Xây dựng phương pháp định lượng neomycin trong một số chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM THANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NEOMYCIN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM THANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NEOMYCIN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM THANH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NEOMYCIN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR HUỲNH QUANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC-ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

TS Phạm Thị Thanh Hà

LỜI CÁM ƠN

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất em xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Phạm Thị Thanh Hà Các cô đã luôn tận tình giúp đỡ, hưỡng dẫn, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài để em có thể hoàn thành được luận văn này

Em xin được chân thành cám ơn các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên Phòng thí nghiệm trung tâm – trường Đại Học Dược Hà Nội đã hỗ trợ em rất nhiều trong suốt quá trình thực nghiệm vừa qua

Xin gửi lời cám ơn Dược Sỹ Nguyễn Thị Thúy khóa 62 trường Đại Học Dược Hà Nội và toàn thể đồng nghiệp luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

và công tác, luôn động viên và chia sẻ những kinh nghiệm quý trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, những người thân yêu đã luôn bên cạnh giúp đỡ động viên và giúp tôi hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, tháng 11/2012 Nguyễn Thị Kim Thanh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 0

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1.TỔNG QUAN VỀ NEOMYCIN 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Cấu trúc hóa học, tính chất của Neomycin sulfat 3

1.1.3 Các nghiên cứu định lượng neomycin 5

1.2.VÀI NÉT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 6

1.2.1 Khái niệm và phân loại 6

1.2.2 Các thông số đặc trưng 7

1.2.3 Các phương pháp định lượng bằng 10

1.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ HUỲNH QUANG 11

1.3.1 Khái niệm hiện tượng phát quang 12

1.3.2 Sự tạo thành quang phổ huỳnh quang 12

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng huỳnh quang 13

1.3.4 Đo cường độ huỳnh quang và phổ huỳnh quang 15

1.3.5 Ứng dụng của phép đo huỳnh quang 16

1.3.6 Phương pháp HPLC với detector huỳnh quang – tạo dẫn xuất trước cột 16

1.3.7 Phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang của Neomycin sulphat 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.2 THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 21

2.2.1 Dung môi, hóa ch ất, chất chuẩn 21

2.2.2 Thi ết bị 21

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 22

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 22

3.2.3 Xử lý số liệu 25

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 26

3.1.1 Kh ảo sát lựa chọn nồng độ dung dịch Neomycin Sulfat 26

3.1.2 Kh ảo sát lựa chọn nồng độ dung dịch thuốc thử FMOC- Cl 27

3.1.3 Kh ảo sát lựa chọn nồng độ dung dịch glycin 27

3.1.4 Kh ảo sát lựa chọn thời gian phản ứng thích hợp 27

3.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 28

3.2.1 C ột sắc ký và pha tĩnh 28

3.2.2 Kh ảo sát chọn pha động 28

3.2.3 Ch ọn cặp bước sóng kích thích và phát xạ 31

3.2.4 Kh ảo sát tốc độ dòng pha động 31

3.3 Từ các kết quả khảo sát thu được ở trên, chúng tôi xác định điều kiện phân tích Neomycin Sulfat như sau 31

3.3.1 Chu ẩn bị các dung dịch 31

3.3.2 X ử lý mẫu 32

3.3.3 Điều kiện sắc ký 33

3.3 4 M ẫu placebo 33

3.4 Thẩm định phương pháp 33

3.4.1 Tính ch ọn lọc 33

3.4.2.Kho ảng nồng độ tuyến tính 35

3.4.3 Độ chính xác 37

3.4.4 Kh ảo sát độ đúng 38

3.4.5 Tính thích h ợp của hệ thống 39

3.5 Nhận xét chung 41

3.6 Ứng dụng 41

3.6.1 Ch ế phẩm dạng dung dịch 42

3.6.2 Ch ế phẩm dạng nén 42

3.7 Bàn luận 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

BDS : Base deactivated silica

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid chromatography MeCN: Acetonitril

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối-Relative standard deviation

TB: Trung bình

UV-VIS : Tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách các chế phẩm nghiên cứu 17

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 32

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ chính xác của Neo - Dexa 34

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống 36

Bảng 3.6 Kết quả định lượng Neomycin sulfat trong các chế phẩm nghiên cứu 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của neomycin 3

