Điều tra, thu thập mẫu củ bình vôi ở một số tỉnh Việt Nam và xây dựng phương pháp định lượng Rotundin bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC Scanning)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- VŨ ĐỨC THẮNG ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU CỦ BÌNH VÔI Ở MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



VŨ ĐỨC THẮNG

ĐIỀU TRA, THU THẬP MẪU CỦ BÌNH VÔI Ở MỘT SỐ TỈNH VIỆT NAM VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP ĐO MẬT ĐỘ

MỞ ĐẦU

Bình vôi là tên gọi của nhiều loài cây là dây leo có rễ củ thuộc chi

Stephania, họ Tiết dê – Menispermaceae Cây Bình vôi còn gọi là cây củ một,

củ mối tròn, dây mối trơn, gà ấp…[89]

Trên thế giới chi Stephania có khoảng trên 50 loài, ở Việt nam có

khoảng 14 đến 16 loài.Các loài Bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam, thường gặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hoà Bình, Cao Bằng, Thanh Hoá, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu

Củ Bình vôi chứa chủ yếu các alkaloid với hàm lượng rất khác nhau trong từng loài, trong đó đặc biệt là hợp chất Rotundin (hay L-tetrahydropalmatin) chiếm hàm lượng lớn Trong y học cổ truyền từ xa xưa củ Bình vôi đã được dùng dưới dạng sắc, ngâm rượu chữa mất ngủ, an thần, nhức đầu, sốt nóng, ho hen, lỵ, đau bụng, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn và khó thở Hiện nay Rotundin được dùng chủ yếu để chữa bệnh mất ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý.Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [5] Các nghiên cứu gần đây nhất còn cho thấy Rotundin khi sử dụng với liều thấp còn có tác dụng làm giảm ảnh hưởng gây nghiện của cocain, gợi ý việc sử dụng Rotundin như một chất cai nghiện [29], [56], [57] Bên cạnh đó, nhiều hoạt tính sinh học quý báu của Rotundin cũng đã được chứng minh bao gồm tác dụng an thần – giảm đau – gây ngủ, tác dụng hạ sốt, bảo vệ thần kinh, chống động kinh, hạ huyết áp, giãn cơ trơn [13]

Hiện nay việc tiêu thụ và sản xuất Rotundin từ nguyên liệu củ Bình vôi đang ngày càng được phát triển cả ở trên thế giới và Việt Nam Việc bán tổng hợp Rotundin thành Rotundin sunfat để sản xuất thuốc tiêm cũng đã được Học viện Quân Y nghiên cứu thành công Trên thị trường đã xuất hiện rất

nhiều sản phẩm thương mại có chứa Rotundin và Rotundin sunfat như sản phẩm viên Rotunda, Sen vông, Roxen, Nightqueen Tuy nhiên hiện nay nguồn dược liệu củ Bình vôi của Việt Nam trong tự nhiên đang ngày càng cạn kiệt do việc khai thác bừa bãi, không có qui hoạch.Vì vậy việc khảo sát để tìm kiếm loài Bình vôi có hàm lượng Rotundin cao, từ đó xây dựng phương án bảo tồn và nhân giống, trồng bình cây vôi là hoàn toàn cần thiết

Để góp phần vào việc nghiên cứu với mục đích trên, trong luận văn này

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Điều tra, thu thập mẫu củ Bình vôi ở

một số tỉnh Việt Nam và xây dựng phương pháp định lượng Rotundin bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)” nhằm

tìm kiếm, xác định được loài Bình vôi chứa hàm lượng hoạt chất Rotundin cao và đưa ra được phương pháp định lượng Rotundin từ củ Bình vôi tươi bằng TLC-Scanning giúp tiết kiệm được thời gian và chi phí so với định lượng từ củ khô bằng HPLC, phục vụ cho việc thu mua kịp thời nguồn dược liệu để sản xuất Rotundin ở qui mô lớn

Nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

1 Đihiên cứu cụ thể như sau:úp tiết kiệm được thời gian và chi phíNam và xác đcụ thể như sau:úp tiết kiệm được t

2 Xây d xác đcụ thể như sau:úp tiếRotundin trong các mụ thể như sau:úp tiết kbằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo mật độ quang TLC-Scanning

3 Chianning.g pháp sắcRotundin ttunding.g pháp sắc ký lỏng kết hợp đo c hóa học của Rotundin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Bình vôi

Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát

(Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia Chúng là các loài cây thân thảo dạng dây leo, thường xanh, cao tới 4 m, với thân củ dạng gỗ phình to, trong dân gian gọi là củ Các lá mọc thành vòng xoắn trên thân cây, hình khiên với cuống lá gắn gần trung tâm của lá Hoa nhỏ, khác gốc, màu vàng cam tụ tập thành tán kép Quả hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ, chứa một hạt, hình móng ngựa, có gai [89]

Trên thế giới chi Bình vôi Stephania có khoảng 50 loài, phân bố ở vùng

nhiệt đới, Á nhiệt đới ở các nước châu Á là chủ yếu như: Trung quốc (43 loài), Thái lan (18 loài), Indonesia (17 loài), Việt nam (14 - 16 loài), Malaysia (11 loài), Ấn độ (11 loài), Philippin (8 loài), Papua New Guinea (8 loài), Myanma (5 loài), Nhật bản (2 loài), Sri Lanka (2 loài), Lào (2 loài), Đông timor (1 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 loài); ngoài ra còn có ở châu Úc: Australia (7 loài), và châu Phi (12 loài) [8]

