Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời amlodipin besylat, hydroclorothiazid và valsartan trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ẦN H Ư N G NGUYỄN HỮU THẢO Đ ẠO TP Q U Y N H Ơ N TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI Ó A 10 00 B TR XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HÀ NỘI 2016 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ U Y N H Ơ N TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ẠO TP Q NGUYỄN HỮU THẢO ẦN H Ư N G Đ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG 10 00 B TR SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO H Ó A LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC MÃ SỐ: 60720410 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT HÀ NỘI 2016 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Trong trình thực đề tài này, nhận đƣợc hƣớng dẫn N H Ơ giúp đỡ tận tình mặt từ thầy cô, bạn bè đồng nghiêp N LỜI CẢM ƠN U Y Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đoàn TP Q Cao Sơn – Viện trƣởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp tơi hồn thành ẠO luận văn Đ Tôi xin chân thành cảm ơn tới anh chị em, bạn bè đồng nghiệp N G Khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ư ƣơng giúp đỡ tạo điều kiện mặt cho tơi suốt q ẦN H trình thực luận văn TR Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học dƣợc B Hà Nội, thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình 00 học tập trƣờng 10 Cuối cùng, xin bày tỏ long biết ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời H Í- nghiệp Ĩ A ln sát cánh động viên, ủng hộ giúp tơi hồn thành khóa học luận văn tốt Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Hữu Thảo D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Xin chân thành cảm ơn! Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON MỤC LỤC Trang N H Ơ N Lời cảm ơn Mục lục U Y Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt TP Q Danh mục bảng, biểu ẠO Danh mục hình vẽ, đồ thị Đ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… Ư 1.1.1 Tổng quan Amlodipin besylat……………………………… 1.1.2 Tổng quan Hydroclorothiazid………………………………… 00 B TR ẦN HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN………………… 10 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO………… 13 H Ó A 10 1.1.3 Tổng quan Valsartan…………………………………………… 1.2 -L Í- 1.2.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng………………………………… 17 19 ÀN Đ N 16 1.2.3 Ứng dụng………………………………………………………… Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… IỄ 13 TO ÁN 1.2.2 Một số thông số đặc trƣng………………………………………… D TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN BESYLAT, H 1.1 N G Chƣơng TỔNG QUAN……………………………………………… 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………… 19 2.1.1 Chất đối chiếu……………………………………………………… 19 2.1.2 Chế phẩm thử……………………………………………………… 19 2.1.3 Dung mơi, hóa chất………………………………………………… 20 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 21 2.2.1 Xây dựng phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………… 21 2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký………………………………………… 21 21 U Y 2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp…………………………………………… N H Ơ 2.1.4 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu……………………………………… N WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 21 2.3 22 TP Q 2.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích số chế phẩm thị trƣờng ẠO PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………… Đ 2.3.1 Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng 22 2.3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp…………………………… 22 H Ư N G thời Amlodipin besylat, Hydrochlorothiazid Valsartan……………… 23 2.3.2 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích số chế phẩm thị trƣờng 26 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………… 26 00 B TR ẦN 2.3.1.