Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc đan sâm

Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao .... Vì vậy việc định tính, định lượng của acid salvianolic B và tanshinon

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LAN HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LAN HƯƠNG

Mã sinh viên : 1601338

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khoá luận, em đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu cùng bạn bè và gia đình

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Đại học cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 5 năm học qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Hồng Cường – một người thầy đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo sát sao và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khoá luận này

Em xin chân thành cảm ơn DS Hoàng Mạnh Tuấn – học viên cao học khoá 24, Trường Đại học Dược Hà Nội đã chia sẻ, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong thời gian em thực hiện khoá luận

Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho

em trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới Ba Mẹ, gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn bên cạnh, quan tâm và ủng hộ em trong suốt quá trình học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên khoá luận này còn có những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn

bè để khoá luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Lan Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Thông tin cơ bản về vị thuốc Đan sâm 3

1.1.1 Thông tin chung 3

1.1.2 Thành phần hoá học 3

1.1.3 Tác dụng sinh học 5

1.1.4 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền 6

1.2 Định tính, định lượng dược liệu Đan sâm 7

1.2.1 Định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 7

1.2.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 8

1.2.3 Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3 Thông tin chung về cao thuốc 12

1.3.1 Định nghĩa cao thuốc 12

1.3.2 Đặc điểm cao thuốc 13

1.3.3 Một số yêu cầu chất lượng của cao đặc 13

1.4 Tổng quan về các phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài nghiên cứu 13

1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 13

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Thiết bị, máy móc 16

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 17

2.2.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp HPLC 18

2.2.3 Tính toán kết quả và xử lí số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 23

3.1.1 Định tính acid salvianolic B 23

3.1.2 Định tính Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng SKLM 24

3.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm 26

3.2.1 Kết quả lựa chọn điều kiện sắc ký 26

3.2.2 Kết quả khảo sát dung môi và nhiệt độ chiết mẫu 30

3.2.3 Thẩm định quy trình định tính 31

3.2.4 Thẩm định quy trình định lượng 32

3.2.5 Định lượng Sal-B và Tan-IIA trong các mẫu cao đặc Đan sâm 38

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 39

4.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 39

4.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.1.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng TLC 42

5.1.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng HPLC 42

5.2 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Cao DS Cao Đan sâm

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

DĐVN Dược điển Việt Nam

DS Đan sâm

DS-C Đan sâm chuẩn

HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc

kí lỏng hiệu năng cao)

RLCH Rối loạn chuyển hóa

RLLPM Rối loạn lipid máu

Sal-B Acid Salvianolic B

SKĐ Sắc kí đồ

SKLM Sắc kí lớp mỏng

Tan-IIA Tanshinon IIA

THA Tăng huyết áp

TLC Thin layer chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả SKLM định tính Sal-B trong cao đặc Đan sâm sau khi hiện vết ở bước

sóng 366 nm 24

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm sau khi hiện vết ở bước sóng 254 nm 26

Bảng 3.3 Hàm lượng Sal-B và Tan-IIA trong cao khi chiết bằng các dung môi khác nhau 30

Bảng 3.4 Hàm lượng Sal-B và Tan-IIA trong cao khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau 30 Bảng 3.5 Kết quả độ thích hợp hệ thống 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính định lượng Sal-B và Tan-IIA 33

Bảng 3.7 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian của Sal-B 35

Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian của Tan-IIA 36

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của Sal-B 37

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng của Tan-IIA 37

Bảng 3.11 Hàm lượng Sal-B và Tan-IIA trong các mẫu cao Đan sâm 38

Hình 3.6 Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu ghi ở bước sóng 270 nm 31

Hình 3.7 Phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn Sal-B (a) và Tan-IIA (b) 31 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích peak của Sal-B (a)

và Tan-IIA (b) 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tim mạch là một trong những vấn đề sức khỏe được quan tâm hàng đầu hiện nay Theo tổ chức Y tế thế giới, năm 2015 có khoảng 17,7 triệu người tử vong vì bệnh tim mạch (chiếm 45% tổng số ca tử vong do các bệnh không truyền nhiễm) [35] Năm

2016, tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch trên toàn thế giới vẫn đứng đầu, xếp sau là bệnh ung thư, đột quỵ…[36] Dự kiến đến năm 2030 sẽ có khoảng 23,3 triệu bệnh nhân mắc bệnh tim mạch tử vong trên toàn thế giới [34] Rối loạn lipid máu (RLLPM), rối loạn chuyển hoá (RLCH) của carbohydrat, tăng huyết áp (THA) và béo phì được coi là những yếu tố nguy cơ của bệnh tim mạch thường được nhắc đến nhiều nhất Vì vậy, nghiên cứu phát triển các nhóm thuốc điều trị bệnh tim mạch, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc đông dược vốn được biết đến với nhiều công dụng hiệu quả và ít tác dụng phụ, luôn

Âu trong điều trị bệnh liên quan đến tim mạch, sử dụng một mình hoặc kết hợp với thuốc

khác để điều trị cho hiệu quả tốt và ít tác dụng phụ [37], [39]

Acid salvianolic B (Sal-B), tanshinon IIA (Tan-IIA) là thành phần quan trọng của Đan sâm, có tác dụng chống oxy hóa, tác dụng trên chuyển hóa lipid máu và ức chế sự hình thành xơ vữa động mạch, tăng cường lưu thông máu và làm tan ứ đọng, góp phần bảo vệ tim mạch [21], [39] Vì vậy việc định tính, định lượng của acid salvianolic B và tanshinon IIA có ý nghĩa quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng dược liệu và các sản phẩm từ Đan sâm