Ở nước ta, các loài trong chi Bình vôi có khoảng 14 đến 16 loài và chúng phân bố rất rộng, trên nhiều địa phương từ Bắc vào Nam Song các khu vực

có số loài phong phú, đa dạng và tập trung hơn cả là các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Kạn, Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hoà Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình,

Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh Một số ít loài (S venosa, S cambodica Gagnep, S pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình

Định, Phú Yên, Ninh Thuận, Khánh Hoà, Bà Rịa - Vũng Tàu và An Giang

[15] Trước đây, tên Bình vôi chỉ dùng cho một loài là Stephaniarotunda Lour (Stephania glabra (Roxb.) Miers.), cùng với những tên khác là Củ một,

Củ gà ấp, Dây mối trơn, Cà tòm, Cáy pầm (Tày), Co cáy khẩu (Thái), Tở lùng dòi (Dao), P'lồi (K'ho), Moon - seed (Anh)

Một số loài Bình vôi đã được phát hiện tại một số tỉnh ở Việt Nam được liệt kê trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số loài Bình vôi được phát hiện tại một số tỉnh ở Việt Nam

STT Tên loài Địa điểm Hàm lượng Tài liệu

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Bình vôi

Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm

hoặc hằng năm (Hình 1.1) Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm Trên thân già thường có những rãnh dọc,

những mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định Có loài rễ củ thường chỉ nặng 0,5-2(hoặc 3) kg, nhưng cũng có loài cho củ có thế nặng tới 50-70 kg Tùy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng nhạt, nâu đậm, xám tro, đen ) Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu,

đỏ tươi

Lá mọc cách, cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20 cm và hai đầu phồng lên[15], có khi gấp khúc ở gốc [21] Cuống lá đính vào lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc lá ở những khoảng cách nhất định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá) Phiến

lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gổm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát

từ đỉnh cuống lá Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía)

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá Cụm hoa

có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [15], có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ít nhất ở các nhánh tán cấp 1 (2), các nhánh cuối cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [21] Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8,rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường 4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xoè thành đĩa

tròn Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Ở quả trưởng thành, cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có 1 phát triển thành hạt, còn 1 thoái hóa Ở quả chín, vỏ ngoài thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hình trứng dẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên khoa học đối với các loài chi Bình vôi [15] Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [21]

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Bình vôi

1.1.2 Sinh thái, sinh trưởng và phát triển của các loài Bình vôi

Các loài thuộc chi Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh Chúng thường mọc trên đỉnh hay trên các sườn núi đá

vôi, núi đất xen lẫn đá, các dải đất ven đường, ven sông, đôi khi gặp ở ven bờ

2000-2500mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH = 6,5-7 Một số loài có thể phân bố ở độ cao tới 2.000-2.800 m so với mực nước biển Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa sáng, ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả

Các loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm

Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11- 12 Những chồi này ở trạng thái "chồi ngủ" cho đến mùa xuân (tháng 1 - 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ trong vòng 1 - 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1m Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vôi, vì trên loại chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II) Số lá của chồi cấp II nhiều hơn gấp bội so với chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Lá trưởng thành ngay trong mùa hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng lá hàng năm cũng là tập tính quan trọng của cây Bình vôi Sự tái sinh chồi mạnh

mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra

từ củ đem vùi xuống đất Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi Trong tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng

Hạt Bình vôi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1.000 hạt thường chỉ khoảng 10-29g Hạt phát tán nhờ nước Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh Chỉ sau 5-6 tháng tuổi, cây đã vươn dài tới 50-80(-100) cm, phân cành khỏe Ở một số loài, cây có thể bắt đầu ra hoa và cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi Trong quá trình

sinh trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ớ những loài có củ) hoặc phân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những loài chỉ có rễ dạng sợi) [15]

1.1.3 Kỹ thuật nhân giống và gây trồng

Có thể nhân giống Bình vôi bằng cả phương pháp vô tính hoặc hữu tính Với các loài Bình vôi không có củ (chỉ có rễ dạng sợi) thì có thế nhân giống rất dễ dàng bằng các đoạn hom dây lấy từ thân hoặc cành Còn với các loài Bình vôi có củ thường chỉ có thể nhân giống sinh dưỡng bằng các mảnh

củ ở phía gần gốc Tuy nhiên, hệ số nhân giống vô tính thường thấp, chỉ gấp

có 2-4 lần và tốc độ tăng truởng cũng rất chậm

Nhân giống Bình vôi từ hạt là biện pháp có hiệu quả cao Hạt Bình vôi sau khi thu hoạch nếu gieo ngay hoặc ủ trong cát ẩm thì tỉ lệ nẩy mầm sẽ cao Sau khi gieo khoảng 40-65 ngày thì hạt bắt đầu nảy mầm Hạt tươi được gieo ngay sau khi thu hái, ở điều kiện thuận lợi có tỷ lệ nẩy mẩm khá cao (thường

từ 75-85%) Nếu để lâu 2-3 tháng mới gieo thì tỷ lệ nẩy mầm chỉ đạt khoảng 30% tối đa 40-45%

Trồng 2-3 năm có thể thu hoạch dược liệu Thời gian càng lâu năng suất càng cao Trồng bằng hạt có năng suất cao hơn trồng từ mầm củ [15]

1.1.4 Năng suất và thu hái củ Bình vôi

Đến nay, ở nước ta việc khai thác củ và cả lá vẫn chủ yếu dựa vào nguồn Bình vôi mọc sẵn trong tự nhiên Lượng củ Bình vôi bị khai thác để sử dụng trong nước cũng như bán qua biên giới trong thời gian qua khá lớn Những năm trước đây, sản lượng khai thác thường đạt tới 500-700 tấn/năm Hiện nguồn nguyên liệu trong tự nhiên đã trở nên rất khan hiếm Bình vôi trồng từ hạt trong năm đầu tiên năng suất củ tươi có thể đạt 1-2 tấn/ha, đến năm thứ 2

và 3 có thể đạt 2,5-3(-5) tấn/ha [15]