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống HPLC 10

Hình 1.3 Sơ đồ biểu diễn sự xuất hiện phát quang 13

Hình 3.1 Sắc ký đồ của Neomycin sulfat với pha động MeCN : H2O…

3(92,5 : 7,5) 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ của Neomycin sulfat với pha động MeCN : H2O ( 90: 10) 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ của Neomycin sulfat với pha động MeCN : H2O (80: 20) 30 Hình 3.5 Quy trình xử lý mẫu 33

Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (thẩm định tính chọn lọc) 34

Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu placebo (thẩm định tính chọn lọc) 34

và nồng độ Neomycin Sulfat 36

Hình 3.9 Sắc ký đồ của các dung dịch khảo sát khoảng tuyến tính 37

Hình 3.10 Sắc ký đồ 6 lần tiêm liên tiếp mẫu chuẩn……… 37

Hình 3.11 Sắc ký đồ định lượng thuốc xịt mũi Alaka……….…42

Hình 3.12 Sắc ký đồ định lượng viên nén Neo – Gynoternan………….… 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay trong lĩnh vực dược phẩm, việc ứng dụng các phương pháp phân tích hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc ngày càng trở lên phổ biến Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực phân tích, đặc biệt là kiểm nghiệm thuốc Sắc ký lỏng hiệu năng cao với nhiều loại detector khác nhau cho phép phân tích nhiều loại chất có cấu trúc và tính chất đa dạng Mặt khác, phương pháp này cho phép vừa tách, vừa định tính, vừa định lượng đồng thời chất phân tích trong cùng một phép thử với độ chọn lọc và chính xác

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang là phương pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao Trong kiểm nghiệm thuốc, phương pháp huỳnh quang đã được đưa vào nhiều dược điển: Mỹ, Anh, Châu Âu, Nhật Bản,…Trong công thức neomycin có nhóm amin bậc 1 nên dễ tạo dẫn xuất tạo thành sản phẩm có khả năng hấp thụ quang và phát ra huỳnh quang ở bước sóng dài hơn

Neomycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminosid, có phổ rộng trên cả

vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Cũng như các kháng sinh khác trong nhóm, neomycin không hấp thụ quang ở vùng tử ngoại – khả kiến Vì vậy, phương pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật Phương pháp này mất rất nhiều thời gian và có thể làm chậm quá trình sản xuất (theo GMP phải kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất)

Chính vì vậy, xuất phát từ yêu cầu thực tế cần xây dựng một phương pháp định lượng neomycin nhanh, có độ chính xác cao đáp ứng kịp thời nhu cầu đánh giá chất lượng thuốc phục vụ sản xuất, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài:“Xây dựng phương pháp định lượng Neomycin sulfat bằng sắc ký

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Neomycin sulfat bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang

- Ứng dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để định lượng Neomycin sulfat trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Chương 1

TỔNG QUAN 1.1.TỔNG QUAN VỀ NEOMYCIN

1.1.1 Nguồn gốc

Neomycin được Waskman và Lechevalier phát hiện năm 1949 từ môi

trường nuôi cấy của chủng Stretomyces fradiae Hiện nay, Neomycin vẫn

được sản xuất bằng cách lên men chủng vi sinh này [1], [4], [20]

1.1.2 Cấu trúc hóa học, tính chất :

1.1.2.1 Cấu trúc hoá học [4]:

Hình 1.1 Cấu trúc của neomycin

Tên khoa học: 5-O-[3-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-β-L-idopyranosyl)-β-D-ribofuranosyl]-D-streptamin

2-deoxy-4-O-(2,6-diamino-2,6-dideoxy-α-D-glucopyranosyl)-Lấy đại diện là neomycin B: C23H46N6O3.xH2SO4

1.1.2.2 Tính chất vật lý:

trong ethanol, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ [1] ,[4]

1.1.2.3 Tính chất dược lý:

a Ph ổ tác dụng:

Neomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid Khi phối hợp với Bacitracin, thuốc có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) gây nên các nhiễm khuẩn ngoài da

Những vi khuẩn nhạy cảm với neomycin như: Staphylococcus

các loại, và Neisseria các loại

Neomycin không có tác dụng với Pseudomonas aeruginosa, Serratia

Neomycin không được dùng đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của thuốc [2], [3], [4], [20]