Cao đặc Đan sâm là bán thành phẩm trung gian để sản xuất ra các dạng bào chế hiện đại tiện dụng như thuốc cốm, viên nén, viên nang Tuy nhiên, cao đặc Đan sâm chưa

có tiêu chuẩn chất lượng Chính vì vậy, việc khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao đặc nhằm tiêu chuẩn hoá dạng bào chế này là cần thiết Mặt khác, acid salvianolic B, tanshinon IIA được lựa chọn là các chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng dược liệu Đan sâm, nhưng hiện nay DĐVN V [3], DĐTQ [18] chưa đề xuất phương án định lượng

đồng thời hai chất này mà là phương pháp định lượng riêng biệt từng chất, điều này gây tốn kém dung môi, hóa chất và thời gian phân tích

Từ những lí do trên, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc

Đan sâm” được nghiên cứu với các mục tiêu:

- Khảo sát định tính acid salvianolic B, tanshinon IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

- Khảo sát định tính, định lượng đồng thời acid salvianolic B, tanshinon IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Thông tin cơ bản về vị thuốc Đan sâm

1.1.1 Thông tin chung

1.1.1.1 Tên khoa học:

Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) [5],

[6]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật

- Đan sâm là loại cây thảo sống lâu năm, cao 30-80 cm Rễ mảnh có đường kính

0,5-2 cm, phân nhánh nhiều, màu đỏ nâu Thân hình trụ, có 4 cạnh và lông mềm Lá mọc đối, kép lông chim lẻ, 3-5 lá chét, đôi khi 7, hình trứng hoặc trái xoan, dài 2-7 cm, rộng 0,8-5 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mép có răng cưa tròn, hai mặt phủ lông trắng mềm, dày hơn ở mặt dưới, gân lá chằng chịt thành mạng lưới, làm phiến lá như bị rộp lên, lá chét tận cùng lớn hơn, cuống lá dài

- Cụm hoa mọc ở đầu kẽ lá hoặc đầu ngọn thành bông gồm nhiều vòng sít nhau ở ngọn, mỗi vòng có 3-10 hoa màu lơ tím nhạt, đài chia hai môi, môi trên nguyên, môi dưới xẻ hai thùy; tràng hai môi, môi trên dài hơn ống tràng và cong hình lưỡi liềm, môi dưới chia hai, nhị ba

- Quả bế nhỏ, đầu tù, dài 3 mm

- Mùa hoa: tháng 5-8, mùa quả: tháng 6-9 [12]

1.1.1.3.Phân bố, thu hái, chế biến

- Cây được nhập trồng ở vùng núi (như Tam Ðảo) và đồng bằng (Hà Nội), sinh trưởng tốt

- Ðào rễ vào mùa đông, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy khô

- Tẩm nước, ủ mềm một đêm, thái lát mỏng, phơi khô, dùng sống hoặc sao qua, hoặc tẩm rượu 1 giờ rồi mới sao Bảo quản nơi kín, khô mát [5], [6], [11]

1.1.1.4 Bộ phận dùng

- Rễ (vẫn gọi là củ) Rễ to chắc, khô, mềm Ngoài sắc đỏ tía, trong vàng thâm mịn, không có xơ, không có rễ con là tốt Củ cứng giòn, gầy, đen có xơ là xấu [6]

1.1.2 Thành phần hoá học

1.1.2.1 Phenol và acid phenolic

Các thành phần thân nước có hoạt tính sinh học được phân lập từ rễ Đan sâm:

- Danshensu, acid rosmarinic, acid rosmarinic methyl ester, các acid salvianolic A,

B, C, G, acid lithospermic, acid lithospermic dimethyl ester [12], [29]

- Ngoài ra, hiện nay đã phân lập và xác định được 36hợp chấtphenol và acid phenolic

từ rễ Đan sâm (protocatechuic acid, các acid salvianolic I, J, E…) [37]

Hoạt chất acid salvianolic B:

- Công thức cấu tạo

Acid salvianolic B

- Tác dụng sinh học: chống oxy hóa, chống kết tụ tiểu cầu, chống đông máu và chống huyết khối, bảo vệ tế bào nội mô, ức chế thiếu máu cục bộ và giảm oxy do chấn thương

cơ tim, chống viêm [39]

- Hàm lượng acid salvianolic B trong Đan sâm quy định theo DĐVN 5, DĐTQ, phân tích bằng phương pháp HPLC không được ít hơn 3,0 % tính theo dược liệu khô kiệt [3], [18]

1.1.2.2 Các hợp chất diterpen

Các thành phần thân dầu có hoạt tính sinh học được phân lập từ rễ Đan sâm:

- Miltirone, dehydromiltirone, tanshinon I, tanshinon IIA, tanshinon IIB, methyltanshinonat, cryptotanshinon, isotanshinon I, isotanshinon IIA, isocryptotanshinon, danshexinkun D [12]

- Ngoài ra, hiện nay đã phân lập và xác định được 49 hợp chất quinon diterpenoid từ

rễ Đan sâm (przewaquinone A, przewaquinone B, przewaquinone C, sibiriquinone A, sibiriquinone B…) [29]

Hoạt chất tanshinon IIA:

- Công thức hóa học

Tanshinon IIA

- Tác dụng sinh học: ức chế của quá trình oxy hóa LDL, bảo vệ chức năng nội mô mạch máu, ức chế sự hình thành tế bào bọt, ức chế kết tập tiểu cầu [33]

- Hàm lượng tanshinon-IIA trong Đan sâm quy định theo “Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông”, phân tích bằng phương pháp HPLC không được ít hơn 0,12 % tính theo dược liệu khô kiệt [19]