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………… 27 3.1 27 10 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………… H Ó A CHUẨN BỊ MẪU………………………………………………… 27 3.1.1.2 Pha dung dịch chuẩn gốc HCT………………………………… 27 3.1.1.3 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc……………………………… 27 3.1.2 Mẫu thử…………………………………………………………… 27 3.1.3 Mẫu placebo tự tạo………………………………………………… 28 LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28 3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu……………………………………… 28 3.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký………………………………………… 28 ÁN -L 3.1.1.1 Pha dung dịch chuẩn gốc AML………………………………… ÀN Đ N IỄ D 27 TO Í- 3.1.1 Mẫu chuẩn………………………………………………………… 3.2 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 28 3.2.2.2 Pha động ………………………………………………………… 29 3.2.2.3 Cột sắc ký ……………………………………………………… 31 3.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP………………………………… 34 34 U Y 3.3.1 Định tính…………………………………………………………… N H Ơ 3.2.2.1 Bƣớc sóng phát hiện……………………………………………… N WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 38 3.3.2.1 Tính chọn lọc ………………………………………………… 38 ẠO TP Q 3.3.2 Định lƣợng………………………………………………………… Đ 3.3.2.2 Tính thích hợp hệ thống………………………………………… N G 3.3.2.3 Độ tuyến tính…………………………………………………… 3.3.2.5 Độ xác…………………………………………………… 44 ẦN H Ư 41 TR ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẾ PHẨM… B 3.4 10 00 3.4.1 Định lƣợng viên nén Exforge……………………………………… A 3.4.2 Định lƣợng viên nén Co-Diovan…………………………………… H Ó 3.4.3 Định lƣợng viên nén Normodipine………………………………… -L Í- Chƣơng BÀN LUẬN………………………………………………… 50 51 52 55 55 56 58 ÀN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………… Đ 50 4.2 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………… 4.3 Về ứng dụng phƣơng pháp…………………………………… N 46 TO ÁN 4.1 Về phƣơng pháp HPLC…………………………………………… IỄ 39 3.3.2.4 Độ đúng………………………………………………………… 3.3.2.6 Độ thô…………………………………………………………… D 38 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Acid acetic băng ACN Acetonitril AML Amlodipin BP Dƣợc điển Anh CH3COONH4 Amoni acetat DĐVN Dƣợc điển Việt Nam H3PO4 Acid phosphoric HCl Acid hydrocloric HCT Hydroclorothiazid HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao JP Dƣợc điển Nhật KH2PO4 Kali dihydrophosphat KP Dƣợc điển Hàn Quốc LC-MS Sắc ký lỏng – khối phổ MeOH Methanol Đ ÀN RSD N N H Ơ U Y TP Q ẠO Đ N G Ư H TO RP-HPLC IỄ ẦN TR B 00 10 A H Ĩ ÁN NP-HPLC Natri dihydrophosphat Í- -L NaH2PO4 D N AAB Sắc ký lỏng pha thuận Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn tƣơng đối TEA Triethylamin THF Tetrahydrofuran USP Dƣợc điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến VAL Valsartan Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng AML HPLC 1.2 Một số nghiên cứu định lƣợng HCT HPLC 1.3 Một số nghiên cứu định lƣợng VAL HPLC 2.4 Các hóa chất dung mơi sử dụng q trình thí nghiệm 20 3.5 Khảo sát tỷ lệ pha động 30 3.6 Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống 3.7 Kết thẩm định độ tuyến tính 3.8 Kết thẩm định độ AML 3.9 Kết thẩm định độ HCT 43 3.10 Kết thẩm định độ VAL 43 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại phƣơng pháp 44 3.12 Kết thẩm định độ tái lặp phƣơng pháp 45 3.13 Kết đánh giá độ thô thay đổi chiều dài cột 3.14 Kết đánh giá độ thô thay đổi pH dung dịch đệm N H Ơ N Nội dung B Bảng U Y 38 39 42 47 ÁN -L Í- H Ó A 10 00 TR ẦN H Ư N G Đ ẠO TP Q 12 Kết đánh giá độ thô thay đổi tỷ lệ % ACN 48 3.16 Kết đánh giá độ thô thay đổi tốc độ dòng 49 3.17 Kết định lƣợng viên nén Exforge 51 3.18 Kết định lƣợng viên nén Co-Diovan 52 3.19 Kết định lƣợng viên nén Normodipine 53 IỄ N Đ ÀN TO 3.15 D 48 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Cơng thức cấu tạo Amlodipin besylat 1.2 Công thức cấu tạo Hydroclorothiazid 