1.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học củ Bình vôi

Những cây thuộc chi Stephania (họ Menispermaceae) phân bố rộng và

đƣợc sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác nhau Hơn 150 hợp chất alkaloid cùng với flavonoids, lignans, steroids, terpenoids

và coumarins đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc trong chi này và nhiều hợp chất đã đƣợc đánh giá có hoạt tính sinh học cao

1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học củ Bình vôi trên thế giới

Số lƣợng các hợp chất đã phân lập từ các loài trong chi Stephaniatrên

thế giới có thể xếp vào 9 nhóm hợp chất đƣợc liệt kê trong bảng 1.2 [8]

Bảng 1.2 Các nhóm alkaloid trong chi Stephania

STT Nhóm chất Số lƣợng alkaloid

có L-tetrahydropalmatin

cepharantha

1.2.2 Các nghiên cứu về thành phần hóa học củ Bình vôi ở Việt Nam

Một số hợp chất đã đƣợc phân lập từ một số loài Bình vôi ở Việt Nam đƣợc liệt kê trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu về alcaloid đã đƣợc phân lập từ một số

loài Bình vôi ở Việt Nam

STT Nhóm chất Tên chất Phân lập từ

loài TLTK

2

3 Cepharanthin S pierrei Diels [9]

N-[2-(8,9- yl)ethyl)-N-

3,4-d][1,3]dioxol-(5-methylglyciat

Stephania sp [9]

9

dimethoxyphenanthrol[

2-(8,9)- yl)-N-

3,4-d][1,3]dioxol-(5-methylenthanamin

Stephania sp [9]

1.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số

loài thuộc chi Bình vôi Stephania

Rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh các lớp chất trong củ Bình vôi có hoạt tính vô cùng phong phú nhƣ hoạt tính chống sốt rét, hoạt tính kháng sinh, diệt giun sán, kháng virus, chống ung thƣ, an thần, gây ngủ, chống viêm, giảm đau, miễn dịch …đƣợc liệt kê trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania

Chống sốt rét

Dehydroroemerine, tetrahydropalmatine, xylopinine, cepharanthine, N-

methylliriodendronine, dimethylliriodendronine, liriodenine, dicentrinone, corydine, aloe-emodine

2-O,N-[25], [61]

Kháng sinh

Glabradine, dịch chiết trong cồn từ

củ từ loài S glabra (Roxb.) Mies,

dịch chiết trong methanol từ rễ của

loài S japonica, cepharanone

D,formyl-asimilobine, formylannonain

N-[44], [71], [72], [73], [81], [82],[83]

loài S cepharantha Hayata

[22], [55], [64], [65], [86]

tetrandrine, d-isochondrodendrine, dịch chiết trong cồn từ củ của loài

S venosa (Blume) Spreng,

aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine, berbamine, cepharanthine, (−)-asimilobine-2-O-_-D-glucoside, (−)-nordicentrine, (+)-2-N-methyltelobine, 7-

oxodehydrocaaverine, oxocrebanine, dehydrocrebanine, crebanine, aristololactamI

7-[27], [28], [33], [34], [37], [39], [42], [46], [48], [51], [53], [54], [58], [59], [60],[62], [63], [66], [76], [77], [79], [82], [83], [84], [85]

Giảm rối loạn thần

kinh, an thần

(−)-Stepholidine, tetrahydropalmatin

L-[4], [12], [14], [20], [21], [32], [88]

L-[26], [35], [43], [49], [50], [52], [67], [75], [80]

1.4 Hợp chất Rotundin trong cây Bình vôi

1.4.1 Cấu trúc hóa học

Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid, lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [40]:

Đó là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật

Do được phân lập từ các chi họ thực vật khác nhau, mà trước đây hợp chất này còn mang một số tên gọi khác, như là: caseanin, Rotundin và hyndarin

Công thức cấu tạo của Rotundin:

Danh pháp quốc tế: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10- tetramethoxy- 6H dibenzo [a,g] quinolizine

Tên khoa học: L-tetrahydropalmatin hay Hyndarin, Rotundine, Caseanine

1.4.2 Tính chất lí học

Tính chất

Tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị Bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt Tan trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong acid sulfuric loãng

định lượng L-tetrahydropalmatin trong nguyên liệu thực vật cũng như để tủa

nó trong quá trình chiết alkaloid toàn phần

Phản ứng tạo tủa: L-tetrehydropalmatin cho phản ứng với các thuốc thử chung cho alkaloid Các thuốc thử chung thường dùng để nhận biết là:

- Thuốc thử Busacda (Iodo-Iodua) cho tủa nâu

Ngoài ra L-tetrahydropalmatin còn cho phản ứng tủa tạo tinh thể với một số muối vô cơ như với dung dịch platin clorua, dung dịch nước bão hòa axit picric

Phản ứng oxy hóa dư oxy không khí: L-tetrahydropalmatin dễ dàng bị oxy hóa trong không khí chuyển thành màu vàng, vì vậy người ta thường sử dụng chất này dưới dạng muối clorat hoặc sulfat và bảo quản trong lọ màu hổ phách

và ở nơi ít sáng

1.4.4 Tác dụng dược lí của Rotundin

Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú Kết quả nghiên cứu ở Liên xô, Rumani, Trung quốc [4] đã chỉ ra rằng L-tetrahydropalmatin rất ít độc Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30 mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm nó mệt 1-2 ngày, đồng

tử bị liệt nhất thời rồi lại hết

Năm 1941, DS.Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi và P Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vôi, đặt tên là Rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn [13]