- Cao đan sâm có tác dụng chống viêm ở chuột cống trắng có viêm khớp nhiễm khuẩn

và chuột nhắt có viêm tai gây bởi dầu ba đậu [12]

- Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy có mối liên quan giữa tác dụng tăng cường tuần hoàn máu của đan sâm trong y học cổ truyền với sự chẩn đoán của y học hiện đại

về tác dụng điều trị bệnh tim mạch, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn và huyết khối tắc mạch não [12]

- Ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu, Đan sâm đã được sử dụng rộng rãi

để điều trị các bệnh mạch máu bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, tăng lipid máu và đột quỵ [33]

- Tác dụng hạ lipid máu: tanshinon IIA và acid salvianolic B có trong Đan sâm có tác dụng hạ nồng độ cholesterol toàn phần trong huyết tương, kèm theo giảm đáng kể nồng

độ cholesterol toàn phần của gan và triglyceride [27], [28], [37]

- Chống xơ vữa: tanshinon IIA và Acid salvianolic B trong Đan sâm có thể làm mất

sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu và làm giảm sự tăng sản nội bào trong sự phát triển của chứng xơ vữa động mạch [22], [37], [40]

- Chống thiếu máu cơ tim: acid salvianolic B trong Đan sâm có khả năng điều trị bệnh thiếu máu cục bộ ở bệnh nhân mắc bệnh mạch vành [32], [44] Tanshinon II có tác dụng bảo vệ cơ tim chống lại những rối loạn về chức năng và chuyển hóa gây ra bởi thiếu hụt oxy [21]

- Chống tăng huyết áp: tanshinon IIA tác động lên huyết áp thông qua giảm áp lực động mạch trung bình phổi ở chuột bị tăng huyết áp do thiếu oxy [25]

- Acid salvianolic B có thể ức chế các triệu chứng của bệnh tiểu đường typ 2 [24] Ngoài ra, Đan sâm còn có một số tác dụng dược lý khác như:

Phòng chống bệnhParkinson thông qua ức chế việc giảm hàm lượng dopamine Phòng chống bệnh Alzheimer thông qua ức chế quá trình apoptosis của tế bào thần kinh

Tác dụng trên bệnh phổi cấp tính: cải thiện làm thay đổi mô bệnh học phổi và cả các chỉ số khí máu cũng như giảm phù phổi và rò rỉ mạch máu

Tác dụng chống ung thư trên một số loại ung thư như: ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư biểu mô ruột kết…[37]

1.1.4 Tác dụng, công dụng theo y học cổ truyền

Bổ can tỳ: dùng trong trường hợp gan, lách sung to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả

Giải độc: dùng trong sang lở, mụn nhọt [7]

- Liều dùng: Ngày dùng 6-12 g, dạng thuốc sắc [5]

- Kiêng kị: không có ứ trệ thì không nên dùng [5], [6]

- Một số đơn thuốc có Đan sâm:

Đơn 1 Chữa kinh nguyệt không đều, động thai, đẻ xong máu hôi không ra hết, đau khớp xương: Dùng Ðan sâm rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô, tán nhỏ, ngày uống 8g chia 3 lần, chiêu thuốc với nước nóng [11]

Đơn 2 Chữa viêm gan mạn tính hoặc sưng gan, đau vùng gan: Dùng Ðan sâm, Cỏ nọc sởi, mỗi vị 20g, sắc uống hàng ngày [11]

Đơn 3 Chữa phong nhiệt, ghẻ lở: Dùng Ðan sâm 20g, Thổ sâm 16g, Sà sàng (hạt) 16g, nấu nước để rửa khi còn nóng [11]

Đơn 4 Chữa tim sưng đau, hoặc điên cuồng, tâm thần hoảng hốt: Dùng Ðan sâm, Mạch môn, Ngưu tất, Sinh địa, mỗi vị 20g, Tâm sen sao, Hoàng liên (hay Dành dành) mỗi vị 8g, sắc uống [11]

Đơn 5: Chữa tức ngực, đau nhói ở vùng tim: Dùng Đan sâm 32g, Xích thược, Xuyên khung, Hoàng kỳ, Hồng hoa, Uất kim mỗi vị 20g, Đảng sâm, Toàn quy, Trầm hương mỗi vị 16g, Mạch môn, Hương phụ kim mỗi vị 12g [12]

1.2 Định tính, định lượng dược liệu Đan sâm

1.2.1 Định tính bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

1.2.1.1 Định tính tanshinon IIA

Theo DĐVN 5 [3]: So sánh với dược liệu Đan sâm chuẩn, chất chuẩn tanshinon IIA

- Bản mỏng: Silica gel G

- Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (60 °C đến 90 °C) – ethyl acetat (4:1)

- Dung dịch thử: Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml ether, lắc kỹ, để yên 1 giờ, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethyl acetat dùng làm dung dịch thử Dung dịch dược liệu đối chiếu: Lấy 1g bột Đan sâm (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ờ phần Dung dịch thử Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan một lượng tanshinon IIA chuẩn trong ethyl acetat để thu được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí Quan sát dưới ánh sáng thường

- Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá trị Rf và màu sắc với các vết thu được trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu và có một vết

màu đỏ đậm có cùng màu sắc và giá trị Rf với vết của tanshinon IIA trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu

1.2.1.2 Định tính acid salvianolic B

Theo DĐVN 5 [3]: So sánh với dược liệu Đan sâm chuẩn, chất chuẩnacid salvianolic

B

- Bản mỏng: Silica gel G

- Dung môi khai triển:

Cloroform – ethyl acetat – toluen – acid formic – methanol (3:4:2:2:0,5)