1.3 Công thức cấu tạo Valsartan 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 3.5 Phổ hấp thụ UV chất 3.6 Sắc ký đồ khảo sát cỡ hạt sắc ký 3.7 Khảo sát cột hãng khác 33 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp, mẫu 36 N H Ơ 1.1 N Nội dung H Hình U Y 15 29 32 ẦN Ư N G Đ ẠO TP Q 10 TR placebo mẫu thử Chồng phổ UV-VIS chất 3.10 Phổ tinh khiết píc HCT, AML VAL 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích 37 38 40 Ĩ A 10 00 B 3.9 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H píc nồng độ HCT, AML, VAL Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ĐẶT VẤN ĐỀ N H Ơ giới chiếm tỷ lệ cao, ngƣời đứng tuổi N Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong tàn phế lớn ngƣời già Bệnh tim mạch thể dƣới thể khác nhƣ suy tim, tăng U Y huyết áp, rối loạn nhịp, đau thắt ngực, rối loạn tuần hoàn não, tăng lipid – TP Q huyết …Trong đó, bệnh tăng huyết áp (THA) yếu tố nguy tim mạch quan trọng nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tỷ lệ tử vong tỷ lệ ẠO mắc bệnh toàn cầu cao nguyên nhân khác nhƣ sử dụng thuốc hay Đ tăng đƣờng huyết Tại Việt Nam, tần suất bệnh THA ngƣời lớn ngày N G gia tăng Trong năm 1960, tỷ lệ THA khoảng 1%; năm 1992 Ư 11,2%; năm 2001 16,3% năm 2005 18,3% Theo điều tra gần ẦN H (2008) Viện Tim mạch Việt Nam tiến hành ngƣời lớn (≥ 25 tuổi) TR tỉnh thành phố nƣớc ta thấy tỷ lệ THA tăng lên đến 25,1% [8] B Theo “Hƣớng dẫn chẩn đoán điều trị tăng huyết áp” Bộ Y Tế 10 00 (2010) (phụ lục 6) [5] có quy định số loại thuốc điều trị tăng huyết áp nhƣ sau: A Nhóm thuốc dùng đƣờng uống (lợi tiểu, chẹn kênh calci, tác động lên Ó Í- H hệ renin angiotensin, chẹn beta giao cảm, chẹn alpha giao cảm, tác động lên Nhóm thuốc dùng qua đƣờng tĩnh mạch (Nitroglycerin, Nicardipine, ÁN -L hệ giao cảm trung ƣơng, giãn mạch trực tiếp) Ngày nay, với phát triển ngày cao công nghệ nghiên cứu ÀN TO Natri nitroprusside, Esmolol, Labetalol, Hydralazine, Enalaprilat) D IỄ N Đ bào chế dƣợc phẩm, thuốc đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng dƣợc lý dƣợc chất đƣợc sản xuất, lƣu hành sử dụng phổ biến giới nƣớc Một số phối hợp thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valsartan) với thuốc lợi tiểu (Hydroclorothiazid), thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valsartan) với thuốc chẹn kênh calci (Amlodipin) Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ml, pha lỗng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc qua màng lọc N H Ơ Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với N 0,45 µm phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp TP Q Bảng 3.17: Kết định lƣợng viên nén Exforge Số liệu phƣơng pháp NSX % VAL % AML % VAL Thử 95,79 97,69 96,03 Đ 97,06 Thử 96,05 98,10 96,21 98,15 Thử 95,92 98,39 96,42 98,31 Trung bình 95,9 98,1 96,2 97,8 RSD (%) 0,1 0,4 0,2 0,7 00 B ẦN H Ư N G % AML TR ẠO Phƣơng pháp xây dựng Tên mẫu U Y nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.17 10 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, chúng Ĩ A tơi sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel H 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) -L Í- hai hoạt chất cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng ÁN pháp khơng có ý nghĩa thống kê Cân xác 10 viên nén bao phim Co-Diovan, tính khối lƣợng trung ÀN TO 3.4.2 Định lƣợng viên nén Co-Diovan D IỄ N Đ bình viên Nghiền mịn Cân xác lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 100 mg VAL cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm 15 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc Ly tâm 4000 vịng/phút phút Hút xác ml dịch cho vào bình định mức 25 51 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ml, pha loãng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc qua màng lọc N H