊNH TÍNH , ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL BẦNG SẤC KÝ LỒNG KHỚI P H Ố 49

3.2.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký lỏng khối p h ổ 49

3.2.1.1 Đ iều kiện sắc k ỷ 49

3.2.1.2 X ác định điều kiện khối p h ổ 50

3.2.2 Thiết lập chương trình LC - M S 51

3.2.3 Thẩm định phương p h á p 57

Trang 5

3.2.4 Định lu ọn g resveratrol trong rượu vang n h o 59

PHẦN 4: BÀN L U Ậ N 62

4.1 ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 62

4.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u 62

4.2.1 Qui trình xử lý m ẫ u 62

4.2.2 Phương pháp HPLC - P D A 63

4.2.3 Phương pháp LC - M S 63

4.3 KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 63

KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 65

KÉT L U Ậ N 65

KIÉN N G H Ị 67

TÀI LIỆU TH A M K H Ả O 68 PHỤ LỤC

Trang 6

High Performance Liquid ChromatographySắc ký lỏng hiệu năng cao

Liquid Chromatography - Mass SpectrometrySac ký lỏng khối phố

Limit o f detectionGiới hạn phát hiệnLimit of quantitationGiới hạn định lượngMicrowave-assisted extractionChiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóngProstaglandin E2

Pressurised solvent extractionChiết xuất bằng dung môi chiết ápRelative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đốiStandard Deviation

Độ lệch chuẩnSelected Ion MonitoringChọn lọc ion

Sắc ký đồSelected Reaction Monitoring Chọn lọc ion sau phản ứng Acid trifloroacetic

Ultraviolet - Visible Phổ tử ngoại- Khả kiến

DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TẤT

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Hàm lượng resveratrol trong sản phẩm từ đậu phộng 10

3.3 Ket quả khảo sát độ tuyến tính của resveratrol 44

3.7 Giới hạn phát hiện và định lượng của resveratrol trong các đối 47

tượne nghiên cứu

3.8 Kêt quả định lượng resveratrol trong nguyên liệu chiết xuất 48

vang nho và viên Thiên Bảo Vang Không Độ

3.9 Ket quả định lưcmg resveratrol trong cao chiết từ c ố t khí củ 483.10 Ket quả định lượng resveratrol trong rượu vang nho 493.11 Các thông số của khối phổ dùng để xác định resveratrol 52

3.13 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của resveratrol 573.14 Kết quả định lượng resveratrol trong rượu vang nho 61

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.2 Nho M uscadine & rumi chế biến từ loại nho M uscadine 10

1.4 Thiết bị LC-M S và nguyên lý của kỹ thuật phân tích ESI-MS 242*1 Thiết bị HPLC và LC - MS sử dụng trong nghiên cứu 27

2-3 Mầu rượu vana nho và mầu chiết xuất vang nho W SP0,5 293*1 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2, tỷ lệ pha động (50:50) 373.2 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2, tỷ lệ pha động (60:40) 383.3 Phố tử ngoại 3D của resveratrol trong m ethanol 393.4 Phố tử ngoại 2D của resveratrol trong m ethanol 393.5 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2 (10 |ig/m l), tỷ lệ pha động 40

(50:50)

3.6 Sắc ký đồ của m ẫu cao CX1, tỷ lệ pha động (50:50) 40

3 7 Sắc ký đồ của mẫu thử Thiên Bảo Vang Không Độ 413.8 Sắc ký đồ của mẫu nguyên liệu chiết xuất vang nho 41

Resveratrol-WSP0,5

3.9 Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho Tỷ lệ pha động (50:50) 423.10 Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho Tỷ lệ pha động (60:40) 423.11 Sắc ký đồ minh họa tính toán độ cân xứng của píc 433.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc 45

của resverartrol

3.13 Sắc ký đồ của duns dịch chuẩn resveratrol 0,06 |ig/m l 473.14 Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho Pha động MeOH - A 50

acetic 0,5% (60:40)

Trang 9

Sắc ký đồ LC - M S2 của mẫu thử chạy chế độ + ESI (SRM 59107); SKĐ chưa tích phân và xử lý

Sắc ký đồ LC - M S2 của mẫu thử chạy chế độ - ESI (SRM 60143); SKĐ sau khi đã tích phân và xử lý

Trang 10

ĐẶT VÁN ĐÈ

Ngày nay cùng với sự phát triển đi lên của đời sống xã hội, con người ngày

càng quan tâm nhiều hơn đến vấn đề sức khỏe Vì thế các thực phẩm chức năng bổ

dưỡng và hữu ích càng có cơ hội phát triển Bên cạnh các sản phẩm có nguồn gốc từ

con đường tống hợp hóa học, sinh học; các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng

thu hút được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu và phát triển ngày càng

mạnh mẽ Đi kèm với quá trình phát triển chung đó rất cần có sự quan tâm, kiểm

soát về hiệu quả và chất lượng để các thực phấm chức năng thực sự hữu ích đối với

sức khỏe con người Resveratrol - một hợp chất được biết từ lâu với nhiều đặc tính

ưu việt như phòng ngừa ung thư, bảo vệ tim mạch, giảm các bệnh liên quan đến tuổi

tác như tiểu đường, béo phì, chống oxy hóa, kéo dài tuổi thọ Từ trước đến nay đã

có rất nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng về resveratrol kể cả ở Việt Nam và

nước ngoài Đề tài khoa học công nghệ cấp N hà nước (CN H D Đ T 021/10-11) do

PGS.TS Vũ Đình Hoàng chủ trì với nhiệm vụ nghiên cứu công nghệ chiết tách

Resveratrol từ nguồn thực vật Việt Nam đang được tiến hành (2010 - 2011).

Hiện nay trên thị trường có một số chế phấm chứa resveratrol từ c ổ t khí củ

(viên nang mềm M adosna- Tập đoàn dược phẩm Viễn Đông) hoặc từ chiết xuất

vang nho (viên nang cứng Thiên Bảo Vang Không Độ- Công ty Dược phẩm Đông

Á) Tiêu chuấn chất lượng của các sản phẩm này công bố có resveratrol nhưng các

công ty này lại không có phương pháp kiểm tra chất lượng chúng Do đó việc xây

Trang 11

dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất resveratrol trong các sản phẩm

trên phục vụ công tác quản lý chất lượng là hết sức cần thiết

Nhàm góp phần thực hiện đề tài cấp Nhà nước nói trên đồng thời đánh giá chất

lượng một số sản pham có chứa resveratrol đã nêu, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu:

RESV ERATRO L TRONG CÓT KHÍ c ủ , TRONG RƯỢU VANG NHO VÀ TRONG MỘT SÓ T H Ụ C PHẨM CHỨC NĂNG

Đe tài gồm 2 mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng resveratrol bàng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ (LC - MS)

2 Tiến hành định tính, định lượng resveratrol trong c ố t khí củ, trong rượu vang nho

và trong một sô thực phẩm chức năng

Trang 12

PHẦN 1: TỎNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VÈ R E SV ER A TR O L

1.1.1 Công thức

- Tên khoa học: trans 3, 5, 4'- Trihydroxystilbene, hay 3, 4', 5-Stilbenetriol;

hay trans- resveratrol; hay (E)-5-(p- Hydroxystyryl) resorcinol.

- Công thức hóa /iợc|39|’[531

- Công thức phân tử: Ci4H 120 3

+ Thông thường resveratrol thường tồn tại dưới hai dạng cis và trans, resveratrol

ở dạng trans khi gặp nhiệt, hoặc tia tử ngoại thì biến thành dạng cis Resveratroỉ là một stilben có nối đôi dễ bị không khí và ánh sáng phân huỷ Phần lớn resveratrol trong thực vật tồn tại dưới dạng glucoside - với tên gọi là piceid, thường gấp 4-5 lần resveratrol dạng tự do (xem hình dưới)[39] [53].