- Dung dịch thử: Lấy 0,2g bột dược liệu, thêm 25 ml methanol 75%, đun hồi lưu trên cách thủy 1 giờ Lấy 0,2g bột Đan sâm (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ờ phần dung dịch thử Lọc, bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến còn 1 ml, dùng làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Hòa tan một lượng acid salvianolic B chuẩn trong methanol 75% để thu được dung dịch có nồng độ 2 mg/ml

- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µl mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

- Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các vết cùng giá trị Rf và màu sắc với các vếtcủa dung dịch dược liệu đối chiếu và có một vết cùng màu sắc và giá trị

Rf với vết acid salvianolic B trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu

1.2.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch thử: 0,2 g bột dược liệu được chiết với 5 ml methanol trong 30 phút bằng phương pháp siêu âm Sau khi ly tâm, phần cắn nổi lên trong dịch chiết được cho vào bình định mức 25 ml, chiết lại hai lần với 5 ml metanol, gộp dịch chiết, pha loãng đến

25 ml với nước Phần cắn còn lại sau đó được chuyển vàobình cầu đáy tròn 50 ml và được đun hồi lưu với 10 ml nước trong 30 phút, sau đó ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút, gộp phần dịch này với dung dịch metanol ở trên Dịch chiết được lọc qua màng 0,22 µm thu được dung dịch thử

- Dung dịch đối chiếu: các chất chuẩn danshensu, acid rosmarinic, acid lithospermic, acid salvianolic B, cryptotanshinon, tanshinon IIA được pha loãng với nồng độ thích hợp trong methanol

+ Điều kiện sắc ký:

- Pha tĩnh: Cột C18 (Alltech, Alltima C18, 4,6 mm x 250 mm, 5 µm)

- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Pha động: nước – acetonitril – acid fomic (90:10:0,4) và acetonitril (B)

Chương trình gradient rửa giải: 0-40 phút: 0-30% B, 40-50 phút: 30-80% B, 50-70 phút: 80-85% B

- Tốc độ dòng 1,0 ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 280 nm

+ Tiến hành sắc ký: Tiêm 20 µl lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC và ghi nhận sắc ký đồ Các peak trong sắc kí đồ được xác định cấu trúc bằng cách sử dụng các kỹ thuật LC-MS-MS và so sánh các giá trị thời gian lưu của các chất chuẩn đối chiếu với các peak trong mẫu thử Tính toán thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic đặc trưng theo thời gian lưu (RT) theo công thức:

RRT = RT pic

RT pic chuẩn

Trong đó: RTpic là thời gian lưu của pic đang tính RRT (phút)

RTpic chuẩn là thời gian lưu của peak chất chuẩn (phút)

- Yêu cầu: Thời gian lưu của các peak từ hai sắc ký đồ không khác biệt quá 2,0% [23]

1.2.3 Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.3.1 Định lượng tanshinon IIA

Theo “Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông” [19]

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu và cho vào ống ly tâm 10

ml, sau đó thêm 5 ml hỗn hợp methanol và dicloromethan (8:2), trộn đều Siêu âm trong

30 phút, sau đó ly tâm với lực ly tâm 540 x g trong 5 phút Cho phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml Lặp lại quá trình chiết thêm bốn lần nữa Gộp các dịch chiết và thêm vừa đủ dung môi đến vạch Lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm thu được dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 5,0 mg tanshinone IIA và hòa tan trong 50 ml methanol thu được dung dịch gốc chuẩn tanshinon IIA (100 mg/L) Lấy chính xác thể tích của tanshinon pha loãng với methanol để tạo ra dãy các dung dịch chuẩn có nồng

độ 5, 10, 20, 50, 100 mg/L cho tanshinone IIA dùng cho sắc ký

- Điểu kiện sắc ký:

+ Pha tĩnh: Cột silica (4,6 mm x 250 mm, 5 µm)

+ Pha động: methanol – nước (75:25)

+ Detector quang phổ tử ngoại đặt tại bước sóng 270 nm

- Yêu cầu: Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,12% tanshinon IIA tính theo dược liệu khô kiệt

1.2.3.2 Định lượng acid salvianolic B

Theo quy định trong DĐTQ 2015 [18]

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,15 g bột dược liệu vào bình nón có nút mài, thêm chính xác 50 ml methanol 80 %, đậy nút, cân, siêu âm 30 phút, để nguội, cân lại

và bổ sung methanol để được khối lượng ban đầu Trộn đều và lọc

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan acid salvianolic B chuẩn trong methanol 80 % để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 0,10 mg/ml

- Điêu kiện sắc kỷ:

+ Pha động: Acetonitril - Acid phosphoric 0,1% (22:78)

+ Detector quang phổ từ ngoại đặt ở bước sóng 286 nm

salvianolic B trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng chất chuẩn trong dung dịch acid salvianolic B chuẩn

- Yêu cầu: Dược liệu phải chứa không ít hơn 3,0 % acid salvianolic B tính theo dược liệu khô kiệt

1.2.3.3 Định lượng nhóm hoạt chất thân dầu

Định lượng tanshinon I, tanshinon IIA, và cryptotanshinon sử dụng phương pháp HPLC [38]:

+ Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch thử: 1,0 g bột dược liệu được cho vào bình nón dung tích 100 ml với 50

ml methanol ở nhiệt độ phòng Sau đó ngâm trong 2h hoặc siêu âm trong 45 phút Dịch chiết được lọc qua màng 0,20 µm thu được dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn gốc cryptotanshinon, tanshinon IIA, và tanshinon

I được pha trong methanol Pha loãng dung dịch chuẩn gốc để được dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng 0,139 – 83,33 µg/ml