Ơ Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với N 0,45 µm phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp TP Q Bảng 3.18: Kết định lƣợng viên nén Co-Diovan Số liệu phƣơng pháp NSX % VAL % HCT % VAL Thử 97,68 95,93 98,02 Đ 96,14 Thử 97,89 95,13 98,30 95,85 Thử 98,48 94,59 98,76 95,34 Trung bình 98,0 95,2 98,4 95,8 RSD (%) 0,4 0,7 0,4 0,4 00 B ẦN H Ư N G % HCT TR ẠO Phƣơng pháp xây dựng Tên mẫu U Y nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.18 10 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, chúng Ĩ A tơi sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel H 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) -L Í- hai hoạt chất cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng ÁN pháp ý nghĩa thống kê Cân xác 10 viên nén bao phim Normodipine, tính khối lƣợng ÀN TO 3.4.3 Định lƣợng viên nén Normodipine D IỄ N Đ trung bình viên Nghiền mịn Cân xác lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 6,25 mg AML cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm 15 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc Ly tâm 4000 vịng/phút phút Hút xác ml dịch cho vào bình 52 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON định mức 25 ml, pha loãng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc N H Ơ Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với N qua màng lọc 0,45 µm phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp Tên mẫu TP Q Bảng 3.19: Kết định lƣợng viên nén Normodipine % AML Trung bình 95,4 RSD (%) 0,2 Đ 95,64 N G Thử Ư 95,29 H Thử ẦN 95,36 TR Thử Số liệu phƣơng pháp NSX ẠO Phƣơng pháp xây dựng U Y nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.19 94,97 95,35 95,28 95,2 00 B 0,2 10 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, chúng Ĩ A tơi sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel H 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) cho thấy khác TO ÁN kê -L Í- biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp khơng có ý nghĩa thống Sau ứng dụng phƣơng pháp xây dựng để kiểm nghiệm số ÀN chế phẩm thị trƣờng so sánh với số liệu đƣa nhà sản xuất D IỄ N Đ nhận thấy phƣơng pháp xây dựng có tính thiết thực thích hợp với số sản phẩm nhà sản xuất khác Nhận xét chung: Phƣơng pháp xây dựng đƣợc thẩm định phù hợp với hệ thống phân tích, có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng (0,0025 mg/ml – 0,025 53 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON mg/ml với AML; 0,003125 mg/ml – 0,03125 mg/ml với HCT 0,04 mg/ml với yêu cầu Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng để phân tích định tính D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ĩ A 10 00 B TR ẦN H Ư N G Đ ẠO TP Q U Y N H Ơ định lƣợng chế phẩm chứa thành phần AML, HCT VAL N – 0,4 mg/ml với VAL), có độ tốt độ xác cao, độ thơ phù hợp 54 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Chƣơng BÀN LUẬN N H Ơ Để định lƣợng ba hoạt chất AML, HCT VAL viên thành N 4.1 Về phƣơng pháp HLPC phần có nhiều phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu: quang phổ hấp thụ UV- U Y VIS [12], [33]; quang phổ đạo hàm [25]; phƣơng pháp HPLC [26]; hay TP Q phƣơng pháp LC-MS [29] Nhiều nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS Trong phƣơng pháp này, thƣờng không định lƣợng ẠO đồng thời đƣợc hoạt chất AML, HCT VAL (vì thơng thƣờng Đ chế phẩm thuốc, VAL thƣờng có hàm lƣợng cao nhiều so với AML N G HCT nên thƣờng hệ số pha lỗng lớn hoạt chất cịn lại) phải đo Ư nhiều bƣớc sóng khác nên phức tạp nhiều thời gian Do ẦN H đó, nghiên cứu chúng tơi sử dụng phƣơng pháp HPLC TR phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm: có tính chọn lọc cao, độ nhạy cao, kết xác (thƣờng đƣợc sử dụng làm phƣơng pháp “trọng tài” cần đánh 00 B giá phƣơng pháp khác), phân tích mẫu hỗn hợp mà không cần 10 chiết tách, định