Trang 13

- O H 0H Piceid

1.1.3 ứ n g dụng của resveratrol trong y học

Resveratrol là một polyphenolic được tìm thấy trong một số lượng lớn các loài thựcvật (ít nhất 72 loài) mà một lượng lớn trong số chúng là hợp phần trong chế độ ăncủa con người bao gồm: cốt khí củ, dâu tằm, lạc, nho và rượu vang đ ỏ c ấ u trúc

hóa học của resveratrol được xác định là trans 3,5,4 trihydroxystilbene Từ nhiều

năm nay resveratrol đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học Resveratrol được giảđịnh như là m ột nhân tố quan trọng trong việc ngăn neừa các quá trình bệnh lý như

là quá trình viêm, chứng vữa xơ động mạch, stress oxy hóa, chất sinh ung thư Kếtquả khảo sát trên súc vật thí nghiệm cho thấy nó có nhiều tác dụna, trên nhiều loạibệnh tật nguy hiểm, bảo vệ hệ tim mạch, phòng bệnh thần kinh (Alzheimer,Parkinson), phòng và điều trị được nhiều dạng ung thư, kể cả một số ung thư đã dicăn, chống virus, chống nấm, chống viêm, chống oxy hóa, chống béo phì, tăngcường thê lực và kéo dài tuổi thọ Nhiều nhà khoa học còn cho rằng: Resveratrol là

hy vọng sống của người bệnh tiểu đường, ung thư tiền liệt

Resveratrol và bệnh ung thư

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây chỉ ra rằng resveratrol có tác dụng điều trị khả quan nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, ung thư tuyến giáp, các khối u ác tính và u nguyên bào thần

k in h C ác tác dụng ức chế tăng trưởng của resveratrol được thực hiện gián tiếp thông qua việc ngăn chặn sự hoạt hóa của một vài yếu tố sao chép, bao gồm NF- kappaB, A P -l,E g r-l (loại hoạt chất có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào ung thư chống lại các liệu pháp tiêu diệt chúng); ức chế các men protein kinaza[l5][l9]'[22| [3ll [361'[45]

Trang 14

Hợp chất resveratrol chứa trong rượu vang đỏ có tác dụng chống độc thần kinh do beta-amyloid Beta-A m yloid peptide (Abeta) là một chất gây độc thần kinh, đã được xác định gây chết tế bào ở mức độ cao trong suốt thời gian bị bệnh Alzheimer Resveratrol, m ột polyphenol tự nhiên, được tim thấy chủ yếu trong rượu vang đỏ,

có tác dụng bảo vệ tim Một lượng vừa phải rượu vang tương quan với việc giảm nguy cơ mắc bệnh A lzheim er nên một hiệu quả bảo vệ thần kinh bổ sung được xem như là của resveratrol Nó duy trì sự sống của tế bào và có hoạt tính chống oxy hoá

bằng cách tăng cường glutathion làm sạch các gốc tự do nội bào|5]'[131’[20] |48].

Chống lão hóa

về khả năng chống lão hóa, resveratrol tác động lên enzym bảo vệ sự sống của tế bào, mà enzym này có tác dụng kéo dài thời gian các tế bào cần phải có để sửa chữa ADN bị hỏng Resveratrol cũng được xác định trên việc kéo dài tuổi thọ của chuột Việc ảnh hưởng của các chất bố sung resveratrol đến quá trình lão hóa ở người chưa được xác định

Resveratrol kéo dài tuổi thọ của nhiều loài khác nhau như nấm men (Saccharom yces cerevisiae), giun tròn (Caenorhabditis elegans) và ruồi giấm (Drosophila m elanogaster) Đối với các sinh vật này, tuổi thọ kéo dài phụ thuộc vào Sir 1, đây là m ột enzym deacetyl được bảo tồn nhằm tăng cường các tác dụng có lợi của quá trình hạn chế calo Resveratrol tạo ra các thay đổi liên quan đến khả năng kéo dài tuổi thọ, bao gồm tăng sự nhạy cảm với insulin, các mức độ yếu tố -1 tăng trưởng giống insulin (IGF-1) bị suy giảm, tăng hoạt tính của men protein kinaza hoạt hoá AM P (AM PK) và chất đồng kích hoạt gam m a thụ thể hoạt hoá sản sinh tế bào peroxisom e 1 alpha (PGC-1 alpha), số lượng các ty thể tăng và chức năng vận động được tăng cườngíl3ỉ'f201'15211531

Resveratroỉ và bệnh Alzheimer

Trang 15

Fig 3 Exam ple of Actions o f the SlRT* 1 Gene

Hình 1.1: Sơ đồ mô tả hoạt động của gen SIRT-1|S2]

Kháng nấm

Resveratrol có tác dụng chống nấm mạnh, chống lại các loại nấm gây bệnh ở người trong khoảng nồng độ 10-20 |ig/m l Sự tiêu diệt các tế bào nấm C.albicans bởi resveratrol đã được xác định bằng phương pháp quét kính hiển vi điện tử Các kết quả này đưa ra giả thuyết rằng resveratrol có thể được sử dụng như là chất điều trị nhiễm nấm ở người^35^ 51^

Ngăn chặn tái tạo virus cúm

Trong các thí nshiệm nuôi cấy tế bào, resveratrol đã ngăn chặn quá trình tái tạo virus cúm, đạt hiệu quả lớn nhất 3 giờ sau khi phơi nhiễm cúm Resveratrol đạt hiệu quả nhỏ hơn nhưng vẫn đáng kể khi điều trị được tiến hành bắt đầu 6 giờ sau khi nhiễm, tuy nhiên tại thời điểm 9 giờ sau khi bị nhiễm, resveratrol không có tác dụng[40]

Trang 16

Giảm sụ oxy hóa và tăng trưỏìig các tế bào biếu mô sắc tố võng mạc người

Nghiên cứu chỉ ra răng: Quá trình trên tác độne thông qua ức chế men kinaza điều chỉnh tín hiệu ngoại bào[l61'|2ll'[341

Hiệu quả kháng viêm của Resveratrol đối với các tế bào biểu mô phối

Nghiên cứu chỉ ra rằng: cả resveratrol và quercetin đã ức chế quá trình sao chép phụ thuộc N F-kappaB-, AP-1- và CREB đến một mức lớn hơn so với glucocorticosteroid, dexam ethasone12’1

Abeer H Harb và cộng sự đã thử nghiệm hiệu quả chống viêm của resveratrol trên chuột và nhận thấy: quá trình giảm viêm phụ thuộc liều; sự ức chế này có ý nghĩa thống kê sau 3h và lh với liều 13,40 mg/kg tương ứng Hiệu quả chống viêm của resveratrol đươc tìm thấy m ột cách độc lập ở tuyến thượng thận nhưng có thể liên quan tới việc ức chế các nhân tố gây viêm và gốc tự do Một vài ý kiến khác cho rằng hiệu quả chổng viêm của resveratrol là do ức chế hoạt tính cyclooxygenase, làm giảm tạo prostagladin E2 (PGE2); đồng thời ức chế con đường phát sinh NO, làm giảm quá trình tổng hợp NO trên các đại thực bào và các tế bào nuôi cấy có hoạt tính

Đi kèm với hiệu quả chống viêm, resveratrol còn được đánh giá ở quá trình giảm đau trong đó resveratrol được cho rằng làm giảm số lượng các cơn đau có phụ thuộc liều Khi các mô, tế bào tổn thương bị kích thích, chúna, giải phóng ra các thành phần như H +, PG E2 hay 5-hydroxytryptam ine (5-HT) và gây đau tại chỗ Bản thân acid acetic có thể gây đau, cùng lúc đó, nó kích thích mô giải phóng PGE2 gây đau hơn Resveratrol tạo ra chống lại quá trình tiếp nhận cảm giác đau thông qua ức chế

có chọn lọc cyclooxygenase-1 và cyclooxygenase-2 (COX1 và COX2) Thêm vào

đó, resveratrol còn được báo cáo về khả năng ức chế sản xuất prostaglandin E2 và dọn sạch gốc tự do ở các tế bào vi thần kinh đệm có hoạt tính Một khả năng khác, việc mở kênh C a2+- K + bởi resveratrol có thể làm giảm thêm sự khử cực dẫn đến chống lại quá trình nhận cảm đau[l2]

Chống lại các rối loạn tim mạch do oxy hóa

Trang 17

Sự sản sinh mạnh mẽ các chất chống oxy hóa tế bào và các enzym giai đoạn 2 bằng resveratrol trong các tế bào cơ tim: bảo vệ chống lại tổn thương do oxy hóa và ái điện tử Đe nghiên cứu các tác dụng bảo vệ tế bào với các tốn thương này, các tế bào H9C2 được ủ bằng resveratrol sau đó cho tiếp xúc với men oxy hóa xanthin (XO)/xanthin, 4-hyđroxy-2-nonennal hoặc doxorubicin Thêm vào đó, điều trị dự phòng bằng resveratrol đã dần tới việc giảm đáng kể sự tích tụ các gốc tự do nội bào ROS gây ra bởi X O /xanthin1' 2^ 13) [241.

Ngoài những tác dụng nói trên, resveratrol còn được nghiên cứu với nhiều hiệu quả tiềm tàng khác như các tác dụng trên cơ trơn và trên huyết ápll2],[13]

Hiệu quả chống co thắt

Nghiên cứu này chỉ ra rằng, sự giãn của ruột hồi theo chiều dọc và cơ vòng bàng quang phụ thuộc vào nồng độ của resveratrol Kết quả này cũng phù hợp với những nghiên cứu về hiệu quả giãn cơ của resveratrol trên các cơ trơn riêng biệt Cơ chế sự nới lỏng của resveratrol không được chỉ ra từ những thử nghiệm này nhưng được quan sát từ những trường hợp tương tự M ột vài nghiên cứu khác chỉ ra rằng nitric oxide nới lỏng ruột hồi và bàng quang thông qua việc làm tăng tổng hợp cGMP Mặt khác, resveratrol kích thích sự giãn mạch thông qua kích thích NO/cGM P ở chuột và nghiên cứu còn chỉ ra ràng resveratrol không kiểm soát hệ thống GC/cGM P ở cơ trơn mạch vành và gây ra một đáp ứng giãn m ạch1' 21

Hiệu quả của resveratrol trên huyết áp

Trong nghiên cứu này, resveratrol làm giảm huyết áp động mạch ở những chuột được gây tê có huyết áp bình thường khi tiêm tĩnh mạch M ặc dù một hợp phần có hiệu quả của resveratrol trên cả huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương là tạm thời nhưng nói chung, không trở về được mức cơ bản ban đầu Hiệu quả hạ áp của resveratrol trong nghiên cứu này do tăng tạo NO từ màng trong hệ mạch Thêm vào

đó, resveratrol giúp khôi phục hoạt tính eNOS trên động mạch chủ của chuột và bình thường hóa huyết áp Sự phát sinh NO trên những tế bào màng trong bởi eNOS

có vai trò lớn trong việc kiểm soát huyết áp

Trang 18

Tóm lại, những kết quả này chứng minh rằng trans-reveratrol có hiệu quả chống co thắt, hạ áp, chống viêm, giảm đau khi thử nghiệm trên chuột và thành phần này có thể phát triển thành m ột liệu pháp điều trị từ thực vật hữu ích trong việc kiểm soát huyết áp động mạch, viêm , đau c ầ n tiến hành thêm các thử nghiệm để làm sáng tỏ

cơ chế hoạt tính của hợp phần này1121'1131'1491

Tác dụng phụ của Resveratrol

Một vấn đề đặt ra là: với nhiều tác dụng hữu ích như thế, resveratrol có các tác dụng phụ không? Tuy nhiên, các nghiên cứu về resveratrol trên người rất ít nên chúng tôi không biết được đầy đủ các phản ứng phụ hay các lợi ích của resveratrol tại thời điếm này Tính đến hết tháng 11 năm 2003, không có các phản ứng phụ của resveratrol được đề cập tới trong các tài liệu y học

1.2 CẢC THẢO DƯỢC VÀ SẢN PHẨM CHỨA RESV ERATRO L

Resveratrol được tìm thấy ở nhiều cây trong thiên nhiên mà những tính chất dễ thấy nhất của các loài này là chống nấm Một số loài thực vật chứa hàm lượng đáng kể resveratrol như là: nho, nhất là nho xạ, cốt khí củ, cây lạc, cây việt quất Ngoài ra resveratrol còn tìm thấy trong một vài loại thông như Scots pines và eastern white

p i n e [6],[33].[44],[52]_

Resveratrol có nhiều trong các loại nho, tập trung nhiều nhất ở vỏ và hột Loại nho

có tên là m uscadine (Vitis rotiindifolia) hay nho xạ, có nguồn gốc ở miền đông nam

Hoa Kỳ, từ Delaware tới vịnh Mexico; vỏ và hột của chúng cho một hàm lượng resveratrol cao gấp nhiều lần Hàm lượng resveratrol trong nho thay đổi tùy theo giốns nho, thố nhưỡng nơi trồng và khả năng kháng nấm của chúng Giống nho nếu

ít bị nấm thì hàm lượng resveratrol cao hơn loại bị nấm [6]'[29]'[53]

Trang 19

Hình 1.2 : Nho Muscadine & rượu chế biến tò loại nho Muscadine

Hàm lượng resveratrol trong một số đồ uống được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 1.1: Hàm lượng resveratrol trong một số đồ uống

í

Rượu vang làm tò loại nho Muscadine (Mỹ) 1 4 ,1 -4 0

Resveratrol còn được tìm thấy trong đậu phộng với hàm lượng được trình bày ở bảng 1.2 dưới đây:

Bảng 1.2: Hàm lượng resveratrol trong các sản phẩm từ đậu phộng

Cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc, họ rau răm, Polygonaceaeyl được

ưa chuộng vì đây là loài thực vật dễ trồng, hàm lượng dược chất cao, đã có tò lâu

Trang 20

trong đông y không có độc tính Resveratrol cũng được tống hợp hóa học, sản phẩm tổng hợp chủ yếu dùng để sản xuất mỹ phẩm Quá trình tổng hợp cần các hóa chất đắt tiền, phức tạp nhưng hiệu quả kinh tế không cao nên ít dùng Vì vậy, từ cácnguyên liệu thiên nhiên, resveratrol được sản xuất bằng chiết xuất dung môi, một số tài liệu còn kết hợp với enzym hoặc siêu âm Hiện nay trên thị trường có nhiều loại chế phẩm có hàm lượng resveratrol khác nhau16^ 29^.

Rễ Cốt khí khô là thuốc nổi tiếng ở Trung Quốc cũng như ở N hật Bản Nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị nhiễm trùne da, bệnh lậu, chốc đầu chân và bệnh tăng lipid máu Các thành phần hóa học đa dạng được phân lập từ loài thực vật này bao gồm: anthraquinone, stilbene, flavonoid và các phenol khác (đáng quan tâm nhất là resveratrol và piceid) Các thành phần này được làm sáng tở dựa trên những bằng chứng về hóa học và kỹ thuật quang phổ bao gồm những phương pháp như cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều[l8)

Liu Y và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chịu nhiệt và cơ chế phản ứng chuyển dạng đồng phân của trans-resveratrol bằng phương pháp HPLC và LC-ESI/M S Cột sắc ký pha đảo Hypersil-ODS được sử dụng cùng với hệ dung môi pha động chứa methanol - nước (60:40) thêm 0,05% trifluoroacetic cho HPLC; 0,1% acid formic

và 5 mmol/1 am m onium formate cho LC-ESI/M S D etector mảng diode thiết lập tại bước sóng 300 nm Khối phổ ion âm được tiến hành Kết quả cho thấy: sau khi bảo quản trong thời gian 600 giờ, nồng độ trans-resveratrol giảm nhẹ ở điều kiện dưới

phản ứng chuyên dạng đông phân trans và cis- resveratrol với bước sóng kích thích

254 nm và 365 nm được thử nghiệm bởi phương pháp LC-ESI/M S cho thấy sự đồng phân hóa dựa trên trạng thái p và một số phản ứng thứ cấp xẩy ra triệt đ ế 37'

Ớ một nghiên cứu khác, Fulvio M attivi và cộng sự đã phân lập từ rượu vang đỏ và

mô tả đặc tính của trans- resveratrol, cis- resveratrol, trans-resveratrol Í3-D- glucopyranoside và cis-resveratrol B-D-glucopyranoside Chiết xuất từ vỏ nho và tính chất hóa học thay đổi của bốn thành phần trong quá trình làm rượu vang thông thường đã được kiểm soát cho thấy mối quan hệ gần gũi về tính chất giữa các thành

Trang 21

phần Các nhân tố ảnh hưởng của mô hình, như là nồng độ ethanol, sự thủy phân chia tách một nửa phân tử glucose trong glucoside và dạng đồng phân trans/cis được thảo luận dựa trên các số liệu thí nghiệm.

Resveratrol (3,5,4 - trihydroxystilbene) và các sản phẩm trùng họfp của nó là các thành phần tự nhiên, tìm thấy trong đa dạng các họ thực vật Nho và các sản phẩm liên quan có thể là loại thực phẩm quan trọng nhất chứa những thành phần này Hydroxy hóa stilbene đã được thử nghiệm cả ở vai trò sinh học chống lại các nguồn bệnh và cả ở những đặc tính dược lý của chúng Họ Vitis được mô tả bởi sự có mặt một lượng lớn các thành phần tương tự trong hột, lá và rễ Gần đây, Siemann và Creasy giả thuyết về một mối liên quan giữa sự giảm lắng đọng lipid trong gan chuột bởi trans-resveratrol và các nghiên cứu lâm sàng về mức giảm lipid trong huyết thanh trên những người uống rượu vang M ột trong những cơ chế dược lý dựa trên việc chứng minh sự ức chế quá trình oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp bởi các phenolic Lợi ích có thể có của rượu vang trên sức khỏe con người do sự có mặt của resveratrol còn nhiều tranh cãi, bởi vì, trong nhiều trường hợp, nồng độ ước định rất thấp, vì thế không thể có một lượng đủ theo nguyên tắc hoạt động với một mức sử dụng rượu vang thông thường[241'[25],[47]

Các nguyên liệu dùng đế chiết xuất thường có hàm lượng resveratrol thấp Thôngthường hiệu suất chiết resveratrol từ c ố t khí củ đạt 0,0378% - 0,115%; trong bộtchiết từ phế thải nho đạt hàm lượng 0,81% Vì hàm lượng resveratrol trong cácnguyên liệu trên rất thấp nên để định lượng chúng cần sử dụng các phương pháp có

độ chính xác và độ nhạy cao như phương pháp HPLC, LC - MS đồng thời phải ứngdụng các phương pháp chiết xuất tối ưu để tạo ra hàm lượng resveratrol ở mức cao

Trang 22

-dạng có sinh khả dụng thấp hơn nhiều Theo truyền thống, aglycone được tạo ra từ quá trình thủy phân bằng acid hay enzym từ dạng glucoside của nó; nhưng điều kiện khắc nghiệt, ô nhiễm acid trong phản ứng thuỷ phân và chi phí enzym cao làm hạn chế trong phát triền công nghiệp của phương pháp này Trong nghiên cứu này, H Wang và cộng sự đã tiến hành lên men thành công p cuspidatum bởi nấm A oryzae; trong suốt quá trình đó, piceid được chuyển thành resveratrol với lượng cao nhất 1,35% trans-resveratrol, cao gấp 3,6 lần so với lượng thu được từ thảo dược thô chiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóng Lượng trans-resveratrol tạo ra cao gấp3,1 lần sau thời gian ủ 24h Do đó, chuyển hóa sinh học là phương pháp tốt hơn để làm tăng lượng resveratrol bởi lượng tạo ra cao hơn và điều kiện dễ dàng hơn

Nguyên liệu thô sau khi được thủy phân bằng dung dịch H 2S 0 4 (1% w/w) hoặc enzym cenllulase được ủ trong bình rung ở 25°c, 150 vòng/phút Dịch thu được đem ly tâm và pha loãng trong methanol, tiến hành phân tích bàng HPLC sử dụng cột pha tĩnh Krom asil c 18 (5 |im , 4.6 X 250 nm); pha động là nước (A) và acetonitril (B) Trans-piceid và trans-resveratrol được tách theo chương trình thời gian sau: 0-7 phút: 31% B; 7-15 phút: 31-60% B, nhiệt độ phòng, tốc độ dòng 0,7 ml/phút Quá trình này được thực hiện ở bước sóng 306 nm, cả trans-piceid và trans-resveratrol đều hấp thụ tối đa127' Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến lượng trans-resveratrol tạo

ra như nhiệt độ, thời gian ủ, hoạt tính en zy m Vì thế, cần phải kiểm soát tất cả các yếu tố này và tối ưu hóa các quá trình sinh học để làm tăng lượng trans-resveratrol Chiết xuất 2 pha tan trong nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng được thử nghiệm để phát hiện các thành phần có hoạt tính, bao gồm piceid, resveratrol và emodin trong c ố t khí củ Hệ thống hai pha tan trong nước chứa 25% (w/w) ethanol, 21% (w/w) (NH4)2S 0 4 với lượng cân bằng piceid và một lượng gấp 1,1; 1,9 lần resveratrol và emodin tương ứng, so với hiệu quả của chiết xuất dưới sự hồ trợ của vi sóng và chiết xuất nhiệt ngược dòng Ba tiến trinh riêng biệt; chiết xuất, lọc, cô đặc do đó tạo ra một lượng resveratrol lớn hơn với chi phí thấp hơn Đây là một phương pháp hữu ích tiềm năng để tách và tinh chế các sản phẩm mục tiêu Chiết xuất cổ điển 3 thành phần trên là chiết xuất nhiệt ngược dòne bàng ethanol Tuy nhiên, chúng cần

Trang 23

một lượng ethanol lớn hơn, đồng thời cũng tốn thời gian hon Thêm vào đó, quá trình lọc và cô đặc là cần thiết trước khi tinh chế bằng sắc ký cột Kết quả lượng sản phẩm tạo ra ít hơn với chi phí cao hơn Chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng (MAE)

là một phương pháp lựa chọn thay thế cho chiết xuất các thành phần từ thảo dược bởi những lợi ích của nó như thời gian chiết xuất ngắn, sử dụng ít dung môi và đem lại hiệu quả cao

Chiết xuất 2 pha tan trong nước (ATPE) sử dụng hệ thống dây chuyền alcol/muối được áp dụng đế tinh chế các hợp phần tự nhiên với chi phí thấp, dễ thu hồi alcohol bằng cách bay h ơ i Hệ EtOH / (NH4)2S 0 4 được lựa chọn để tách riêng resveratrol

từ chiết xuất của Cốt khí củ và tinh chế resveratrol đạt mức đỉnh 34,29%

Trong nghiên cứu này, dịch chiết pha loãng được phân tích bằng HPLC, pha tĩnh là cột C Ị8 Kromasil (5 |im , 4,6 X 250 nm); pha động chứa nước (A) và acetonitril (B) Trans-piceid, trans-resveratrol và emodin được tách theo chương trình sau: 0-15 phút: 31-50% B; 15-20 phút: 50-98% B; 20-25 phút: 98% B tại nhiệt độ phòng, tốc

độ 0,7ml/phút Q uá trình tách rửa được ghi lại theo chương trình: 0-18 phút tại 306

nm, khi cả trans-piceid và trans-resveratrol hấp thụ cực đại, 18-30 phút tại 254 nm với sự hấp thụ cực đại của em odin[28'

Trong hơn mười năm qua, ngày càng có sự quan tâm nhiều hơn đến việc sử dụng các kỹ thuật chiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóng (M AE) và dung môi chiết áp (PSE) trong các phòng thí nghiệm phân tích Một số thử nghiệm chứng minh rằng

cả hai kỹ thuật trên cho phép giảm dung môi tiêu thụ và rút ngắn thời gian chiết xuất, trong khi lượng tạo ra trong chiết xuất của những phép phân tích này là ngang bằng hoặc thậm chí nhiều hơn so với các phương pháp thông thường

MAE và PSE nổi bật lên như là các phương pháp hấp dẫn so với các phương pháp chiết xuất thông thường như Soxhlet, chiết ngâm, sắc, chiết xuất ngược dòng, siêu

âm và một số trường hợp chưng cất n h iệ t *17]

RESV ERATRO L

Trang 24

Có 2 phương pháp chính được sử dụng trong phân tích định lượng resveratrol: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Một

số nghiên cứu đã công bố cả ở Việt Nam và trên thế giới đều tập trung vào 2 phương pháp này

Tao Yi, Hao Zhang và Zongwei Cai đã ứng dụng phương pháp HPLC với bộ phận phát hiện photodiode mảng và ESI/MS được phát triển để phân tích định tính và định lượng các thành phần hóa học chính trong thân rễ khô c ố t khí củ Dựa trên sắc

ký đồ riêng rẽ trên cột Altim a c 18 sử dụng pha động acid acetic và acetonitril, 9 thành phần, bao gồm stilbene, stilbene glucoside, anthraquinone, anthraquinon glucoside, được xác định bằng phân tích ESI/MS trực tuyến và 7 thành phần được xác định bằng HPLC - PAD Các giá trị đầy đủ của phương pháp bao gồm độ nhạy,

độ tuyến tính, độ lặp lại và độ tìm lại đã được kiểm soát Khoảng tuyến tính của nồng độ từ 1-200 m g/L với R2 > 0,9999; trong khi giới hạn phát hiện trong khoảng0,51 đến 1,57 ng Độ lặp lại được xác định và giá trị RSD trong khoảng 1,79 % Độ thu hồi khoảng 96,0-100,1% với giá trị RSD < 2,2% Năm mầu c ố t khí củ từ những vùng khác nhau được nghiên cứu đế phát triển phương pháp Các thành phần chính piceid, resveratrol, emodin-8-O-B-D- glucoside và emodin được lựa chọn để cung cấp các chỉ số cho việc xác định chất lượng các thuốc thảo dược

Phân tích HPLC - PAD tiến hành trên máy Agilent (Palo Alto, CA.USA) tại bước sóng 29Ơ nm, cột A ltim a c 18 (250x4,6 mm, 5|im ) Pha động chứa 0,5% acid acetic trong nước (A) và acetonitril (B) theo chương trình: 10-40% B trong 0-35 phút, 40- 100% B trong 35-60 phút với tốc độ dòng 1 m l/phút tại nhiệt độ 30°c Phân tích HPLC - ESI/M S sử dụng cả 2 chế độ ion dương và ion âm, tốc độ 7 L/phút[42] Phương pháp HPLC cũng được sử dụng để định lượng trans-resveratrol và chất chuyển hóa của nó trong nước tiểu và trong huyết tương người Nghiên cứu mô tả phương pháp HPLC pha đảo, bước sóng phát hiện 325 nm để xác định mức resveratrol và 6 chất chuyến hóa chính trong huyết tương và trong nước tiểu người tình nguyện sau khi uống một liều lg Sử dụng pha tĩnh cột Atlantis Ci8,3^m; đệm ammonium acetate và methanol, chứa 2% propan-2-ol Khoảng phát hiện từ 5

Trang 25

ng/mL đến 500 ng/mL trong huyết tương, (5-1000 ng/mL) trong nước tiểu Độ thu hồi trung bình của resveratrol là 58 ± 3% Những kết quả trên cho thấy, đây là một phương pháp nhanh, nhạy và chính xác để phân tích resveratrol và các chất chuyển hóa của chúng trong nước tiểu và huyết tương người cho các nghiên cứu dược động

Ngoài ra, Phương pháp HPLC - ƯV/DAD cũ n s được ứng dụng trong phân tích thường qui rượu vang đỏ, vỏ nho và các sản phẩm phụ làm rượu vang để xác định trans-resveratrol và quercetin trong chúng Đặc biệt, hàm lượng cao quercetin được tìm thấy trong bã rượu vang, vì thế có thể sử dụng các sản phẩm phụ này như một nguồn phenolic hữu ích cho việc thúc đẩy sức khỏe con người1231

Những nghiên cứu gần đây về resveratrol tập trung hướng các nhà khoa học ở khía cạnh hiệu quả bảo vệ tim mạch và chống ung thư của nó Các thử nghiệm khoa học minh chứng một cách rõ ràng rằng resveratrol giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch

và ung thư Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu công bổ về khả năng hấp thu và thải trừ của resveratrol, xác định sản phẩm chuyến hóa và hiệu quả của chúng trên gan Nghiên cứu của Yoxing được thiết lập để thử nghiệm in vitro về chất chuyển hóa của resveratrol trên m icrosom e gan chuột ở 37°c Phương pháp sắc ký lỏng kết nối khối phổ và sắc ký lỏng đa kênh điện hóa (LC - MS và LC - EC) được ứng dụng để xác định chất chuyển hóa chính của nó Kết quả cho thấy: với chế độ MS ion âm, bên cạnh đỉnh resveratrol tại m/z 227, còn quan sát thấy đỉnh của chất chuyển hóa tại m/z 243 tương ứng với sản phẩm chuyển hóa piceatannol MS 2 lần xuất hiện thêm một số mảnh ion tại m/z 225, 201 175 và 159 tương ứng với các mảnh được quan sát trên sắc đồ của piceatannol chuẩn và dung dịch chuyển hóa Nghiên cứu sử dụng điện cực Ag/AgCl với nguồn năng lượng từ +400 đến 700 mV, cột Supecol Discovery C8, pha động chứa acid acetic 0,5 % - acetonitrile (85:15, v/v), tốc độ dòng 0,4 ml/phút cho cả hai hệ thống sắc ký lỏng với detector điện hóa và khối phổ Như vậy, đây là 2 phương pháp hiệu quả trong nahiên cứu chất chuyển hóa in vivo của resveratrolf4ỏl

Trang 26

Một nghiên cứu gần đây của một nhóm tác giả thuộc trung tâm trồng và chế biến nho trường Đại học Nông nghiệp Trung Quốc tiến hành trên 6 mẫu rượu nho đã phát hiện ra 31 hợp chat phenolic 26 hợp chất trong số đó đã được xác định dựa trên thư viện phổ của ƯV và MS/MS Các hợp chat phenolic trong rượu vang đỏ chủ yếu bao gồm một so acid phenolic đơn giản như acid hydroxybenzoic và hydroxycinnam ic cùna với các polyphenol phức tạp như flavonol, anthocyanin, tanin là những dẫn xuất chính tạo ra từ vỏ và hạt nho trong suốt quá trình chế biến rượu Quá trình chiết xuất các polyphenol trong rượu được tiến hành theo qui trình sau: Thêm một lượng nước đã loại ion (100ml) vào rượu (100ml) Hồn họp này được chiết bàng ethyl acetat (80ml) Pha ester được thu hồi lại và cất quay ở nhiệt độ dưới 30°c, sau đó hòa tan trong 5 ml m ethanol/nước (1:1) sắc ký lỏng pha đảo với detector DAD được ứng dụng rộng rãi trong phân tích các thành phần trong rượu bởi độ nhạy cao và thực hiện dễ dàng Tuy nhiên, phổ ƯV của một số thành phần trên tương tự nhau, dẫn đến việc xác định chúng rất m ơ hồ Phương pháp LC -

MS với nguồn ESI góp phần xác định chính xác cấu trúc các hợp chất này nên được thừa nhận như một kỹ thuật phân tích tốt nhất để nghiên cứu các thành phần trong rượu và trong nho Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều thời gian và chất chuẩn khi phân tích các m ẫu rượu vang ở quy mô công nghiệp Vì thế, mục đích chính của nghiên cứu này là giúp biên soạn lại các dữ liệu về thư viện phổ ƯV và MS/MS của

39 phenolic chuấn và ứng dụng chúng trong nghiên cứu sự có mặt của các phenol trong các mẫu rượu khác nhau Nguồn ESI, chế độ ion âm với nguồn năng lượng MS/MS tối ưu 1,0 V là điều kiện tối ưu đề phân tích các phenolic phân tử lượng thấp Ket quả cho thấy: phổ u v đặc trưng của trans-resveratrol và trans-piceid có cực đại hấp thụ tại 306 nm, trong khi dạng đồng phân cis của chúng là tại 284 nm Resveratrol tạo mảnh con 185 và 156, trong khi dạng glycoside (trans/cis-piceid, m/z 389) của chúng tạo mảnh 227 do mất đi một phân tử glucose1’21,

ở Việt Nam , TS Nguyễn Hải Nam và cộng sự đã tiến hành một số nghiên cứu về resveratrol trên nguyên liệu c ố t khí củ Tác giả đã phân lập được 2 chất resveratrol, emodin và dựa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân khẳng định cấu trúc của 2 thành

Trang 27

phần nói trên Đồng thời, ứng dụng phương pháp LC - MS trong định lượng resveratrol từ nguồn c ố t khí củ trồng ở Việt Nam đạt hàm lượng 0,27% - hơi thấp hơn so với hàm lượng resveratrol trong c ố t khí củ Trung Quốc 0,35% [81‘[9].

1.5.2 PhiTOTig pháp phân tích resveratrol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ (LC - MS).

1.5.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

4- Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp dùng để tách và định lượng các thành phần trong hồn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất mang hoặc được gắn hoá học với chất mang Pha động cùng với mẫu phân tích được bơm qua cột với tốc độ phù hợp tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo cỡ Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Ket quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy

i n m.[2].[3].[4],[7].[ll]

Trang 28

4- Các đại lirọng đặc trưng của quá trình sắc ký

❖ Thời gian lưu

Là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột cho đến khi chất tan ra khỏi cột sắc ký đạtgiá trị nồng độ cực đại, tới detector và cho píc trên sắc ký đồ

ÍR' = ÍR - 10

- tR : Thời gian lưu của m ột chất

- t R- : Thời gian lưu hiệu chỉnh

- t0 : Thời gian lưu của chất không bị lưu giữ

Ý nghĩa: Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu mỗi chất là hằng

định Các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau phụ thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để định tính các chất

Trong phân tích thường chọn cột, pha động và điều kiện phân tích sao cho: 1< k ’<8

Trang 29

Để tách riêng hai chất thường chọn 1,5< a < 2.

Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên cùng m ột điều kiện sắc ký Độ phân giải của 2 píc ở cạnh nhau được tính theo công thức:

Rs = 1,5 : Hai píc tách hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

❖ H ệ số đối xứ n g A s (hệ sổ kẻo đuôi)

Cho biết mức độ cân đối của píc sắc ký, nó được tính theo công thức:

Trong đó:

w 1/20 : là chiều rộng của píc đo ở 1/20 chiều cao của píc

d : là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh píc đến cạnh phíatrước của píc ở 1/20 chiều cao píc A s= 1,0: píc hoàn toàn đổi xứne

❖ H ệ số bất đối xứ n g T (Tailing factor)

Cho biết mức độ không đối xứng của píc trên sắc đồ T là tỷ số độ rộng của 2 nửa píc tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiều cao của píc

Phép định lượng chấp nhận được với T = 0,8 -ỉ- 2,0

T > 2,0: điểm cuối của píc khó xác định, cần thay đổi các điều kiện để píc cân đối

Trang 30

Đại lượng này đặc trưng cho hiệu lực của cột s ố đĩa lý thuyết N được tính theo công thức:

N = 16x hoặc N = 5,54

w

Trong đó: W B: là chiều rộng đo ở đáy píc.

w y : là chiều rộng của píc đo ở nửa chiều cao của píc.

Chiều cao của đĩa lý thuyết H đươc tính bằng công thức: H = —

tố ảnh hưởng đến quá trình tách Pha động thường là dung môi hữu cơ hoặc dung dịch nước Trong phân tích, người ta có thể sử dụng chương trình dung môi, chương trình tốc độ dòng hay chương trình nhiệt độ

Trang 31

♦> B ơm : Trong HPLC, bơm và detector là những bộ phận quan trọng nhất Yêu

cầu của bơm phải đẩy được dung môi rửa giải thành dòng qua cột tách, không có xung ở áp suất cao Dòng khône liên tục sẽ gây nhiễu đường nền

❖ Cột tách: thường sử dụng cột thủy tinh hoặc thép không rỉ để làm cột, trong

chứa các hạt nhồi silica gel, nhôm oxyd, hoặc các hạt pha đảo C2, C8, C 18 với kích thước từ 5-15 |im

❖ D etector: Đây là một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC.

Việc chọn detector đế sử dụng dựa vào đặc tính lý hóa của chất phân tích Hiện nay,các loại detector được sử dụng bao gồm: detector UV-VIS, detector huỳnh quang, detector điện hóa, detector khối phổ, detector tán xạ bay hơi

4- Cách tính kết quả:

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký:

❖ Phương pháp chuẩn ngoại

❖ Phương pháp chuẩn hoá diện tích

1.5.2.2 Sắc ký lỏng k h ố i/?/rổ[l01’[14]'[41]

4- Khái niệm sắc ký lỏng khối phổ:

Phân tích khối phố là phươne pháp nehiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó LC - MS là kỹ thuật kết hợp khả năng tách của sắc

ký iỏng với khả năng phân tích khối lượng của khối phổ Mặc dù cả 2 kỹ thuật (HPLC & LC - M S) đều ra đời từ khá lâu nhưng mãi đến năm 1970 người ta mới nhận ra lợi ích to lớn của việc kết hợp chúng với nhau; trong đó, vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống phân tích khối phố có độ chân không cao (10'2 - 10'5 Pa) là nhân tố chủ yếu của sự chậm trễ này LC - MS là một kỹ thuật mạnh mẽ được sử dụng cho nhiều ứng dụng có độ nhạy rất cao và đặc trưng Giới hạn phát hiện có thể đến 10'14 gam Do vậy, phân tích khối phổ ngày càng được ứng dụng

Trang 32

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học công nghệ Đặc biệt, dùng để phân tích hàm lượng nhỏ trong mẫu có thành phần phức tạpllí),'[l41.

Trong kỳ thuật LC - MS, chất phân tích được chuyển thành trạng thái hơi, rồi thành ion được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của khối phổ kế Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm

Phương pháp khối phổ có thê ứng dụng vào quá trình đồng nhất, vào việc xác định công thức cấu tạo hoặc vào phân tích định lượng các chất

Khối phổ kế thông thường gồm các bộ phận sau: bộ phận ion hóa, bộ phận phân tích khối và bộ phận phát hiện ion[l0]’[14J[41]

❖ Bộ p h ậ n ion hóa (ionizer):

Thường sử dụng kỳ thuật ion hóa ở áp suất thường API (Atmospheric pressure ionization) bao gồm:

+ Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thường APCI (Atmospheric pressure chemical ionization)

Nguyên tắc:

Phân tử hòa tan trong dung môi đi qua một lò sấy, hóa hơi, các phân tử hơi được phun ra nhờ khí N 2 và bị ion hóa trong vùng phóng điện Mỗi phân tử khí có thể tạo

ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học

Cơ chế tạo ion dương:

H ?0 + H 20 '+ —> H }0+ + 'OH (phản ứng ion - phân tử)

M + H 30 + —> MH+ + H20 (phản ứng ion - phân tử)

Cơ chế tạo ion âm:

Với những phân tử có H linh động, trong vùng phóng điện có sự ion hóa của phân

tử bằng cách mất đi m ột H+, phần còn lại là m ột anion:

+ Kỹ thuật phun ion ESI ( Electrospray ionization)

Trang 33

& c OXkt I 'o l

D at a Processing

/ \ Vagnsb: seckr ( g 0 \ (feUintopaqe!

EWt W " CP £ \ \ °06

Bộ phân tích tứ cực đơn và bộ phân tích từ

Hình 1.4: Thiết bị LC-MS và nguyên lý của kỹ thuật phân tích ESI-MS

Các phân tử hóa chất và đung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-5 k v (điện thế dương ở đầu ion kim loại tạo ion

Trang 34

dương, điện thể âm ở đầu kim loại tạo ion âm), sau đó được phun mịn bằng khí nitơ thoát ra xung quanh ống mao quản Trong khí nóng, các phân tử dung môi từ từ bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhó dần và do sự đấy nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ bế dần ra thành những hạt nhỏ m ang điện tích Các ion dương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một cửa rất nhỏ, dung môi và khí nitơ

bị bơm hút ra ngoài

APCI được sử dụng nhiều cho những phân tử phân cực có khối lượng nhỏ hơn

1000 ESI được sử dụng nhiều hơn cho những phân tử phân cực nhiều hơn và có khối lượng phân tử khối lớn (ion đa điện tích với protein) Trong trường hợp cả hai

kỹ thuật đều dùng được trong phân tích một hóa chất xác định, ESI được ưu tiên hơn; tuy nhiên vẫn cần thí nghiệm đề lựa chọn kỹ thuật thích nghi nhất

+ Kỹ thuật ion hóa quang học ở áp suất thường APPI (Atmospheric pressure photo ionization)

+ Kỹ thuật M ALDI (M atrix Assisted Laser Desorption Ionization) - ion hóa theo cơ chế giải hấp sử dụng nguồn laser

❖ Bộ p h ậ n p h â n tích k h ố i (Mass analyzer):

Bao gồm các loại:

+ Bộ phân tích khối với độ phân giải cao

+ Bộ phân tích khối tứ cực (Quadrupole)

+ Bộ phân tích khối bẫy ion QIT (Ọuadrupole Ion Trap)

+ Bộ phân tích khối 3 tứ cực (Tryde quadrupole)

+ Bộ phân tích khối TOF (Time o f flight) (Nếu các phân tử trong mẫu bayhơi thì thường sử dụng kỹ thuật phân tích thời gian bay TOF để tách các ion theo tỷ

số khối lượng và điện tích (m/z) của chúng

❖ Bộ p h ậ n p h á i líiện ion (Ion detection).

Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ: LCQ ADVANTAG E M AX

Thiết bị gồm các bộ phận sau:

+ Bộ tạo ion (Ionizer)

+ Bộ hướng dẫn ion (Ion optics)

Trang 35

+ Bộ phân tích khối (M ass analyzer).

+ Bộ phát hiện ion (Ion detection)

+ Bộ xử lý dữ liệu

4 M ột số kỹ thuật LC-MS

❖ K ỹ thuật p h â n tích M S 1 lần F u ll scan (Scan toàn thang): Với m ột hỗn hợp

nhiều chất được tách ra sau khi qua cột sac ký và đưa vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất Ta có một sắc

đồ toàn ion TIC (Total Ion Chrom atogram) và phổ khối được lấy theo FULL SCAN MS trong khoảng khối lượng ghi hết tất cả các ion sinh ra Phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể rất lớn Ngoài ra, kỹ thuật

MS 1 lần không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh và sự khác nhau giữa các đồng phân

❖ K ỹ thuật p lìâ n tích chọn lọc ion ("SIM- Selected Ion M onitoring): Kỹ thuật này

chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng độ nhạy, tức tăng

tỉ lệ tín hiệu s/nhiễu đường nền N Kỹ thuật này thuận lợi để phân tích dư lượng một chất đã biết trong một nền mẫu phức tạp Kỹ thuật SIM nhạy hơn so với FULL SCAN

❖ Kỹ thuật M S /M S 2 lần: Trong kỹ thật M S/M S (M S2) m ột ion chọn lọc ở chế độ

MS lần 1 được phân tích tiếp bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được

sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể Trong một nền mẫu phức tạp, kỹ thuật M S/M S giúp xác định cấu trúc

và định lượng tốt hơn

❖ Kỹ th u ậ t S R M (Selected Reaction M onitoring): N ếu khi lấy khối phổ 2 lần

MS/MS (M S2) mà khối phổ kế chỉ ghi nhận một mảnh ion con mà thôi thì ta nói

sử dụng kỹ thuật SRM (chọn lọc ion con sau phản ứng) Đây là một kỳ thuật định lượng khá chính xác

Trang 36

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIÉT BỊ NGHIÊN c ử u

❖ H oá chất:

- Chất chuẩn resveratrol đối chiếu hóa học, SKS 11535-200301 (Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và sinh phẩm Trung Quốc, NICPBP cung cấp) Hàm lượng 100% tính theo nguyên trạng.

- Dung môi tinh khiết dùng cho sắc ký: Methanol (Merck), nước, acid trifloroacetic (TFA), aceton.

❖ Thiết bị, dụng cụ:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200, detector PDA.

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max, detector PDA

và MS/MS.

(a) Máy sắc ký siêu hiệu năng Agilent - (b) Máy sắc ký lỏng khối phổ (LC

-Technologies 1200- Detector PDA MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage

MaxHình 2.1: Thiết bị HPLC và LC - MS sử dụng trong nghiên cứu

- Máy lắc siêu âm

- Cân phân tích Mettler AB204 (Thụy Sĩ).

- Bình nón, bình định mức, pipet, cốc có mỏ và các dụng cụ thủy tinh khác.

Trang 37

2.2 ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là resveratrol trong cao khô chiết tò c ố t khí củ; viên Thiên Bảo Vang Không Độ; nguyên liệu chiết xuất vang nho và rượu vang nho Phục vụ cho việc thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng một số chế phẩm sau:

■ 4 mẫu cao khô chiết từ c ố t khí củ (do đề tài C N H D D D T021/10-11, thuộc

chương trình Hóa Dược cung cấp), bao gồm các mẫu CXI, CX2, CX3 và CX4 Các mẫu cao khác nhau về loại dung môi chiết xuất, thời gian và lượng dung môi chiết xuất Qui trình chiết xuất các mẫu được tóm tắt ở phụ lục 2 (hình

PL2.1)

• Rượu vang nho và nguyên liệu chiết xuất vang nho do ORYZA OIL & FATCHEMICAL CO., LTD (Nhật Bản) cung cấp.

1 mẫu dung dịch rượu vang nho để điều chế nguyên liệu chiết xuất vang nho,

có hàm lượng resvertrol > 5 mg/L.

- 2 m ẫu nguyên liệu: Resveratrol-P5 (PS03458) có hàm lượng resveratrol 5 %

và Resveratrol-WSP0,5 (S09219) có hàm lượng resveratrol 0,5 %.

Trang 38

Hình 2.3: Mầu rượu vang nho và mẫu chiết xuất vang nho WSP0,5

• Nang cứng Thiên Bảo Vang Không Độ, nhà sản xuất: K-MAX HEALTH PRODUCTS CORP.ƯSA, số lô: NC 01, ngày sản xuất: 05/09/2009

Công thức:

Trang 39

- Làm sạch và làm giàu mẫu: trona trường hợp nếu lượng hoạt chất resveratrol trong mẫu nhỏ (mẫu cao khô chiết từ c ố t khí củ, mẫu rượu vang nho) có thế làm giàu mẫu bằng cách cô và hòa tan chọn lọc trong các dung môi thích họp.

- Do resveratrol tan tốt trong methanol nên với các mẫu thành phẩm chứa resveratrol khác, ta chọn methanol làm dung môi hòa tan để tạo ra các dune dịch thử có nồng độ thích hợp

- Dung dịch chuân gốc: Resveratrol trong methanol nồng độ 1 mg/ml và 100 Ịig/ml

♦> Chuẩn bị m ẫu chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc resveratrol trong methanol 1 mg/ml và 100 |j,g/ml: M ở lọ chất chuẩn chứa 20 mg resveratrol, chuyển toàn bộ lượng chất vào bình định mức 20 ml, thêm nhiều lần, mỗi lần 1 ml m ethanol vào lọ chuẩn để tráng lọ, chuyển sang bình định mức Thêm khoảng 10 ml methanol vào bình định mức lắc nhẹ cho tan, thêm dung môi vừa đủ, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc resveratrol 1 mg/ml Hút chính xác 5ml, thêm methanol vừa đủ 50 ml, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc 100 ng/ml

- Dãy các dung dịch chuẩn resveratrol (đường chuẩn S1): Hút dung dịch chuẩn

100 |J,g/inl pha trong vừa đủ methanol (theo bảne 2.1) để có dãy chuẩn S I Dãy chuẩn này đế khảo sát độ lặp lại, độ tuyến tính và sử dụng làm đường chuẩn để định lượng

Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch chuẩn

Đường chuẩn SI được sử dụng cho chương trình HPLC - PDA

- Dãy các dung dịch chuẩn resveratrol (đường chuẩn S2): Pha loãng dãy chuẩn trên 10 lần bang methanol Các dung dịch tương ứng được ký hiệu C ’ l - C ’6

Đ ườne chuẩn S2 được sử dụng cho chương trình LC - MS Sử dụng dung dịch C2 để tune hiệu chỉnh tín hiệu của thiết bị LC - MS

Trang 40

- Pha dung dịch chuẩn resveratrol để thử giới hạn phát hiện bằng cách: Hút chính xác lm l dung dịch C1 cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ tới vạch Dung dịch này có nồng độ khoảng 0,6 |ig/ml để thử giới hạn phát hiện của chương trình HPLC - PDA Còn với chương trình LC - MS sử dụng dung dịch chuẩn 0,1 |ig/m l.

♦♦♦ Chuẩn bị m ẫu th ử

- Các mẫu cao khô chiết từ c ố t khí củ: Cân chính xác khoảng 40 mg cao vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml methanol, siêu âm 30 phút, thêm methanol vừa đủ Lọc qua eiấy lọc và lọc qua màng lọc 0,45 |im

- Mầu viên Thiên Bảo Vang Không Độ: Lấy 20 viên nang, cân chính xác và tính khối lượng trung bình thuốc trong nang, trộn đều, nghiền mịn và làm đồng nhất bột thuốc trong nang Cân chính xác một lượng chế phẩm tương đương 1 mg resveratrol vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, siêu âm 30

p h ú t thêm methanol vừa đủ Lọc qua giấy lọc và lọc qua màng lọc 0,45|im; dung dịch thử thu được có nồng độ khoảng 10 fj.g/ml

- Mầu rượu vang nho: Lẩy 150 ml rượu vang nho cất quay dưới áp suất giảm, nhiệt độ không quá 6 0°c đến gần cắn Phân tán cắn vào trong 10 ml nước, khuấy

kỹ, sau đó chuyến toàn bộ sang ống ly tâm duna tích 50 ml, tráng bình cầu 4 lần, mỗi lần 10 ml aceton, chuyển vào ống ly tâm Đem ly tâm ở nhiệt độ không quá 20°c, tốc độ 10.000 vòng/phút Chuyển toàn bộ dịch ly tâm sang cốc, bay hơi dung môi dưới luồng khí nitơ ở nhiệt độ không quá 60°c tới cắn Thêm methanol vào để hòa tan cắn và chuyển vào bình định mức 100 ml, tráng cốc và chuyển vào bình định mức, thêm dung môi vừa đủ Dung dịch thu được đem lọc qua giấy lọc và lọc qua màng lọc 0,45 |im

- M ầu nguyên liệu chiết xuất vang nho:

+ M ầu Resveratrol-P5: Cân chính xác khoảng 50 mg bột mẫu vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml methanol, siêu âm 30 phút, thêm methanol vừa đủ 25 ml Lọc qua giấy lọc và lọc qua màng lọc 0,45 um Hút chính xác

5 ml dịch thu được, thêm methanol vừa đủ 50 ml

Ngày đăng: 21/04/2019, 18:21

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
1. Bộ môn Hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 125- 146, 173-222 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hóa phân tích II
Tác giả: Bộ môn Hóa phân tích
Năm: 2006
2. Bộ môn Hóa phân tích (2007), Kiểm nghiêm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 84-110 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Kiểm nghiêm thuốc
Tác giả: Bộ môn Hóa phân tích
Năm: 2007
4. Nguyễn M inh Đức (2006), sắ c ký lỏng hiệu năng cao và một sổ ứng dụng vào nghiên cứu, kiêm nghiệm dược phâm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuất bản y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 49-126 Sách, tạp chí
Tiêu đề: sắ c ký lỏng hiệu năng cao và một sổ ứng dụng vàonghiên cứu, kiêm nghiệm dược phâm, dược liệu và hợp chất tự nhiên
Tác giả: Nguyễn M inh Đức
Nhà XB: Nhà xuất bản y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh
Năm: 2006
5. Vũ Đình Hoàng (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh trung ương, tìm kiếm các loại thuốc chữa bệnh Alzheim er từ các loài thực vật Việt Nam (2006-2008), Đề tài nghiên cứu cấp bộ (2006-2008) Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ hệthần kinh trung ương, tìm kiếm các loại thuốc chữa bệnh Alzheim er từ các loàithực vật Việt Nam (2006-2008)
Tác giả: Vũ Đình Hoàng
Năm: 2008
6. Vũ Đình Hoàng (2008), Nghiên cứu công nghệ chiết tách resveratrol từ nguồn thực vật Việt N am , Đe tài khoa học công nahệ cấp nhà nước Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu công nghệ chiết tách resveratrol từ nguồn thực vật Việt N am
Tác giả: Vũ Đình Hoàng
Năm: 2008
7. Phạm Luận (1999), Cở sở lý thuyết sắc kỷ lỏng hiệu năng cao , Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Cở sở lý thuyết sắc kỷ lỏng hiệu năng cao
Tác giả: Phạm Luận
Năm: 1999
8. Nguyễn Hải N am (2007), “ứ n g dụng LC-MS định lượng resveratrol trong cốt khí củ”, Tạp ch í D ược học, 379, tr. 13-16 Sách, tạp chí
Tiêu đề: ứ n g dụng LC-MS định lượng resveratrol trong cốtkhí củ”, "Tạp ch í D ược học
Tác giả: Nguyễn Hải N am
Năm: 2007
9. Nguyễn Hải N am (2007), “Phân lập resveratrol và emodin từ cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) trồng ở Việt N am ”, Tạp chí Dược học, 369, tr. 7-10 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phân lập resveratrol và emodin từ cốt khí củ(Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc) trồng ở Việt N am ”, "Tạp chí Dược học
Tác giả: Nguyễn Hải N am
Năm: 2007
10. Chu Phạm N gọc Sơn (2005), H PLC/M S Advantage Max, Trung tâm đào tạo và phát triển sắc ký TPHCM Sách, tạp chí
Tiêu đề: H PLC/M S Advantage Max
Tác giả: Chu Phạm N gọc Sơn
Năm: 2005
11. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trune ương (2005), “Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương ph áp kiếm nghiệm thuốc, tr. 230-250 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, "Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương ph áp kiếm nghiệm thuốc
Tác giả: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trune ương
Năm: 2005
12. A beer H. Harb et al. (2009), “Effects o f trans- Resveratrol, isolated from Smilax Aspera, on sm ooth muscle, blood pressure, and inflam m ation in rats and nociception in m ice”, Jordan jo u rn a l o f Biological Sciences, vol 2(2), pp.69- 76 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Effects o f trans- Resveratrol, isolated from SmilaxAspera, on sm ooth muscle, blood pressure, and inflam m ation in rats and nociception in m ice”, "Jordan jo u rn a l o f Biological Sciences
Tác giả: A beer H. Harb et al
Năm: 2009
13. Ace-asiak c . R. et al. (1995), “The red w ine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis:implications for protection against coronary heart disease” . Clin. China. Acta, 235, pp. 207-19 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The red w ine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: implications for protection against coronary heart disease” . "Clin. China. Acta
Tác giả: Ace-asiak c . R. et al
Năm: 1995
14. Anna Przyborow ska (2002), “Introduction to Liquid Chrom atography/ Mass Spectrom etry/ M ass Spectrometry (LC-M S/M S) ”, School M S Facility H&amp;LS Sách, tạp chí
Tiêu đề: Introduction to Liquid Chrom atography/ MassSpectrom etry/ M ass Spectrometry (LC-M S/M S) ”
Tác giả: Anna Przyborow ska
Năm: 2002
15. Athar M.. Back JH, Tang X(2007), 'Resveratrol: a review o f preclinical studies for human cancer prevent’’, Toxicology and applied Pharmacology, 224(3), pp.274-83 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Toxicology and applied Pharmacology
Tác giả: Athar M.. Back JH, Tang X
Năm: 2007
16. Baur J. A. Sinclair DA (2006), ’T herapeutic potential o f resveratrol: the in vivo evidence’', Nature reviews drug discovery, 5(6), pp. 493-506 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nature reviews drug discovery
Tác giả: Baur J. A. Sinclair DA
Năm: 2006
17. Beatrice K aufm ann and Philippe Christen (2002), “Recent extraction techniques for natural products: M icrow ave-assisted extraction and pressurised solvent extraction”, Phytochem. Anal., 13, pp. 105-113 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Recent extraction techniques for natural products: M icrow ave-assisted extraction and pressurised solvent extraction”, "Phytochem. Anal
Tác giả: Beatrice K aufm ann and Philippe Christen
Năm: 2002
18. Caining et al. (2006), "Analysis o f estrogenic com pounds in p. cuspidatum by HPLC", Journal o f Ethnopharmacology, vol 105(1), pp. 24-27 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Analysis o f estrogenic com pounds in p. cuspidatum byHPLC
Tác giả: Caining et al
Năm: 2006
19. Cal c . et al. (2003), "Resveratrol and cancer: chem oprevention, apoptosis, and chem oim m unosensitizing activities”, Curr. Med. Chem -Anti-Cancer Agents, 3, pp. 77-93 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Resveratrol and cancer: chem oprevention, apoptosis, andchem oim m unosensitizing activities
Tác giả: Cal c . et al
Năm: 2003
20. Chanvitayapongs s. et al. (1997), “Am elioration o f oxidative stress by antioxidants and resveratrol in P C 12cell”, N euroreport, 8(6), pp. 1499-1502 21. Chunzhi Zhang, Dai Li, Hongshan Yu, Bo Zhang and Fengxie Jin (2007),“Biological effects o f resveratrol ”, Life Sci., pp. 83-88 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Am elioration o f oxidative stress by antioxidants and resveratrol in P C 12cell”, "N euroreport", 8(6), pp. 1499-150221. Chunzhi Zhang, Dai Li, Hongshan Yu, Bo Zhang and Fengxie Jin (2007),“Biological effects o f resveratrol ”, "Life Sci
Tác giả: Chanvitayapongs s. et al. (1997), “Am elioration o f oxidative stress by antioxidants and resveratrol in P C 12cell”, N euroreport, 8(6), pp. 1499-1502 21. Chunzhi Zhang, Dai Li, Hongshan Yu, Bo Zhang and Fengxie Jin
Năm: 2007
22. Clement, et al. (1998), “Chem opreventive agent resveratrol, a natural product derived from grapes, triggers CD95 signaling - dependent apoptosis in human tum or cells”, B lood 92, pp. 996-1002 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Chem opreventive agent resveratrol, a natural product derived from grapes, triggers CD95 signaling - dependent apoptosis in human tum or cells”, "B lood 92
Tác giả: Clement, et al
Năm: 1998

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w