1.2.3.4 Định lượng nhóm hoạt chất thân nước

Định lượng đồng thời 7 hợp chất phenolic trong thuốc tiêm Đan sâm bằng phương pháp HPLC [43]

+ Chuẩn bị mẫu:

- Dung dịch thử: 200 µl thuốc tiêm được pha loãng thành 1ml với nước thu được dung dịch thử

- Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn gốc danshensu 4,05 mg/ml, acid salvianolic A 1,10 mg/ml, acid salvianolic B 1,00 mg/ ml, protocatechuic aldehyde 5,10 mg/ml, acid caffeic 1,00 mg/ml được pha trong dung dịch acid phosphoric-methanol-nước (0,5:80:19,5) Pha loãng dung dịch chuẩn gốc để được dãy các dung dịch chuẩn có nồng

1.3 Thông tin chung về cao thuốc

1.3.1 Định nghĩa cao thuốc

Cao thuốc là chế phẩm điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia nhỏ đến kích thước thích hợp)

Với một số dược liệu đặc biệt, có chứa các men phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng hơi ethanol sôi, hơi nước sôi, hoặc các phương pháp chiết xuất thích hợp khác để bảo vệ hoạt chất trong dược liệu [3]

1.3.2 Đặc điểm cao thuốc

Hầu hết cao thuốc thường tối màu (màu nâu, hoặc nâu đậm), thành phần của cao thuốc rất phức tạp, gồm nhiều nhóm chất khác nhau trong nhiều loại dược liệu, có cả thành phần vô cơ và hữu cơ, các sản phẩm phân hủy của các chất trong quá trình nấu,

cô cao và đã được loại bỏ một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất nhày, chất gôm, chất béo, nhựa…)

Cao thuốc thực chất là dịch chiết toàn phần của dược liệu, tác dụng của nó là tác dụng tổng thể của các thành phần trong cao tương tự dạng thuốc sắc Cao thuốc có thể làm nguyên liệu sản xuất các dạng bào chế mới, tiện cho việc sử dụng như siro, viên hoàn, thuốc mỡ, viên nén, viên nang, thuốc bột, thuốc cốm [3]

1.3.3 Một số yêu cầu chất lượng của cao đặc

- Mất khối lượng do làm khô: cao đặc không quá 20%

- Tỷ trọng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu về tỷ trọng của cao

- Định tính: Phải có phản ứng định tính của dược liệu dùng để bào chế cao thuốc

- Định lượng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu định lượng hoạt chất trong cao

- Các chỉ tiêu khác: Giới hạn nhiễm khuẩn, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật, hàm lượng kim loại nặng [3]

1.4 Tổng quan về các phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

1.4.1.1 Nguyên tắc

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn theo phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố dịnh trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng trường hợp Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được

di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf

được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi [1]

Rf = a

b

Trong đó:

a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;

b là khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu;

- Định lượng: có hai cách là tách chất phân tích trong vết sắc ký rồi định lượng hoặc

đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký [2], [13]

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.2.1 Nguyên tắc

HPLC là kỹ thuật phân tách, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Chủ yếu sự phân tách các chất dựa trên cơ chế phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của các chất trong hỗn hợp cần phân tích với hai pha là ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý, thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh cho phù hợp [3], [13]

1.4.2.2 Các đại lượng đặc trưng

- Thời gian lưu (tR): là thời gian cần thiết để rửa giải một chất, từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi peak đến detector

- Diện tích peak: là đại lượng dùng để định lượng các chất

- Số đĩa lý thuyết (N): số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), được tính theo công thức [1]

W1/2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao của peak

1.4.2.3 Ứng dụng

HPLC được ứng dụng nhiều trong kiểm nghiệm, dùng để định tính, định lượng, xác định giới hạn tạp chất

- Định tính: thông qua thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn trên sắc ký đồ

- Định lượng: các phép định lượng bằng HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak của nó Các phương pháp định lượng thường được sử dụng trong HPLC là phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn, thêm đường chuẩn và chuẩn hóa diện tích [2]

- Xác định giới hạn tạp chất [3], [13]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vị thuốc Đan sâm được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược phẩm VCP đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc 2015 [18]

- Cao đặc Đan sâm: Đan sâm được rửa sạch, ủ mềm, thái phiến dày 2-4 mm, sấy khô, chiết bằng hỗn hợp ethanol-nước ở 80°C, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không đến thể chất lỏng sánh, tiếp tục cô cách thủy ở 80°C đến thể chất cao đặc (độ ẩm < 20%)

2.1.2 Thiết bị, máy móc

 Tủ sấy Memmert (Đức)

 Bể siêu âm T840DH – Elma (Đức)

 Cân kĩ thuật Precisa (Thuỵ Sĩ) độ chính xác 0,01 g

 Cân phân tích AND GR200 (Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg

 Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (Thuỵ Sĩ) độ chính xác 0,01 mg

 Máy đo độ ẩm Precisa XM 120

 Máy cô quay chân không IKA® RV 8 (Đức)

 Hệ thống lọc chân không, màng lọc 0,45 m

 Màng lọc syringe 0,45 μm Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản)

 Lọ đựng mẫu (vial) 1,5 mL Shimadzu (Shimadzu, Nhật Bản);

 Hệ thống thiết bị SKLM hiệu năng cao Linomat 5 (Camag Switzerland)

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu bao gồm: Bơm LC-30AD, detector mảng diod (DAD) SPD-M20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu, hệ thống tiêm mẫu tự động SIL-20A, cột sắc ký Shim-pack GIST C18

 Các dụng cụ thuỷ tinh: bình gạn, bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, pipet có bầu, và các dụng cụ khác tại phòng thí nghiệm đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích

 Bộ nồi chiết, cô cao inox, bếp hồng ngoại, bếp cách thuỷ, các dụng cụ chế biến thuốc

2.1.3 Hoá chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn

- Chất chuẩn Sal-B (C36H30O16): Hàm lượng 99,34% (Xinyang Zhongjian Metrology Biological Technology Co., Ltd., Lot No 200105)

- Chất chuẩn Tan-IIA (C19H18O3): Hàm lượng 98,09% (Xinyang Zhongjian Metrology Biological Technology Co., Ltd., Lot No 191206)

- Dược liệu chuẩn: dược liệu Đan sâm có phiếu kiểm nghiệm của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (SKS: CV 0116016.01)

- Hoá chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty TNHH Sela, 48 Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Methanol, ethanol tuyệt đối, ethyl acetat, diethyl ether, acid formic, acetonitril (Merck), toluen, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích dùng cho HPLC (Hãng Merck), nước cất 2 lần, …

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

 Mẫu nghiên cứu:

- Dược liệu chuẩn: Đan sâm được nghiền thành bột thô

- Dược liệu nguyên liệu: Đan sâm được nghiền thành bột thô

- Cao đặc Đan sâm chiết bằng ethanol 70%

- Chất chuẩn Sal-B

- Chất chuẩn Tan-IIA

 Chiết xuất: Khảo sát các mẫu nghiên cứu và chiết xuất bằng dung môi thích hợp

 Tiến hành sắc kí lớp mỏng để xác định các vết và Rf trong các mẫu nghiên cứu với các điều kiện chung:

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110 oC trong 60 phút

- Chấm mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag):Chấm các mẫu cách cạnh dưới bản mỏng

10 mm, cách cạnh bên 15 mm

- Triển khai:

+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2

+ Kiểm soát độ ẩm: dung dịch KSCN bão hòa trong 10 phút

+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 20 phút (giấy lọc) bằng 20 ml dung môi pha động

+ Thể tích dung môi khai triển: 10 ml

+ Khoảng cách triển khai là 90 mm kể từ đáy bản mỏng Sấy khô bản mỏng

trong 5 phút

- Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag

- Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan

 So sánh các vết trên sắc kí đồ giữa cao đặc Đan sâm với các dược liệu nguyên liệu, dược liệu chuẩn và chất chuẩn

2.2.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B, Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng phương pháp HPLC

2.2.2.1 Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch chuẩn gốc Sal-B 1150,36 µg/ml và dung dịch

chuẩn gốc Tan-IIA 195,20 µg/ml trong methanol 70% Lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc Sal-B pha với 2 ml dung dịch chuẩn gốc Tan-IIA được dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ Sal-B là 958,63 µg/ml và Tan-IIA là 32,53 µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc này pha dãy chuẩn có nồng độ Sal-B trong khoảng 29,96-958,63 µg/ml và nồng độ Tan-IIA trong khoảng 1,02-32,53 µg/ml

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1000 g cao vào bình nón có nút mài 50 ml,

thêm chính xác 25 ml dung môi (khảo sát dung môi theo phương pháp nêu ở mục 2.2.2.2), cân, siêu âm trong 30 phút (khảo sát nhiệt độ chiết theo phương pháp nêu ở mục 2.2.2.2) Để nguội Cân lại, bổ sung khối lượng mất đi bằng dung môi Lọc qua màng lọc syringe 0,45 µm thu được dung dịch tiêm sắc ký

2.2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Pha tĩnh: Cột sắc kí C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm)

- Detector: khảo sát bước sóng phát hiện

Tham khảo các tài liệu [9], [18], và căn cứ kết quả quét phổ mẫu chuẩn hỗn hợp trong khoảng 210-350 nm để chọn bước sóng

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Nhiệt độ cột: khảo sát nhiệt độ cột

Tham khảo các tài liệu [18], [43] khảo sát các nhiệt độ cột sắc ký: 20 °C, 30 °C, 40

°C để chọn nhiệt độ cột cho sắc ký đồ có các peak Sal-B và Tan-IIA tách tốt nhất

Hệ 1: 0-15 ph: 28% A; 15-16 ph: 28-86% A; 16-30 ph: 86% A; 30-31 ph: 86-28% A; 31-35 ph: 28% A

Hệ 2: 0-20 ph: 27% A; 20-21 ph: 27-85% A; 21-35 ph: 85% A; 35-36 ph: 85-27% A; 36-40 ph: 27% A

Hệ 3: 0-20 ph: 26% A; 20-21 ph: 26-86% A; 21-35 ph: 86% A; 35-36 ph: 86-26% A; 36-40 ph: 26% A

Cách tiến hành:

Định tính: Tiêm 10 µl dung dịch thử, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích

peak Trên sắc ký đồ của mẫu thử có peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của peak chính trong sắc ký đồ mẫu chuẩn, khác biệt không quá 2,0%

Định lượng: Tiêm riêng biệt 10 µl các dung dịch chuẩn vào máy sắc ký, ghi nhận sắc

ký đồ, diện tích của peak Sal-B, Tan-IIA Xây dựng đường hồi qui tuyến tính biểu diễn

sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng độ dung dịch chuẩn (g/ml) theo phương trình

St: Diện tích peak Sal-B, Tan-IIA trên sắc ký đồ của dung dịch thử

Ct: Nồng độ của Sal-B, Tan-IIA trong dung dịch thử (µg/ml)

a: Giá trị hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính

b: Giá trị hệ số chắn của đường hồi quy tuyến tính

m: Khối lượng cao đặc (g)

H: Hàm ẩm của cao đặc (%)

2.2.2.3 Khảo sát điều kiện chiết mẫu

a Khảo sát dung môi chiết

Tham khảo các tài liệu [15], [31], [45] khảo sát dung môi chiết: Chiết cao bằng methanol 30%, 50%, 70% và 100% Tiến hành định lượng theo điều kiện HPLC đã khảo

sát So sánh hàm lượng Sal-B và Tan-IIA giữa các mẫu chiết bằng các dung môi khác nhau để chọn dung môi chiết cho hàm lượng Sal-B và Tan-IIA cao nhất

b Khảo sát nhiệt độ chiết

Tham khảo các tài liệu [20], [30] khảo sát nhiệt độ chiết: Chiết 3 mẫu với 3 mức nhiệt

độ chiết là 30 °C, 40 °C và 50 °C So sánh hàm lượng Sal-B và Tan-IIA giữa các mẫu chiết ở các nhiệt độ khác nhau để chọn nhiệt độ chiết thích hợp cho hàm lượng Sal-B và Tan-IIA cao nhất

2.2.2.4 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời hai hoạt chất Sal-B,

Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm

Tiến hành chạy sắc kí các dung dịch đã được xử lí theo quy trình xử lí mẫu ở trên theo điều kiện đã chọn, thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu:

- Đối với phương pháp định tính: thẩm định tiêu chí độ đặc hiệu

- Đối với phương pháp định lượng: thẩm định các tiêu chí tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian), độ đúng [14], [26]

- Đối với phương pháp định lượng: chứng minh kết quả của phép định lượng không

bị ảnh hưởng bởi các yếu tố trong quá trình phân tích

Cách tiến hành: Tiến hành chạy sắc kí lần lượt với các mẫu sau:

- Đánh giá độ phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn

hệ thống phân tích bao gồm bởi các yếu tố như: máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành phân tích,

- Tiến hành: sắc kí 6 lần liên tiếp dung dịch chuẩn hỗn hợp acid salvianolic B, tanshinon IIA có nồng độ thích hợp Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích peak Tính RSD (%) của các thông số trên

Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích peak ≤ 2,0% [14]

 Độ tuyến tính

- Pha một dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp acid salvianolic B, tanshinon IIA ở các nồng

độ thích hợp Tiến hành sắc kí như điều kiện đã lựa chọn

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ acid salvianolic B, tanshinon IIA trong các dung dịch chuẩn

Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,99 [14]

 Độ chính xác

Tiến hành:

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Dùng dãy dung dịch chuẩn trong phần độ tuyến tính

- Chuẩn bị dung dịch thử: Tiến hành trên 6 mẫu thử độc lập rồi chuẩn bị như quy trình phân tích

- Định lượng 06 mẫu thử độc lập

- Thực hiện độ lặp lại vào 2 ngày ngày khác nhau

- Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng Sal-B, Tan-IIA có trong mẫu

- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu ở mỗi ngày và giữa hai ngày

Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả định lượng mỗi ngày (n=6) và của cả 2 ngày (n=12)

≤ 2,7% với các chất có hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và ≤ 3,7% với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1% [14]

 Độ đúng

- Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với giá trị thực

- Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm một lượng đã biết chất chuẩn tương ứng với 25%, 50% và 100% so với mẫu thử vào mẫu thử ở mức nồng độ 50% để được nồng

độ các chất Sal-B và Tan-IIA ở mức 75%, 100% và 150% so với mẫu thử

- Tiến hành chuẩn bị mẫu theo quy trình và sắc kí theo điều kiện đã chọn, định lượng Sal-B và Tan-IIA trong mẫu thử và mẫu thử 50% thêm chuẩn, xác định tỷ lệ thu hồi Sal-

B và Tan-IIA, mỗi nồng độ thực hiện 3 lần

- Xác định tỉ lệ thu hồi (%) Sal-B và Tan-IIA

Yêu cầu:

- Tỷ lệ thu hồi đạt 97,0-103,0% với các chất có hàm lượng từ 1% đến dưới 10% và đạt 95-105 % với các chất có hàm lượng từ 0,1% đến dưới 1% ở mỗi mức nồng độ [14]

2.2.2.5.Định lượng các mẫu cao đặc Đan sâm

Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng các mẫu cao đặc Đan sâm được chiết bằng nước và ethanol ở các nồng độ 30%, 50%, 70%, 90% và 96%

2.2.3 Tính toán kết quả và xử lí số liệu

Các số liệu nghiên cứu được tính dựa vào các công thức hoặc sử dụng công cụ Data analysis trong Microsoft Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Định tính cao đặc Đan sâm bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

3.1.1 Định tính acid salvianolic B

- Cân các mẫu với khối lượng đã được tính toán như sau vào 3 bình nón 100 ml riêng biệt:

Đan sâm chuẩn 0,2 g Đan sâm nguyên liệu 0,2 g Cao đặc Đan sâm 0,2 g

-Chuẩn bị cả 3 mẫu với cùng một điều kiện chiết:

Thêm vào 25 ml methanol 75%, siêu âm trong 30 phút và lọc Cho bay hơi dịch lọc trên cách thủy đến còn 1 ml, thu được dung dịch chấm sắc kí

- Mỗi dung môi chiết thực hiện trên một mẫu, mỗi mẫu thực hiện chiết một lần

- Dung dịch chất chuẩn acid salvianolic B (Sal-B): Cân chính xác 6,19 mg acid salvianolic B (hàm lượng 99,34%) cho vào bình định mức 10 ml, thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol 70% thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 600 g/ml

- Tiến hành: Triển khai theo điều kiện chung, chấm các mẫu trên băng dài 8 mm

- Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, 366 nm

 Kết quả

Cao DS 2 l

DS 3 l DS-C 3 l Sal-B 3 l

Qua khảo sát lựa chọn hệ (I) cho kết quả hiện vết và tách vết tốt nhất (Bảng 3.1 và

Mẫu nghiên cứu Cao DS DS DS-C Sal-B

Cao DS: Cao đặc Đan sâm DS-C: Đan sâm chuẩn

DS: Dược liệu Đan sâm Sal-B: Chất chuẩn acid salvianolic B

 Nhận xét

Trên SKĐ quan sát sau khi hiện vết ở bước sóng 366 nm các vết tách tốt và có vết

tương ứng với nhau Trong đó:

- Dược liệu Đan sâm có 4 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn (Rf = 0,08; 0,18; 0,37;

0,73) và có 1 vết tương ứng với chất chuẩn Sal-B (Rf = 0,08)

- Cao đặc Đan sâm có 7 vết, trong đó: Có 5 vết tương ứng với dược liệu Đan sâm (Rf

= 0,08; 0,18; 0,37; 0,56; 0,73), có 4 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn (Rf = 0,08; 0,18;

0,37; 0,73)và có 1 vết tương ứng với chất chuẩn Sal-B (Rf = 0,08)

3.1.2 Định tính Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm bằng SKLM

 Mẫu nghiên cứu

Hình 3.1 SKĐ định tính acid salvianolic B sau khi hiện vết

ở bước sóng 366 nm

- Cân các mẫu với khối lượng đã được tính toán như sau vào 3 bình nón 100 ml riêng biệt:

Đan sâm chuẩn 0,75 g Đan sâm nguyên liệu 0,75 g Cao đặc Đan sâm 0,75 g

-Chuẩn bị cả 3 mẫu với cùng một điều kiện chiết:

Thêm vào 5 ml ether, lắc kỹ, để yên 1 giờ, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethyl acetat thu được dung dịch chấm sắc kí

- Mỗi dung môi chiết thực hiện trên một mẫu, mỗi mẫu thực hiện chiết một lần

- Dung dịch chất chuẩn tanshinon IIA (Tan-IIA): Cân chính xác 3,98 mg tanshinon IIA (hàm lượng 98,09%) cho vào bình định mức 20 ml, thêm vừa đủ đến vạch bằng methanol 70% thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 200 g/ml

 Điều kiện sắc kí

- Pha động: Tham khảo các tài liệu [3], [17], [18], [19], [41] khảo sát các hệ dung môi sau:

Toluen – ethyl acetat (19:1) (I)

Ether dầu hỏa (60°C đến 90°C) – ethyl acetat (4:1) (II)

N-hexan – ethyl acetat – acid formic (30:10:0,5) (III)

Ether dầu hỏa (60°C đến 80°C) – ethyl acetat – cyclohexan (5:3:2) (IV)

- Tốc độ phun: 200 nl/s

- Thể tích phun mẫu:

- Tiến hành: Triển khai theo điều kiện chung, chấm các mẫu trên băng dài 5 mm

- Phát hiện: Soi UV ở bước sóng 254 nm, hiện vết ở ánh sáng thường

Bảng 3.2 Kết quả SKLM định tính Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm sau khi hiện

vết ở bước sóng 254 nm

Ghi chú: (+): Có vết (++): Vết đậm (+++): Vết rất đậm

Cao DS: Cao đặc Đan sâm DS-C: Đan sâm chuẩn

DS: Dược liệu Đan sâm Tan-IIA: Chất chuẩn tanshinon IIA

Nhận xét:

Trên SKĐ quan sát sau khi hiện vết ở bước sóng 254 nm các vết tách tốt và có vết tương ứng với nhau Trong đó:

- Dược liệu Đan sâm có 3 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn (Rf = 0,15; 0,17; 0,44)

và có 1 vết tương ứng với chất chuẩn Tan-IIA (Rf = 0,44)

- Cao đặc Đan sâm có 5 vết, trong đó: Có 3 vết tương ứng với dược liệu Đan sâm (Rf

= 0,15; 0,17; 0,44), có 3 vết tương ứng với Đan sâm chuẩn (Rf = 0,15; 0,17; 0,44) và có

1 vết tương ứng với chất chuẩn Tan-IIA (Rf = 0,44)

3.2 Định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA trong cao đặc Đan sâm

3.2.1 Kết quả lựa chọn điều kiện sắc ký

hấp thụ, trong khi Sal-B lại cho cực tiểu hấp thụ Qua khảo sát, hàm lượng Tan-IIA thấp hơn nhiều so với hàm lượng Sal-B trong mẫu cao đặc Đan sâm, mặt khác việc sử dụng một bước sóng phát hiện phù hợp với điều kiện phân tích khi không có detector PDA

Vì vậy bước sóng 270 nm là cực đại hấp thụ của Tan-IIA đã được ưu tiên lựa chọn để định tính, định lượng đồng thời Sal-B và Tan-IIA

Hình 3.3 Hình ảnh phổ của Sal-B (a) và Tan-IIA (b)

3.2.1.2 Lựa chọn pha động

Phân tích mẫu thử và mẫu chuẩn hỗn hợp Sal-B 239,66 µg/ml và Tan-IIA 8,13 µg/ml

với 3 hệ dung môi khác nhau đã nêu trên Kết quả được trình bày ở hình 3.4 cho thấy hệ

pha động 1 và 2 không tách được chất, ở chân peak của Sal-B còn dính với peak khác,

hệ pha động 3 peak Sal-B và Tan-IIA tách rõ so với các peak khác Do vậy, hệ pha động

3 được lựa chọn cho phân tích tiếp theo

b) a)