lƣợng đƣợc đồng thời ba hoạt chất điều Ĩ A kiện phân tích tự động hóa để phân tích lƣợng mẫu lớn H Các chất phân tích AML, HCT VAL chất có tính phân -L Í- cực, chúng tơi sử dụng chƣơng trình sắc ký lỏng pha đảo với hệ ÁN dung môi pha động phân cực, cột C18 để phân tích Trên sở tham khảo TO số tài liệu, khảo sát lựa chọn đƣợc điều kiện phân tích phù ÀN hợp để định lƣợng AMB, HCT VAL viên nén: Phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản: hòa tan ban đầu MeOH pha loãng pha động Điều kiện sắc ký: - D IỄ N Đ - + Cột phân tích pha đảo: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) loại cột thơng dụng sở phân tích sử dụng HPLC 55 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM + WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Bƣớc sóng phát hiện: chúng tơi lựa chọn bƣớc sóng 238 nm khơng bị ảnh hƣởng dung môi mẫu (UV cut-off ACN N H Ơ nƣớc 190 nm, MeOH 205 nm) Tại bƣớc sóng này, ba chất N bƣớc sóng cho đáp ứng tối ƣu AML (là hoạt chất có hàm lƣợng nhỏ) U Y phân giải tốt, píc cân đối cƣờng độ hấp thụ phù hợp cho phép định TP Q lƣợng AML, HCT VAL Mặt khác, bƣớc sóng tử ngoại phù hợp với hệ sắc ký sử dụng detector UV, loại detector thông dụng đơn giản Pha động: Đã khảo sát, đƣa thành phần tỷ lệ pha động hợp lý cho Đ + ẠO sở phân tích N G phép tách tốt ba hoạt chất AML, HCT VAL, thành phần pha động đơn H Tốc độ dòng: chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho thời gian phân tích hợp ẦN + Ư giản, thơng dụng (ACN : MeOH : Đệm KH2PO4 = 20 : 50 : 30) TR lý (khoảng phút), áp suất cột vừa phải (126 bar) đảm bảo chất đƣợc Thể tích tiêm: 20 µl đảm bảo đáp ứng phân tích chất rõ ràng 00 + B tách tốt Ĩ A 10 cân đối Í- H 4.2 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích -L Để đảm bảo phƣơng pháp phân tích đạt yêu cầu quy định, ÁN tiến hành thẩm định tiêu tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ TO tuyến tính, độ đúng, độ xác, độ thơ D IỄ N Đ ÀN a Tính thích hợp hệ thống Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống cho thấy RSD % thời gian lƣu diện tích píc hoạt chất từ 0,2 % đến 0,3 %, đạt so với yêu cầu không lớn 2,0 % Điều cho thấy hệ thống sắc ký phù hợp cho việc định lƣợng đồng thời AML, HCT VAL 56 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Trong phần này, không đánh giá độ phân giải píc (RS) píc tách rõ rệt N Tính chọn lọc N H Ơ b Trong nghiên cứu này, đối tƣợng phân tích viên nén bao phim U Y Exforge HCT mẫu placebo tự tạo theo thành phần tá dƣợc chế TP Q phẩm Trên sắc ký đồ mẫu placebo, vị trí tƣơng ứng với thời gian lƣu AML, HCT VAL không thấy xuất píc lạ Píc hoạt chất ẠO gọn, cân xứng, hệ số chồng phổ UV-VIS hoạt chất xấp xỉ 1,0; Đ hệ số tinh khiết píc chất dung dịch mẫu thử xấp xỉ 1,0 Do H Ư Độ tuyến tính c N G đó, phƣơng pháp có tính chọn lọc cao ẦN Chúng tơi xây dựng khoảng tuyến tính đủ rộng đề ứng dụng đánh TR giá định lƣợng nhiều chế phẩm có tỉ lệ phối hợp khác Trong khoảng B nồng độ tuyến tính 0,003125 – 0,03125 mg/ml HCT; 0,0025 – 0,025 00 mg/ml AML; 0,04 – 0,4 mg/ml VAL; hệ số tƣơng quan hồi 10 quy xấp xỉ 1,0 Điều cho thấy có tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ Ĩ A diện tích píc với nồng độ ba hoạt chất H Độ xác Í- d -L Kết thẩm định độ xác (bao gồm độ lặp lại độ tái lặp) ÁN cho kết quả: giá trị RSD % hàm lƣợng PTN < 2,0 %, giá trị TO RSD % hàm lƣợng PTN < 2,0 %, chênh lệch giá trị hàm lƣợng D IỄ N Đ ÀN trung bình PTN < 2,0 % Bên cạnh chúng tơi sử dụng test thống kê t-test để kiểm tra khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc PTN cho giá trị p-value > 0,05 (ttn < ttc) Điều cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai PTN khơng có ý nghĩa thống kê Do đó, phƣơng pháp xây dựng có độ xác cao 57 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Độ e N H Ơ 102,0 %, giá trị RSD % < 2,0 % đáp ứng yêu cầu độ phƣơng pháp phân tích chế phẩm Độ thô U Y f N Kết thẩm định độ cho tỷ lệ thu hồi khoảng từ 98,0 % - TP Q Khi tiến hành sắc ký, lần lƣợt thay đổi thông số nhƣ: chiều dài cột khoảng ± 75%; pH dung dịch đệm khoảng ± 0,2; tỉ ẠO lệ % ACN pha động khoảng ± 30% nồng độ tƣơng đối; tốc độ Đ dòng khoảng ± 50% sử dụng test thống kê ANOVA-Single factor để N G đánh giá kết hàm lƣợng thu đƣợc lần phân tích Kết thu Ư đƣợc giá trị p-value < 0,05 (Ftn < Ftc) cho thấy khác biệt hàm lƣợng ẦN H thu đƣợc lần phân tích khơng có ý nghĩa thống kê Điều cho B TR thấy phƣơng pháp có tính ổn định tốt phân tích 10 00 4.3 Về ứng dụng phƣơng pháp A Chúng sử dụng phƣơng pháp xây dựng để kiểm nghiệm số H Ĩ chế phẩm có chứa AML, HCT VAL thị trƣờng so sánh với số liệu Í- đƣa nhà sản xuất Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai -L phƣơng pháp, sử dụng test thống kê t-test để kiểm tra khác ÁN biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp cho giá trị p-value > TO 0,05 (ttn < ttc) Điều cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai có tính thiết thực tính ứng dụng cao, phù hợp với nhiều chế phẩm khác D IỄ N Đ ÀN phƣơng pháp ý nghĩa thống kê Do đó, phƣơng pháp xây dựng 58 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN N H Ơ Từ kết thực nghiệm thu đƣợc, đạt đƣợc mục tiêu N đề xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời AML, HCT U Y VAL viên nén đủ tin cậy, nhanh chóng thuận tiện Các kết thu TP Q đƣợc nhƣ sau: Cách chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn đơn giản, nhanh chóng: dung mơi a ẠO sử dụng MeOH dung môi đơn giản, không tốn kém, chuẩn bị mẫu Đ phƣơng pháp hòa tan trực tiếp nên tiến hành đơn giản, nhanh chóng N G đồng thời gây sai số ngẫu nhiên Chƣơng trình sắc ký lỏng hiệu cao xây dựng phù hợp ổn Ư b ẦN H định để xác định AML, HCT VAL Chƣơng trình cụ thể nhƣ sau: TR - Cột: Cột phân tích pha đảo Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; µm) - Detector: UV 238 nm 00 B - Pha động: ACN – MeOH – Đệm KH2PO4 0,05M (pH 3,0) = 20 : 50 : 30 10 (Đệm KH2PO4 0,05M pH 3,0: Hịa tan 6,8 g KH2PO4 vừa đủ lít Ó A nƣớc, điều chỉnh pH 3,0 H3PO4 đặc) H - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút -L Í- - Thể tích tiêm: 20 µl Bằng việc sử dụng máy HPLC kết nối với detector DAD, xác nhận ÁN c TO píc HCT, AML VAL thu đƣợc sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết, phổ UV-VIS chất mẫu chuẩn mẫu thử giống (hệ D IỄ N Đ ÀN số chồng phổ xấp xỉ 1,0) d Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính định lƣợng nhanh, đơn giản, xác AML, HCT VAL viên nén Phƣơng pháp có tính chọn lọc cao, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính rộng, độ xác cao, độ tốt độ thơ đáp ứng yêu cầu 59 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Bằng phƣơng pháp HPLC xây dựng, ứng dụng đƣợc kiểm e N H Ơ N nghiệm số chế phẩm chứa HCT, AML VAL lƣu hành thị trƣờng KIẾN NGHỊ U Y Cần áp dụng phƣơng pháp xây dựng kiểm nghiệm nhiều chế TP Q phẩm nhiều hãng sản xuất khác để đánh giá đƣợc tính ứng dụng phƣơng pháp ẠO Mặt khác, cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá độ thô phƣơng pháp Đ thay đổi số thông số nhƣ nồng độ muối, nhiệt độ buồng cột, kích cỡ hạt N G sắc ký, thể tích tiêm, chƣơng trình rửa giải gradient, sử dụng phần mềm tối ƣu ẦN kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc H Ư hóa … để lựa chọn chƣơng trình sắc ký tối ƣu phục vụ công tác TR Tiếp tục nghiên cứu xây dựng, đánh giá tiêu độ hòa tan, tạp chất D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L Í- H Ĩ A 10 00 B liên quan… để đƣa vào chuyên luận Dƣợc điển 60 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội N H Ơ N Tiếng Việt U Y Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr TP Q 187-188, tr 777-779, tr 1453-1455 Bộ Y tế (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp ẠO kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr 158-179 Đ Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích dụng cụ, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr N G 126-143 Ư Bộ Y tế (2010), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị tăng huyết áp, Hà ẦN H Nội TR Bộ Y tế (2014), “Hƣớng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích”, Thơng tư 44/2014/TT-BYT Quy định việc đăng ký thuốc, tr 00 B 261-274 10 Cục Quản lý dƣợc (2013), “Sổ tay hƣớng dẫn đăng ký thuốc”, Quyết Ó A định số 07/QĐ-QLD việc ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký H thuốc, phụ lục 8, tr 30-35 -L Í- GS.TS Nguyễn Lân Việt (2011), “Tăng huyết áp-Vấn đề cần TO ÁN quan tâm hơn”, Dự án phòng, chống tăng huyết áp, Chƣơng trình mục tiêu quốc gia D IỄ N Đ ÀN Tạ Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Hà Minh Hiền, Phùng Thị Vinh cộng (2010), “Nghiên cứu định lƣợng Amlodipin huyết tƣơng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LCMS/MS) áp dụng đánh giá tƣơng đƣơng sinh học”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, số 3.2010, tập (29), tr 1-5 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Tiếng Anh 2nd edition", The pharmaceutical press, pp 664 N H Ơ 11 Alnajjar AO (2011), “Validation of a capillary electrophoresis method N 10 A C Moffat (1986), "Clarke's Isolation and Identification of drugs - for the simultaneous determination of amlodipine besylate and TP Q U Y valsartan in pharmaceuticals and human plasma”, Journal of AOAC International, 94(2), pp 498-502 ẠO 12 Anandakumar K and Jayamariappan M (2011), “Absorption correction method for the simultaneous estimation of Amlodipine N G Đ besylate, Valsartan and Hydrochlorothiazide in bulk and in combined tablet dosage form”, International Journal of Pharmacopoeia (2014), ẦN 13 British H Ư Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp 23-27 “Amlodipine Besilate”, TR “Hydrochlorothiazide”, “Hydrochlorothiazide Tablets”, “Liquid 00 10 783, 1071 B Chromatography”, “Valsartan”, vol I, II, III, V, pp 21, 83, 604, 14 Del Rosario Brunetto M, Contreras Y, Clavijo S, Torres D, Delgado Ó A Y, Ovalles F, Ayala C, Gallignani M, Estela JM, Martin VC Í- H (2009), “Determination of losartan, telmisartan, and valsartan by -L direct injection of human urine into a column-switching liquid Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50(2), pp 194-199 TO ÁN chromatographic system with fluorescence detection”, Journal of D IỄ N Đ ÀN 15 Eyad S M Abu-Nameh, Khalid Abu-Shandi, Munib Saket, Maher Salim, O M Othman, Y Mohammad (2011), “Simultaneous Determination of Amlodipine Besylate and Valsartan in Tablets by High Performance Liquid Chromatography with UV Detection”, Jordan Journal of Pharmaceutical Sciences, 4(2), pp 105-113 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 16 G.N.A.Lakshmi, Kumara Swamy S and Agaiah Goud B (2013), “Preparation and Characterization of Mouth Dissolving Films of Solid Dispersion”, Journal of Advanced N Valsartan N H Ơ Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp 415-427 17 ICH (2005), “Validation of analytical procedures: Text and TP Q U Y Methodology Q2 (R1)” 18 Karunanidhi Santhana Lakshmi and Sivasubramanian Lakshmi (2012), “Simultaneous Analysis of Losartan Potassium, Amlodipine ẠO Besylate and Hydrochlorothiazide in Bulk and in Tablets by Đ High-Performance Thin Layer Chromatography with UV- N G Absorption Densitometry”, Journal of Analytical Methods in H A.D.Mahapatra, A.R.Wadodkar ẦN 19 K.R.Gupta, Ư Chemistry, 2012 and S.G.Wadodkar TR (2010), “Simultaneous UV Spectrophotometric Determination of B Valsartan and Amlodipine in Tablet”, International Journal of 00 ChemTech Research, 2(1), pp 551-556 10 20 Kul D, Dogan-Topal B, Kutucu