Theo Ngô Đại Quang (1999) tác dụng dược lý của Rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta từ thời Pháp thuộc Rotundin được áp dụng từ năm 1944

và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất

là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [5]

Theo Nguyễn Tiến Vững [21], [21] đã tiến hành thăm dò tác dụng của L-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não Kết quả là sau khi cho thỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền, thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong thể lưới thân não có những biến động rõ Sự tăng thành phần sóng chậm denta và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não Theo Dương Hữu Lợi [12] khi tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml dung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 2% nhận thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì trong vòng 3-5 giờ

Khi dùng theo đường tiêm bắp, thuốc tiêm Rotundin sulfat có tác dụng

ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [4]

Theo Zhu X Z [87] D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua

không chỉ có tác dụng giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ

Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận [14], trong nghiên cứu đã cho thấy gindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alcaloid chiết từ củ Bình vôi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách rõ rệt Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năng kéo dài thời gian ngủ lên 1,5 lần Hỗn hợp alcaloid với liều 100 mg/kg thể trọng chuột cũng có tác dụng tương đương Nguyễn Tiến Vững [21] đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của L-tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đã kéo dài giấc ngủ của pentotal rất

rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm trực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần

Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm Rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng) tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp

15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm Rotundin ít độc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, Rotundin còn có ở dạng tiêm là Rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh v.v [5]

Chu Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự [29] nghiên cứu cơ chế giảm đau của L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cainghiện ở Trung Quốc Theo Mantsch John R., Li Shi-Jiang [57] L- tetrahydropalmatin có tác dụng trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodon [56]

1.5 Một số sản phẩm thương mại sử dụng Rotundin hiện nay

- Viên Rotunda 30 mg (xí nghiệp dược phẩm TW I)

- Rotundin 30 (30 mg/viên) (Sao Kim Pharma)

- Rotundin 30 (30 mg/viên) (DNA pharma)

- Học viện Quân y nghiên cứu sản xuất thuốc Rotundin sulfat tiêm 60 mg/2ml

- Xí nghiệp dược phẩm Hà nội sản xuất viên Roxen 30 (30 mg/viên), chè an thần

- Công ty cổ phần Traphaco sản xuất viên Stilux (60 mg/viên), Trasleep (30 mg/viên)

- Roduxen viên nén 30 mg của công ty cổ phần Dược và thiết bị vật tư

- Nightqueen (30 mg/viên) của công ty DHG Pharma

- Ginkgomin platinum của công ty Dược phẩm Thiên phúc

1.6 Các phương pháp định lượng Rotundin

1.6.1 Phương pháp kết tủa với AgNO 3 [68], [69]

Tiến hành: Trong một bình định mức 50 ml, hòa tan một lượng chế phẩm khoảng 0,3g Rotundin trong 2 ml acid acetic, thêm 15 ml nước cất, đun nóng nhẹ cho hòa tan hết, trộn đều Thêm chính xác 25,0 ml dung dịch kali iodide 1,7%, pha loãng với nước cất đến vạch, trộn thêm 3-5 giọt chỉ thị natri

Phương pháp này được Dược điển Trung Quốc năm 2000 áp dụng để

định lượng Rotundin nguyên liệu

1.6.2 Phương pháp chuẩn độ môi trường khan [69]

Chuẩn độ môi trường khan là phương pháp chuẩn độ acid và base yếu hoặc những muối của chúng trong môi trường không phải là nước Rotundin

là base yếu, nên Dược điển Trung Quốc năm 2000 đã áp dụng phương pháp này để định lượng Rotundin hydroclorid nguyên liệu

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,35 g chế phẩm thêm 25 ml acid acetic khan, 2 ml anhydride acetic và 5 ml dung dịch thủy ngân (II) acetat, lắc cho tan hết, thêm 1 giọt dung dịch tím tinh thể làm chỉ thị và chuẩn

độ bằng dung dịch acid perclorich 0,1 M cho đến khi dung dịch chuyển sang mầu xanh lục Song song tiến hành chuẩn độ mẫu trắng 1ml dung dịch acid

1.6.3 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến [3], [68, [69]

Phương pháp này dựa trên định luật Lambert – Beer

Cách tiến hành: Hòa tan một lượng chế phẩm Rotundin với nồng độ khoảng 0,003% trong dung dịch acid sulphuric 0,5% Rồi đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở bước sóng 281 nm, mẫu trắng là acid sulphuric 0,5% Tính hàm lượng Rotundin trong chế phẩm theo trị số A (1%, 1cm) ở bước sóng cực đại 281 nm là 155

Dược điển Trung Quốc áp dụng phương pháp này để định lượng Rotundin trong các chế phẩm viên nén và thuốc tiêm

1.6.4 Phương pháp sắc ký bản mỏng

Đưa dung dịch chuẩn Rotundin và dung dịch thử lên cùng một bản mỏng Tiến hành triển khai bằng dung môi thích hợp để tách Rotundin ra khỏi các alkaloid khác Phun thuốc thử hiện mầu hay soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để xác định vết Rotundin trong dung dịch thử tương ứng với vết

Rotundin của dung dịch chuẩn Xử lý bản mỏng để xác định hàm lượng Rotundin trong vết dựa trên các vết của dung dịch chuẩn [31]

1.6.5 Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điều kiện sắc ký cột:

- Cột RP18 (250 x 4.0 mm; 5µm)

- Tốc độ dòng: 1µl/phút

- Detector UV với bước sóng phát hiện 283 nm

- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng

- Thể tích tiêm: 20 µl

(37,5 ml) và triethylamin (0,5 ml) Dùng dung dịch acid phosphoric đặc để điều chỉnh pH đến 4,0 Lọc qua màng lọcmịn cỡ 0.45 um, lắc siêu âm trong 5 phút để loại bỏ khí

Chuẩn bị mẫu: Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử có nồng độ tương đương khoảng 0,04 mg Rotundin khan trong 1 ml pha động

Thời gian lưu của Rotundin là 4,32 phút So sánh diện tích của pic Rotundin chuẩn với diện tích của mẫu thử từ đó tính ra kết quả

1.7 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng trong phân tích định lượng

Ngày nay với các tiến bộ của kỹ thuật và thiết bị xử lý bản mỏng sau khai triển và các phương tiện lượng hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng việc sử dụng bản mỏng để định lượng các hợp chất ngày càng được áp dụng một cách phổ biến

Lượng chất tham gia quá trình tách được xác định với các cấp độ chính xác khác nhau tuy theo phương tiện sử dụng để đưa mẫu lên bản mỏng

Sau khi khai triển hệ dung môi thích hợp các vết của các chất khác nhau được tách riêng rẽ trên bản mỏng Có một số biện pháp khác nhau để

xác định lượng chất trong các vết và có thể chia chúng thành 2 nhóm: tách chất khỏi bản mỏng và định lượng trực tiếp trên sắc đồ

1.7.1 Phương pháp định lượng sau khi tách các chất khỏi bản mỏng

Phương pháp này tiến hành chuyển tất cả vết cần phân tích trên bản mỏng vào một dung môi thích hợp Sau khi thực hiện tinh khiết hóa mẫu đo bằng các cách khác nhau, tiến hành thực hiện các phép đo thích hợp như đo quang, đo huỳnh quang, cực phổ…

Để lấy chất khỏi bản mỏng dùng dao sắc cạo tất cả bột ở vết cần định lượng vào bình hoặc dùng phễu con có màng xốp úp ngược và hút chân không vào cuống phễu Sau đó dùng dung môi hòa tan chất và lọc bỏ chất hấp phụ

Xử lý và định lượng dịch lọc bằng các phương pháp thích hợp

Phương pháp này cho kết quả đáng tin cậy nhưng khá mất thời gian Ngoài những sai số có thể mắc phải trong quá trình sắc ký, phương pháp này

có thể gặp thêm một số trở ngại sau:

+ Độ tinh khiết của chất hấp phụ: ảnh hưởng của các tạp chất trong chất hấp phụ và chất kết dính (nếu có), đặc biệt là sắt phải không có hoặc được làm sạch trước khi tiến hành sắc ký

+ Độ tinh khiết của dung môi: phải đuổi hết dung môi sau khi khai triển, dung môi hòa tan chất phải không ảnh hưởng đến phép đo tiếp theo

+ Không chuyển hết chất trên bản mỏng vào dung dịch

1.7.2 Các phương pháp định lượng trực tiếp trên bản mỏng

Các phương pháp thuộc nhóm này dựa trên nguyên tắc xác định lượng chất có trong vết dựa vào diện tích hay cường độ màu của vết Trường hợp không có điều kiện và chấp nhận sai số lớn có thể so sánh trực tiếp bằng mắt

về độ lớn và màu sắc của các vết Hiện nay có rất nhiều phương tiện có thể hỗ trợ cho việc tiến hành định lượng trên bản mỏng như: máy đo mật độ vết

(densitometer), các hệ thống video (CCD camera.: charge-coupled device camera), máy quét (flatbed scanner)

1.7.3 Các biện pháp xử lý vết trên bản mỏng trong định lượng

Trong khoảng lượng chất từ 1 đến 100 ug, giữa diện tích của vết S và logarit của lượng chất M có quan hệ tuyến tính: S = a.lgM + b với a, b là các hằng số thực nghiệm Một số người cho rằng căn bậc hai của diện tích vế có quan hệ tuyến tính logarit khối lượng chất trong phạm vi khá rộng về nồng độ theo công thức:

Trong đó: M và A là lượng chất và diện tích vết của dung dịch thử

MS và AS là lượng chất và diện tích vết của dung dịch chuẩn

Một số biện pháp xác định diện tích vết cổ điển:

- Sử dụng thiết bị đo diện tích (diện tích kế)

- Vẽ lại trên giấy ô ly rồi tính milimet vuông

- Vẽ lại trên giấy can, rồi so sánh diện tích qua trọng lượng bằng phương pháp cân

c) Đo mật độ vết bằng densitometer

Nguyên tắc của phương pháp là chiếu chùm tia sáng vào vết sắc ký trên bản mỏng và đo cường độ ánh sáng truyền qua, cường độ ánh sáng phản xạ hay cường độ huỳnh quang Trong các trường hợp, chiều cao của pic tỷ lệ với cường độ màu ở tâm và chiều rộng pic tỷ lệ chiều dài của vết theo hướng quét Thông thường hướng quét của chùm sáng theo hướng khai triển sắc ký

đồ và các vết phải tách rời nhau Có các kiểu xác định khác nhau: phản xạ, truyền qua hay huỳnh quang

Đã có một công bố sử dụng phương pháp này để phân tích nhóm hoạt chất Lignan và flavonoid trong Diệp hạ châu đắng

d) Xỷ lý hình ảnh với camera kỹ thuật số

Những năm gần đây, việc quét bản mỏng mới các hệ thống phân tích hình ảnh, đặc biệt với CCD camera trở nên phổ biến hơn Lợi thế của kỹ thuật này là có thể quét bản mỏng với một vùng rộng hơn và số điểm ảnh lớn hơn với các thiết bị kỹ thuật số có độ phân giải ngày càng cao Các dữ liệu ảnh được xử lý bằng máy tính

e) Xử lý hình ảnh với máy quét văn phòng

Các hệ thống phân tích hình ảnh thường có giá thành cao, một phương pháp khác cũng được áp dụng là dùng máy quét văn phòng (scanner) để thu được hình ảnh bản mỏng [18] Hình ảnh bản mỏng có thể được đo kích thước bằng tay hay tự động trong các chương trình đồ hoạc trên máy tính hay xử lý với các phần mềm chuyên dụng Đây là phương pháp có thể thu được kết quả nhanh và giá thành thấp

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Loài Bình vôivà củ Bình vôi được thu thập ở một số tỉnh Hà Giang, Sơn

La, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Tây Nguyên vào khoảng tháng 4, tháng 5 năm 2014

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều tra đánh giá, thu thập và xác định tên loài thực vật

- Điều tra thực địa: Điều tra theo tuyến chọn lựa

- Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa

- Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây

- Giám định tên khoa học: Dùng phương pháp hình thái so sánh; tra cứu các tài liệu chuyên khảo về khóa phân loại các loài Bình vôi

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật

Mẫu củ Bình vôi tươi được rửa sạch đất cát, để ráo nước, rồi đem thái lát mỏng và băm nhuyễn Sau đó được ngâm trong dung dịch axít theo quy trình chiết tổng alkaloid toàn phần

2.2.3 Phương pháp chiết alkaloid toàn phần

Trong nguyên liệu thực vật ngoài alkaloid còn có vô số các chất khác như

protein, nhựa, tanin, terpenoid, glycosid, sáp Chiết xuất các alkaloid là tách

chúng ra khỏi dược liệu dưới dạng tinh khiết, không lẫn các tạp chất hoá học

khác nhau có chứa trong dược liệu

Để chiết tổng alkaloid toàn phần tử củ Bình vôi tươi chúng tôi áp dụng theo phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước axit, hoặc ethanol [90]

2.2.4 Phương pháp định lượng Rotundin trong alkaloid toàn phần

Định lượng Rotundin trong alkaloid toàn phần chiết xuất từ củ Bình vôi tươi bằng phương pháp sắc ký bản mỏng kết hợp đo mật độ quang(TLC-Scanning) [31]

2.2.5 Các phương pháp hóa lý để nhận dạng cấu trúc

Cấu trúc của hợp chất Rotundin được xác định bằng việc sử dụng kết hợp các phương pháp vật lí như đo điểm nóng chảy, độ quay cực và

H-NMR)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1

Cây Bình vôi được thu thập ở một số tỉnh Hà Giang, Sơn La, Cao Bằng, Lào Cai, Hòa Bình, Tây Nguyên vào khoảng tháng 4, tháng 5 năm 2014 Theo dõi sự phát triển của cây, thu hoa, quả và hạt để xác định tên khoa học Tiêu bản được lưu giữ tại phòng lưu mẫu của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Củ Bình vôi được dùng cho các nghiên cứu về hóa học Mẫu củ Bình vôi tươi được rửa sạch đất cát, để ráo nước, rồi đem thái lát mỏng và băm nhuyễn Sau đó được ngâm trong dung dịch axít theo quy trình chiết tổng alkaloid toàn phần

- Máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) - Đức sử dụng để đo điểm nóng chảy

- Máy JASCO 200 sử dụng đo phổ hồng ngoại theo phương pháp ép viên với

KBr

- Máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap spectrometer sử dụng đo phổ khối

ESI-MS

- Máy Bruker Avance 500, sử dụng TMS làm chất nội chuẩn để đo phổ cộng

- Tủ sấy, tủ hút, tủ lạnh, đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm

- Kẹp mắt cáo để ép mẫu tiêu bản

- GPS để xác định tọa độ nơi thu mẫu

- Sổ sách ghi chép ngoài thực địa

- Dung môi chiết tách: Dung môi được sử dụng để chiết tách là loại sản xuất công nghiệp Được cất lại trước khi sử dụng gồm n-hexan, etyl axetat, diclometan, chloroform, ethanol, metanol

- Các hóa chất chủ yếu là các loại axit: axit clohydric, axit sunfuric…Các chất kiềm như vôi, natri hydroxit, natricacbonat

- Phát hiện vết chất: đèn UV 254 nm và 366 nm, thuốc hiện màu dragendof, xerisunphat + axit sulfuric

3.3 Định lượng Rotundin trong củ Bình vôi tươi bằng sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning)

3.3.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc Rotundin 1 mg/ml: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn Rotundin 99,8% trong bình định mức 10 ml, thêm ethanol 96%, siêu

âm đến khi tan hoàn toàn và định mức đến vạch Các dung dịch chuẩn Rotundin có nồng độ nhỏ hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc trong ethanol 96%

3.3.2 Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác khoảng 5 g củ Bình vôi tươi sau khi thu hái, xác định loài

và giám định tên khoa học, đem thái lát mỏng rồi băm, nghiền nhỏ và ngâm trong 30 ml dung dịch acid sulfuric nồng độ 2% trong 24h Lọc lấy dịch lọc,

bã được chiết như trên thêm 2 lần nữa Gộp dịch chiết, trung hòa bằng dung dịch NaOH 8% đến pH 9 – 10 Lọc thu được tủa alkaloid toàn phần Hòatủa thu được bằng 40 ml ethanol 96%, chuyển dịch chiết ethanol vào bình định mức 50 ml Bổ sung ethanol 96% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45

µm được dung dịch chấm sắc ký

- Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chính xác khoảng 2 mg Rotundin chuẩn

khoảng 200 µg/ml Tiến hành pha loãng bằng ethanol để được các dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 150, 120, 100, 70 và 35 µg/ml

3.3.3 Điều kiện phân tích

Hệ thống sắc ký lớp mỏng CAMAG gồm có máy chấm kính CAMAG – linomat Máy đo mật độ densitometry CAMAG TLC SCANNER 3, được sử

dụng với sự hỗ trợ của phần mềm WinCATS Bản mỏng HP TLC silica gel

60 F254 Merck, kích thước 20 × 10 cm

- Hệ dung môi sắc ký: n-hexan - ethyl acetat (2:1)

- Kích thước vết chấm 8mm, khoảng cách giữa các vết là 2 cm, khoảng cách

từ mép dưới bản mỏng đến vết chấm là 1 cm

- Phát hiện: Đo TLC scanning, hấp thụ =283nm

- Thể tích chấm 10µl; Triển khai sắc ký với hệ dung môi đã được lựa chọn ở trên đến 8,5 cm, lấy bản mỏng ra để khô tự nhiên trong tủ hút, thời gian 15 phút Tiến hành đo scanning ở bước sóng 283nm, tốc độ quét 20 mm/s

Hàm lượng (mg/g) của Rotundin trong mẫu củ Bình vôi tươi được tính theo công thức:

A × X

Hàm lượng (mg/g) = (2)

100

Trong đó: A là hàm lượng (mg/g) Rotundin trong cắn chiết alkaloid toàn phần; X là hiệu suất chiết alkaloid toàn phần từ dược liệu củ Bình vôi (%)

Nhằm so sánh mẫu nghiên cứu với tiêu chuẩn trong Dược điển Việt Nam IV của dược liệu Bình vôi phải chứa ít nhất 0,4% Rotundin tính theo khối lượng dược liệu khô kiệt, chúng tôi đã tiến hành đánh giá độ ẩm của mẫu

củ Bình vôi tươi:

(T-S).100

Độ ẩm (B) % = - (3)

T Trong đó: T là khối lượng mẫu trước khi sấy (g), S là khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

Hàm lượng Rotundin (%) tính theo khối lượng khô kiệt được tính theo công thức:

X là hiệu suất chiết alkaloid toàn phần từ dược liệu củ Bình vôi (%)

3.4 Chiết tách Rotundin từ nguyên liệu củ Bình vôi tươi

* Chiết alkaloid toàn phần từ củ Bình vôi tươi:

ráo nước, sau đó thái lát mỏng và băm nghiề

2SO4 2% (40lít) theo tỉ lệ Thời gian ngâm chiết mỗi lần

là 24 giờ

- ế 1 Lặp lại quá trình chiết

qua túi vải thu được dịch chiết đã lọc

- Kiềm hóa dịch chiết đã lọc ở trên bằng dung dịch NaOH 8% tới pH = 9-10

phần

* Tinh chế Rotundin từ alkaloid toàn phần:

Bột alkaloid toàn phần thu được ở trên đem nghiền thành bột mịn, chiết

lại quá trình chiết 4 lần đến khi dịch lọc thu được không có phản ứng với thuốc thử Dragendoff Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi đến thể tích phù hợp, để lạnh qua đêm thu được tủa Rotundin thô

Rotundin thô được tẩy màu và kết tinh lại hai lầntrong ethanol 95% ở nhiệt độ thường trong 48 giờthu Rotundin độ sạch 98,5%

3.5 Xác định tính chất vật lý và cấu trúc hóa học của Rotundin

Rotundin sau khi tinh chế được xác định tính chất vật lý bằng đo điểm chảy, độ quay cực và cấu trúc được xác định bằng kết hợp các phương pháp phổ cộng hưởng từ một chiều, hai chiều và phổ khối lượng

Dữ kiện phổ của Rotundin (ký hiệu RT1):

- Tinh thể hình kim, màu trắng, tan tốt trong axeton

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định tên khoa học một số loài Bình vôi thu tại một số tỉnh ở Việt Nam

Chúng tôi đã tiến hành điều tra và thu mẫu loài Bình vôi ở một số tỉnh Việt Nam như Hà Giang, Sơn La, Cao Bằng, Lào Cai, Quảng Ninh, Hòa Bình

và tại Tây Nguyên Chúng tôi đã thu được tổng số 9 mẫuBình vôi Sau khi tiến hành giám định và nhờ thêm các chuyên gia về Bình vôi như TS Nguyễn Quốc Huy – Trường Đại học Dược Hà nội và PGS.TS Vũ Xuân Phương – Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, sơ bộ bước đầu chúng tôi đã xác định được tên khoa học của 4 loài như sau:

4.1.1 Stephania sinica Diels thu hái tại Tây nguyên (ký hiệu BV-TN)

Đặc điểm: Cây thân leo, rụng lá hàng năm Cành non màu xanh lá nhạt, khi già chuyển sang màu xanh lá sẫm Phần gốc cành hơi hóa gỗ Toàn cây không lông Rễ phình thành củ to, hình tròn hoặc elip, hơn 1/2 củ hoặc toàn củ mọc nổi trên mặt đất, màu xám hoặc màu đất, vỏ có rất nhiều nốt sần tròn nhỏ, ruột củ màu vàng Lá có cuống lá thường bằng phiến lá, khoảng 5 - 15cm Gốc cuống lá phình to ra, cuống lá đính vào 1/5 - 1/3 chiều dài của lá Phiến lá mỏng, hình tam giác tròn, có chóp lá nhọn, mép nguyên Mặt trên lá màu xanh lục, mặt dưới màu xanh lam với 9 - 1 1 gân nổi rõ, tỏa đều xuất phát từ đỉnh cuống lá

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa mọc ở nách lá Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cuống cụm hoa dài 4 - 9 cm Tán 1 gồm 7-10 cụm hoa nhỏ, cuống mỗi cụm hoa nhỏ dài 1 - 3 cm Tán 2 cũng gồm 7-10 hoa, cuống mỗi hoa dài 2 - 4 mm Lá bắc màu xanh lá nhạt Hoa đực: đài 6, xếp thành 2 vòng 3 so le nhau, hình mũi mác rộng, đài màu xanh lá đậm dần từ ngoài vào trong, ở giữa lá đài có nhiều chấm màu xanh đậm, 2 bên mép lá uốn ra ngoài khoảng 60 độ Cánh hoa 3 màu cam, mép trên màu cam rất nhạt, hình

tim tròn, xếp sít nhau Toàn bộ mép cánh hoa uốn cong vào trong Mặt trong cánh hoa cũng có 2 tuyến màu cam nổi rõ Bộ nhị dính liền thành 1 trụ với 6 bao phấn xếp liền thành hình đĩa Cụm hoa cái dạng xim tán kép gần dạng đầu, cuống cụm hoa dài 3 - 7 cm Tán sơ cấpgồm 1 1 - 1 2 cụm hoa nhỏ, cuống mỗi cụm hoa nhỏ dài 3 - 5 mm Tán thứ cấpgồm 10 hoa, cuống mỗi hoa dài 1 - 2 mm Có 3 lớp lá bắc màu xanh mép ngoài trong suốt mọc ở nách cuống tán 1, ờ giữa cuống tán 2, ở nách cuống mỗi hoa Hoa cái có đài và tòng nằm về 1 phía; đài 1, màu xanh hơi vàng, hình mác dài, mép đài hơi uốn ra ngoài Cánh hoa 2 màu cam, dày mọng, hình tim tròn, toàn bộ mép cánh hoa uốn vào trong Mặt trong cánh hoa có 2 tuyến lớn nổi lên rõ cùng màu cánh hoa Bầu hình trứng, bầu trên, 1 lá noãn, núm nhụy có 7 - 11 thùy dạng gai nhỏ Quả hạch hình trứng ngược, khi chín có màu đỏ Hạt hình móng ngựa, có 5 hàng gai nhọn gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gai gồm 12 - 14 gai nhỏ Giá noãn có 1 lỗ hình bầu dục ở giữa Mùa hoa: tháng 1 - 4 Mùa quả: tháng 4 - 6 Cây thường mọc trong các hốc đá, ở rừng cây nhỏ

Hình 4.1: Hình ảnh lá của S sinica

Diels

Hình 4.2: Hình ảnh củ của S sinica

Diels

4.1.2 Stephania epigaea H S Lo thu hái tại Hòa Bình (ký hiệu BV-HB)

Đặc điểm: Dây leo thân thảo rụng lá, thân nhẵn Rễ củ lớn thường dẹt có màu đen, nâu xám Cành non màu đỏ tía, xanh lam, có đường gân khi khô Cuống lá dài 4- 6 (-11) cm; là hình khiên, từ cuống đến mép lá dài 1- 2 cm, kích thước 3-5(-7) × 5-6.5(-9) cm, hóa màng khi khô, mặt dưới của lá màu hơi xanh lam, cơ bản là hình tròn, đuôi tròn hoặc thỉnh thoảng nhọn, có 8 hoặc 9 gân lá Hoa đơn tính, mọc ở kẽ lá, cụm hoa có 2 hoặc 3 (-7) hoa Hoa đực: có 6 lá đài, màu tím, hình ô van hoặc ô van - elip, dài 1.3 – 1.6 mm, cánh hoa có 3 hoặc thường 5 hoặc 6, màu tím hoặc màu cam có những chấm đỏ, dày 0.4 – 0.7 mm Cụm hoa cái cũng giống như hoa đực nhưng dày hơn; cuống dài 1-3 cm Cuống quả thì ngắn và có thịt Hạch quả màu đỏ, quả hình trứng Ra hoa vào mùa xuân và có quả vào mùa hè

Hình 4.3: Hình ảnh lá của

Stephaniaepigaea H S Lo

Hình 4.4: Hình ảnh hạt của

Stephaniaepigaea H S Lo

4.1.3 Stephania cephalantha Hayata thu hái tại Sơn la (ký hiệu BV-SL)

Đặc điểm: Thân leo, sống nhiều năm Rễ phình to thành củ có dạng gần hình cầu hay hình trụ dài Toàn thân nhẵn Lá mọc cách, phiến lá gần hình trứng tròn, hình khiên tròn đến hình tam giác tròn, dài 5-11 cm, rộng 4-8 cm; chóp lá hơinhọn hoặc gần như tròn; gốc lá tròn hoặc bằng; gân chính 9-11, dạng chân vịt; cuống lá dài 5-10 cm.Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa mọc từ nách lá; các cụm hoa đực và cái đều có dạng hình đầu, do nhiều xim tán có cuống rất ngắn tạo thành; cuống cụm hoa dài 1-2(-5) cm, đỉnh cuống cụm hoa