- Dùng tại chỗ: Phản ứng mẫn cảm như viêm da, ngứa, sốt do thuốc

và phản vệ

Tắc ruột, mẫn cảm với aminoglycosid, trẻ em dưới 1 tuổi

e, Dạng thuốc và hàm lượng:

- Viên nén 500 mg Neomycin sulfat: 350.000 đơn vị

- Neomycin thường phối hợp với một số kháng sinh khác như polymixin B, bacitracin, colistin, gramicidin, hoặc các corticoid như dexamethason trong các thuốc dùng ngoài

- Dung dịch hoặc hỗn dịch để tra mắt: lọ 5 ml chứa 5 mg neomycin/ml

- Mỡ tra mắt: Tuýp 3,5 gam, mỗi gam chứa 3,5 mg Neomycin sulfat

- Kem dùng ngoài: Ống 1ml hoặc lọ đa liều 20ml, mỗi ml chứa 5 mg neomycin

1.1.3 Các nghiên cứu định lượng neomycin:

- Thời gian ủ: 7 ngày (37oC- 39oC)

* I.Clarot, và cộng sự Phân tích Neomycin sulfat và Framycetin sulphat bằng

- Sắc ký pha đảo

- Cột: Polaris C18 150 mm × 4.6 mm i.d., 3 µm

- Pha động: acid trifluoroacetic 170 mM

- Tốc độ dòng: 2ml/phút

- Detector tán xạ bay hơi

* Maria Ofitserova, Sareeta Nerkar [21]: Phát hiện kháng sinh aminoglycosid (Apramycin, Gentamicin và Neomycin) trong thức ăn dùng sắc ký lỏng hiệu năng cao co bộ dẫn chất hóa sau cột với thuốc thử o-phthaladehyd/Thiofluor, phát hiện bằng detector huỳnh quang :

1.2.1 Khái niệm và phân loại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao

Pha tĩnh có thể là chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân, chất lỏng được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ

Tùy thuộc vào bản chất các pha, kỹ thuật và phương tiện sắc ký mà người ta phân làm nhiều loại sắc ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó, sắc ký lỏng phân bố được sử dụng phổ biến nhất hiện nay [5], [6]

1.2.2 Các thông số đặc trưng [5], [6], [9],[11],[19]:

* Thời gian lưu t R (phút) (Retention time)

- Thời gian lưu (tR) là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh

+ Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động

- Thời gian chết (tM) là thời gian lưu của chất không bị lưu giữ

- Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R :

t’R = tR - tM

* Di ện tích Pic: Thể hiện lượng chất tan được tiêm vào cột (dùng để xác định

hàm lượng) Khi so sánh diện tích Pic của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ xác định được hàm lượng hoạt chất mẫu thử

* H ệ số dung lượng K’ (Capacity factor)

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó

trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong

pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

1 '

0 0

0 = −

= −

t

t t

t t

K R R Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém, K’ lớn thì pic bị doãng, độ

nhạy kém Trong thực tế K’ từ 1 đến 5 là thích hợp

* Độ chọn lọc α (Selectivity)

Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất

A, B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị

ở độ chọn lọc α:

0

0 '

'

t t

t t K

K

RA RB B A

Quá trình tách sắc ký của các chất là dựa trên cơ sở sự phân bố của

chất tan giữa pha động và pha tĩnh Sự phân bố này được đặc trưng bởi hệ số

phân bố, nó được tính theo công thức:

RA RB A

B

RA RB

W W

t t W

W

t t

2 / 1 2 / 1

) (

18 , 1 ) (

2

+

−

= +

−

Yêu cầu RS>1, giá trị tối ưu RS = 1,5

* S ố đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa( H):

Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H Ta có thể tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:

2

2

2

54 , 5 16

t

Trong đó : +Wlà chiều rộng píc ở đáy píc

+W1/2 là chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của píc

Nếu gọi L là chiều dài của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết được tính bằng công thức:

N L

H =

• Phương pháp chuẩn ngoại

• Phương pháp chuẩn nội

• Phương pháp thêm chuẩn

• Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khuôn khổ của luận văn này, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại – chuẩn hóa nhiều điểm và một điểm:

- Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất phân tích tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi nồng độ chuẩn Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng

độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định

Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử phải nằm trong

đoạn tuyến tính của đường chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ chất phân tích của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của chất phân tích của mẫu thử rồi tiến hành sắc ký

Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

S

X S X

S

S C

C =

Trong đó: CX: Nồng độ chất phân tích mẫu thử

CS: Nồng độ chất phân tích mẫu chuẩn

SX (HX): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu thử

SS (HS): Diện tích (chiều cao) của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn

0 1 2 3 4

E

E *

1.3.1 Khái niệm hiện tượng phát quang [5], [6]:

Hiện tượng phát quang nói chung là tính chất của các chất có khả năng phát quang dưới các tác nhân kích thích khác nhau Các tác nhân đó có thể do

ma sát, do nhiệt, do hiệu ứng các phản ứng hóa học, do tác nhân chiếu xạ của các bức xạ điện từ…(được gọi là: nhiệt phát quang, điện phát quang, hóa phát quang, sinh phát quang,…) Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại hoặc phần có bước sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tượng phát quang học hay còn

gọi là huỳnh quang

1.3.2 Sự tạo thành quang phổ huỳnh quang [5], [6], [10]:

Người ta cho rằng, khi phân tử hấp thụ các bức xạ kích thích và chuyển

từ trạng thái năng lượng cơ bản đơn bội S lên trạng thái kích thích đơn bội S*

thì chúng có thể phục hồi không bức xạ Các phân tử có thể mất đi một số năng lượng do va chạm trước khi trở về trạng thái cơ bản và phát ra bức xạ,

đó là bức xạ huỳnh quang Năng lượng của bức xạ huỳnh quang bé hơn năng lượng của bức xạ kích thích do đó bước sóng của ánh sáng bức xạ lớn hơn bước sóng của ánh sáng kích thích Một số phân tử khác chuyển sang trạng thái tam bội T trước khi trở về trạng thái năng lượng cơ bản và phát ra bức xạ

đó là lân quang hay huỳnh quang chậm

T

+ hγ – hγ

(hấp thụ) (phát quang)

Hình 1.3 Sơ đồ biểu diễn sự xuất hiện phát quang

Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia

tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chúng

Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc có chứa photon có năng lượng ứng với hiệu năng lượng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một

phần của cường độ bức xạ tới I o sẽ bị hấp thụ và cường độ bức xạ truyền qua I

sẽ nhỏ hơn cường độ bức xạ tới I 0

Trong những điều kiện nhất định, cường độ bức xạ huỳnh quang Ih sẽ tỉ

lệ thuận với cường độ hấp thụ (I o – I) theo :

Hằng số k phụ thuộc vào chất phân tích, môi trường và có quan hệ với hiệu suất phát ra photon của nguyên tử hoặc phân tử khi từ trạng thái kích thích trở về trạng thái cơ bản Cường độ bức xạ truyền qua có quan hệ với nồng độ chất phân tích theo định luật Beer như sau:

! 3

) 303 , 2 (

! 2

) 303 , 2 ( 303 , 2

3 2

0

C l C

l C

l

ε

1% so với Ih nên có thể bỏ qua và như vậy thì:

Trong đó:

Io: Cường độ bức xạ tới

I: Cường độ bức xạ truyền qua

Ih: Cường độ bức xạ huỳnh quang

ε: Hệ số hấp thụ mol của chất phân tích

l: Chiều dày của lớp dung dịch

C: Nồng độ chất phát quang trong dung dịch (mol/L)

Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là có nồng độ hấp thụ nhỏ, εlC < 0,01) thì cường độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích và với cường độ bức xạ tới Io Đây là cơ sở của phương pháp huỳnh quang phân tử dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cường độ huỳnh quang Ih Nếu dung dịch có nồng độ lớn hơn (εlC > 0,01 ) thì sẽ sảy ra

sự tắt huỳnh quang, không còn sự tuyến tính giữa cường độ huỳnh quang và nồng độ nữa

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng huỳnh quang [10], [12]:

a Các yếu tố thuộc về cấu trúc phân tử:

- Các hợp chất có chứa vòng thơm đều thuận lợi nhất cho phát huỳnh quang và cho cường độ lớn nhất Các hợp chất carbonyl mạch thẳng hay vòng

no cũng như các cấu trúc có các nối đôi liên hợp cũng có huỳnh quang nhưng

số lượng không đáng kể so với các hợp chất thơm Hầu hết các hydrocarbon thơm đều phát huỳnh quang trong dung dịch, hiệu quả huỳnh quang tăng lên với số lượng vòng thơm và độ tập trung của chúng trong cấu trúc

Những dị vòng đơn giản nhất như: Pyridin, furan, thiophen, pyrrol … không có huỳnh quang phân tử nhưng các cấu trúc ngưng tụ nhiều vòng như: Quinolin, isoquinolin, indol… lại thường có huỳnh quang

- Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: –OH, –NH2, –OCH3

- Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: –NO2, –COOH, –CHO, Br–, I–…

- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc giảm hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trong nhân thơm làm tăng hiệu suất huỳnh quang, ngược lại vị trí meta thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang

- Đồng phân cis làm tăng phát quang và trans làm giảm phát quang của một hợp chất

- Các chất có cấu tạo phân tử rắn chắc thì khả năng phát quang cao và ngược lại

VD: Fluorene, Rosamine, Fluorescein: Phát quang mạnh

Biphenyl, Malachite, Phenolphtalein: Không phát quang

b Các yếu tố môi trường:

Nhiệt độ và dung môi là hai yếu tố ảnh hưởng đến huỳnh quang Hầu hết đối với các phân tử, hiệu suất huỳnh quang giảm khi nhiệt độ tăng, bởi vì khi đó tần suất va chạm tăng lên và sự hồi phục do va chạm dễ dàng xảy ra Việc giảm độ nhớt của dung môi cũng cho kết quả tương tự

1.3.4 Đo cường độ huỳnh quang và phổ huỳnh quang

* Đo cường độ huỳnh quang:

Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc: Khi chiếu một chùm tia

tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn

- Phổ phát xạ (Emission spectrum - Em)

Là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối (cường độ huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa) theo bước sóng của ánh

Dựa vào sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ huỳnh quang với nồng

độ chất phát quang mà phương pháp này được ứng dụng để định lượng

Phép đo huỳnh quang được áp dụng để định lượng các chất có khả năng phát huỳnh quang tự nhiên hoặc các chất có thể tạo ra dẫn chất thích hợp có khả năng phát huỳnh quang [5],[10],[12]

1.3.6 Phương pháp HPLC với detector huỳnh quang – tạo dẫn xuất trước cột

a Detector huỳnh quang

Loại detector này chọn lọc hơn và nhạy hơn (có thể đến 1000 lần) detector hấp thụ UV Nó đáp ứng với các chất phát huỳnh quang như: Hợp

chất thơm đa vòng, dẫn chất quinolin, steroid và alcaloid Có thể dùng thuốc thử tạo huỳnh quang để làm dẫn chất hóa (trước cột hoặc sau cột) của chất phân tích [10]

b Tạo dẫn xuất trước cột:

Có những hợp chất bình thường thì không phát quang hoặc phát quang yếu, nhưng khi chuyển sang các dẫn chất khác thì phát quang rất mạnh (VD : một số amino acid, đường, ion vô cơ…) Người ta có thể cho chất cần phân tích phản ứng với các thuốc thử để tạo dẫn xuất phát huỳnh quang mạnh trước khi đến detector huỳnh quang Việc tạo dẫn xuất này có thể tiến hành trước hoặc sau khi chất cần phân tích đi qua cột phân tích Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử trước khi qua cột thì kỹ thuật này gọi là tạo dẫn xuất trước cột (pre – column derivatization ) Nếu chất cần phân tích được phản ứng với thuốc thử sau khi đã được tách ra khỏi cột và trước khi đến detector, thì gọi là tạo dẫn xuất sau cột (post – column derivatization) [12], [23]

* K ỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột:

- Phản ứng trước cột : phản ứng thường được thực hiện bằng tay trong các

lọ nhỏ trước khi đưa mẫu vào hệ thống sắc ký

Phản ứng dẫn xuất hóa thường được thực hiện vì nó làm tăng độ nhạy và tính chọn lọc của phương pháp sắc ký

Kỹ thuật này cho phép linh hoạt hơn về điều kiện làm việc (thời gian phản ứng, dung môi phản ứng, loại bỏ các chất không cần thiết trong phản ứng,…) [10],[12],[23]

* Ưu điểm của phương pháp tạo dẫn xuất trước cột:

- Tăng độ nhạy phân tích của các chất phát quang kém, hay kém bền với nhiệt,…

- Sử dụng dung môi ít, thời gian thực hiện nhanh

* Điều kiện của mẫu đã được dẫn xuất:

- Mẫu được tạo dẫn xuất có độ phát quang cao

- Bền với nhiệt

- Nhạy với các đầu dò của HPLC

- Mẫu tạo dẫn xuất phải tinh khiết

* M ột số phản ứng dẫn xuất hóa:

Phản ứng dẫn xuất được thực hiện là các phản ứng hữu cơ, điện hóa:

- Phản ứng acyl hóa: là phản ứng thay thế một nguyên tử hydro linh động trong R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH2bằng nhóm alkyl

- Phản ứng este hóa: Phản ứng ester hóa dùng để dẫn xuất các acid carboxylic và các chất có chứa nhóm acid khác Phản ứng dùng các chất xúc tác: HCl, H2SO4, BF3, Thionylclorid, borotriclorid hoặc nhựa trao đổi ion Phản ứng ester hóa là phản ứng cân bằng, để định lượng dẫn xuất cần loại bỏ H2O tạo thành

- Thuốc thử không huỳnh quang: Là thuốc thử không phát quang hấp thụ năng lượng Thường dùng trong UV – VIS

VD: Thuốc thử Ninhydrin; 1-(1-Naphthyl) ethylisocyanat, Benzoyl clorid, phenylisothiocyanat (PITC)…

- Thuốc thử huỳnh quang: Ngược lại với thuốc thử không huỳnh quang là chất hấp thụ năng lượng phát quang

VD: 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzen, o-phtaldehyd, 6 aminoquinolyl- N- hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC), 9—fluorenylmethyl cloroformat (FMOC- Cl)…

- Thuốc thử oxy hóa khử: là chất có tính oxy hóa hay khử phản ứng với chất cần phân tích để tăng độ nhạy

VD: Thuốc thử dimethylamino-azobenzensulfonyl clorid (DABS Cl), Chất oxy

hóa khử iod, brom tạo dẫn xuất với aflatoxin để tăng độ nhạy trong xác định aflatoxin

1.3.7 Phản ứng tạo dẫn xuất huỳnh quang của Neomycin sulfat [23]:

Phương trình phản ứng tạo dẫn xuất phát huỳnh quang của hợp chất chứa nhóm amin với thuốc thử FMOC – Cl:

Phản ứng này xảy ra trong môi trường kiềm, pH= 7,5 – 9, và nhiệt độ khoảng 250C

Sản phẩm phản ứng có khả năng phân tích bằng HPLC với Detector huỳnh quang với bước sóng kích thích và bức xạ lần lượt khoảng :

λEx : 260nm

λEm : 315nm

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Danh sách các chế phẩm có chứa Neomycin sulfat nghiên cứu::

Bảng 2.1 Danh sách các chế phẩm nghiên cứu

Neomycin sulfat: 17.000.IU/5ml Dexamethasol Natri Phosphat: 5,5mg

Natri clorid : 20mg Natri metabisulfit : 5mg Thiomesal :6,25mg Povidon k30 : 10mg Natri citrate :32,5mg Dinatri edetat : 0,4mg

Neomycin sulfat: 27.200IU/8ml Dexamethasol natri phosphate: 8mg

Neomycin sulfat: 52.500IU/15ml Dexamethason natri phosphat: 15mg

01/09/14

Neomycin sulfat: 65.000IU Metronidazol : 500mg Nystatin : 100.000IU

Neomycin sulfat: 65.000IU Metronidazol : 500mg Nystatin : 100.000IU

Neomycin sulfat: 65.000IU Metronidazol : 500mg Nystatin : 100.000IU

+ Acetonitril tinh khiết HPLC (Merck – Đức)

+ Natri tetra borat tinh khiết phân tích (Merck – Đức)

+ Glycin tinh khiết phân tích (Merck – Đức)

+ 9 – fluorenylmethyl cloroformat (FMOC – Cl) tinh khiết phân tích (Merck – Đức)

2.2.2 Thiết bị