T, Uslu B, Ozkan SA (2010), “High- Ó A Performance Liquid Chromatographic and First Derivative of the H Ratio Spectrophotometric Determination of Amlodipine and -L Í- Valsartan in Their Binary Mixtures”, Journal of AOAC ÁN International, 93(3), pp 882-890 D IỄ N Đ ÀN TO 21 Mariusz Stolarczyk, Anna Maslanka, Jan Krzek and Joanna Milczarek (2008), “Application of Derivative Spectrophotometry for Determination of Enalapril, Hydrochlorothiazide and Valsartan in Complex Pharmaceutical Preparations”, Acta Poloniae Pharmaceutica, 65(3), pp 275-281 22 Merck & Co., Inc (2001), The Merck Index, 13th Edition, pp 86-87, 854, 1767 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 23 M.Manoranjani1 and T Bhagyakumar (2011), “Rp-HPLC method for the estimation of valsartan in Pharmaceutical dosage forms”, N International Journal of Science Innovations and Discoveries, N H Ơ 1(2), pp 101-108 24 Moussa BA, El-Zaher AA, Mahrouse MA, Ahmed MS (2013), determination of amlodipine besylate and U Y “Simultaneous HPLC coupled with TP Q atorvastatin calcium in binary mixture by spectrofluorimetry and fluorescence detection”, ẠO Chemistry Insights, 8, pp 107-115 Analytical Đ 25 Nikam M.B., Dhamane H., Aligave A., Kondawar M.S (2010), N G “Simultaneous estimation of valsartan, amlodipine besylate and by first Spectrophotometric method”, International order derivative UV Journal Of ẦN H Ư hydrochlorothiazide TR Pharmacy&Technology, 2(3), pp 642-650 M Deryea, 00 Sayed B 26 Samya M El-Gizawy, Osama H Abdelmageed, Mahmoud A Omar, Ahmed M Abdel-Megied (2012), 10 “Development and Validation of HPLC Method for Simultaneous A Determination of Amlodipine, Valsartan, Hydrochlorothiazide in H Ó Dosage Form and Spiked Human Plasma”, American Journal of Í- Analytical Chemistry, 3, pp 422-430 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L 27 Satana E, Altinay S, Göğer NG, Ozkan SA, Sentürk Z (2001), “Simultaneous Determination of Valsartan and Hydrochlorothiazide in Tablets by First-Derivative Ultra-violet Spectrophotometry and LC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 25(5-6), pp 1009-1013 28 Shaalan RA, Belal TS (2010), “Simultaneous Spectro-fluorimetric Determination of Amlodipine besylate and Valsartan in Their Combined Tablets”, Drug Testing and Analysis, 2(10), pp 489493 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 29 Shankar Ganesh Gadepalli, Pragney Deme, Madhusudana Kuncha, Ramakrishna Sistla (2014), “Simultaneous determination of N H Ơ MS/MS and its application to pharmacokinetics in rats”, Journal N amlodipine, Valsartan and hydrochlorothiazide by LC-ESIof Pharmaceutical Analysis, 4(6), pp 399-406 U Y 30 Shobha Krushnan G, Ravi M Britto, Perianayagam J, Rajendra Prasad TP Q R (2013) “Formulation and Evaluation of oro dispersible tablets of amlodipine besylate”, Indian Journal of Research in Pharmacy ẠO and Biotechnology, 1(4), pp 472-477 Đ 31 S S Qutab, S N Razzaq, M Ashfaq, Z A Shuja and I U Khan N G (2007), “Simple and sensitive LC-UV method for simultaneous H Ư analysis of Hydrochlorothiazide and Candesartan cilexetil in ẦN Pharmaceutical formulations”, Acta Chromatographica, (19), pp TR 119-129 32 The United States Pharmacopoeia 37 (2014), “Chromatography”, B Besylate”, 00 “Amlodipine “Amlodipine Besylate Tablets”, 10 “Hydrochlorothiazide Capsule”, “Hydrochlorothiazide Tablets”, Ó A “Valsartan”, “Valsartan Tablets”, vol I, II, III, pp 301-308, 1760- H 1762, 3246-3248, 5115-5117 Í- 33 Varsha R Galande, K.G Baheti, S Indraksha, and M H Dehghan Hydrochlorothiazide in Bulk Mixture and Tablet by UV Spectrophotometry”, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 74(1), pp 18-23 D IỄ N Đ ÀN TO ÁN -L (2012) “Estimation of Amlodipine Besylate, Valsartan and Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM