Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi

Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI %$* »9^ «ỉ« «9^ mỊ^ «2^ «Ỹ^ %f^ »$4 «1^ •Ị^ •ĩ^ *31^ •ĩ^ •ậ^ TRẦN THỊ THU TRANG XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMIKACIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTƠ TÁN XẠ BAY HƠI (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHOÁ 2000- 2005) ^? ĩffiỂ àỉáư íẩn ạ. : Th.s Nguyễn Thị Kiều Anh Th.s Nguyễn Tuấn Anh * 9 ^ iA ự ie /ù ẹ ft : Phòng Đông Dược- Viện Kiểm Nghiệm Q X ià ỉạ ừ ín . ¿AạHe A iên. : Tháng 3- 5/ 2005 Hà Nội- 5/ 2005 N ' r j • A D + 3 /^ i’ ■ e Ầ m y i M Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Thị Kiều Anh, Thạc sĩ Nguyễn Tuấn Anh , người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Đông Dược- Viện Kiểm Nghiệm, các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá Phân Tích - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và giúp đỡ em trong thời gian học tập tại nhà trường. Em xỉn chân thành cảm ơn ! s v : Trần Thị Thu Trang Trang ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 Phần 1: TỒNG QUAN 1.1 Đại cương về amikacin Sulfat 3 1.2 Một số phương pháp định lượng amikacin 4 1.3 Phương pháp khảo sát trong khóa luận 9 Phần 2: ĐÔÌ TƯỢNG, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 2.1. Dụng cụ hoá chất và đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1. Dụng cụ và hoá chất 17 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu . 18 2.3.J Chuẩn bị mẫu phân tích 18 2.3.2 Điều kiện định lượng 19 23.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 19 Phần 3: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 21 3.2. Thẩm định phương pháp định lượng amikacin 27 3.3.1. Độ chọn lọc 27 3.3.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 28 3.3.3. Độ chính xác của phương pháp 30 3.3.4. Độ đúng của phương pháp 30 3.4. ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng amikacin trong chế phẩm 31 Phần 4: KÊT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC NHữ^G CHỮVIẾT TẮT AMK : Amikacin sulfat ELSD : Detectơ tán xạ bay hơi ( Evaporative Light- Scattering Detector) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High- Performance Liquid Chromatography) IS : Chuẩn nội ( Internal Standard) MeOH : Methanol SKS : SỐ kiểm soát Ký hiệu Nội dung Trang Bảng 1 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký 27 Bảng 2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 29 Bảng 3 Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp 30 Bảng 4 1 I Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 31 Báng 5 Kết quả định lượng amikacin Sulfat trong chế phẩm 31 1 . . 1 DANH MỤC CÁC HÌNH Ký hiệu Nội dung Trang Hình 1 Sắc ký đồ phân tích AMK với pha động có muối amonifomat 21 Hình 2 Sắc ký đồ thu được khi pha động là hệ 1 (a) và hệ 2 (b) 22 Hình 3 Sắc ký đồ thu được khi pha động là hệ 3 (a), hệ 4 (b), hệ 5 (c) 23 Hình 4 1 Sắc đồ thu được khi tốc độ dòng 0,5 ml/phút (a); 0,8 ml/ phút (b); 1 ml/ phút (c) 24 Hình 5 Sắc ký đồ thu được khi tốc độ dòng khí là 1,8 1/ phút (a) và 2 1/ phút (b) 25 Hình 6 Sắc ký đồ thu được khi đặt nhiệt độ detectơ 100°c (a) và 105"C (b) 25 Hình 7 Sắc ký đồ minh hoạ xác định sự phù hợp của hệ thống sắc ký 26 Hình 8 Sắc ký đồ (a):mẫu trắng; (b): mẫu trắng thêm chuẩn nội; (c): mẫu chuẩn AMK có thêm chuẩn nội 28 Hình 9 Đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ số diện tích pic AMK/ IS vào nồng độ AMK 29 ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay trên thị trường các chế phẩm kháng sinh rất phong phú và đa dạng. Aminoglycosid là nhóm kháng sinh lớn, rất có hiệu quả trong điều trị, đặc biệt với các nhiễm khuẩn nặng. Là một kháng sinh trong họ, amikacin được chỉ định trong các trường hợp như; nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm phổi Với kháng sinh aminoglycosid, phương pháp vi sinh được sử dụng phổ biến trong kiểm nghiệm, tuy nhiên phương pháp này gặp phải một số hạn chế: tốn nhiều thời gian, độ chính xác chưa thật cao, không có khả năng định tính và đặc biệt khó khăn khi định lượng chế phẩm kháng sinh là hỗn hợp nhiều thành phần. Để khắc phục hạn chế này, một số các phưofng pháp phân tích hiện đại đã được ứng dụng như: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp điện di mao quản (EC) hay phưoỉng pháp sắc ký lófp mỏng Tuy nhiên, do đặc điểm cấu tạo phân tử: không có khả năng hấp thụ tử ngoại hoặc phát huỳnh quang, cho nên muốn sử dụng được các detectơ thông thường (huỳnh quang, UV- VIS ) thì kháng sinh aminoglycosid cần phải được dẫn xuất hoá trước cột hoặc sau cột. Kỹ thuật này phức tạp, quá trình phân tích trải qua nhiều giai đoạn và môi trường độc hại Do đó việc xây dựng một phương pháp định lượng trực tiếp là cần thiết. Detectơ tán xạ bay hơi (ELSD) phát hiện các chất trực tiếp, dựa trên nguyên tắc: tiểu phân chất phân tích ít bay hơi hơn pha động tán xạ ánh sáng lase và cho các đáp ứng khác nhau, ứng dụng ELSD trong hệ thống HPLC để xây dựng một phương pháp mới có khả năng định lượng các aminoglycosid nhanh, trực tiếp, kỹ thuật đơn giản và có độ chính xác đảm bảo, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Xây dựng phương pháp định lượng amikacỉn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tán xạ bay hơi". * Đề tài được tiến hành với mục tiêu: • Xây dựng phương pháp định lượng amikacin bằng HPLC với ELSD • ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng amikacin trong chế phẩm. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ AMIKACIN SULFAT: [1], [8], [13] Công thức: HO. /—0 H2N, Ấ ì HO T 0 HN /— 0, Òh V-<.' h 'oh / o H XHO { ) 0H V (C22H 43N50i 3 ),2 H 2 S 0 4 Tên khoa học. 6-0-(3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-4-0-(6-amino-6-deoxy-a-D- glucopyranosyl)-1-A/-[(2S)-4-amino-2-hydroxybutanoyl]-2-deoxy-D-streptannine sulphate Tên chung quốc tê: Amikacin Sulfat Tính chất lý hoá: Amikacin S u lfa t dạng bột kết tinh trắng tan tốt trong nước, khó tan trong alcol và aceton. Không có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại. Dược lý và cơ chế tác dụng: Amikacin là một kháng sinh bán tổng hợp. Thuốc diệt khuẩn nhanh do gắn hẳn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom và ngăn chặn sự tổng hợp protein của vi khuẩn. Thuốc có tác dụng mạnh trên các vi khuẩn gram âm đặc biệt các trực khuẩn ưa khí và tác dụng được trên một số vi khuẩn gram dương ( s. pneumoniae, s. pyogenes ). Chỉ định: Amikacin được chỉ định để điều trị nhiễm khuẩn nặng đe doạ lính mạng, đặc biệt chưa biết nguyên nhân hoặc nhiễm khuẩn nghi do vi khuẩn gram âm. Có hiệu quả tốt trong điều trị nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn tiết niêu Liều dùng: Người lớn, trẻ em có có chức năng thận bình thường: 15 mg/kg/ngày, tiêm bắp, truyền tĩnh mạch, tiêm dưới da 1- 2 lần/ ngày. Không tiêm tĩnh mạch trực tiếp. Dạng thuốc: Lọ dung dịch tiêm amikacin Sulfat; lọ bột đông khô kèm nước cất pha tiêm. Một số biệt dược: Amikacin; Amikaye (Hàn quốc); Amikacin Sulfat; Opekacin (Mỹ); Amiklin (Pháp); Licacin (Italia); Opekalin (Hồng kông) 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMIKACIN Trong dược điển Anh, Mỹ, Trung Quốc, và các tài liệu khác đã công bố một số phương pháp được áp dụng để định lượng AMK. 1.2.1. Phương pháp vi sinh: [17] Nguyên tắc: AMK khuếch tán vào môi trưòfng dinh dưỡng đặc đã cấy vi sinh vật chỉ thị, tạo ra các vòng ức chế vi sinh vật có đưòfng kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tưoỉng ứng. Hoạt lực của chất thử được so sánh với chất chuẩn theo phương pháp thống kê. Các điều kiện định lượng: Chủng thử: Bacillus subtilis Môi trường: Pepton 5 g Cao thịt bò 3 g K2HPO4 3g Thạch 15- 20 g Nước 1000 ml pH= 7,8- 8,0 Nồng độ amikacin Sulfat định lượng; 0,9- 4,5 lư / ml Điều kiện ủ: Nhiệt độ: 35- 37 °c Thời gian: 14- 16 giờ Phương pháp này có thời gian phân tích dài, độ chính xác chưa thật cao. Gần đây phương pháp HPLC, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), điện di mao quản (CE) được nghiên cứu ứng dụng như một công cụ hiệu quả nhằm rút ngắn thời gian phân tích cũng như có thể định tính, định lượng các chế phẩm là hỗn hợp nhiều thành phần. Trong đó HPLC là phương pháp sử dụng rộng rãi hơn cả. 1.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC): [7] Các tác giả ứng dụng kỹ thuật HPTLC để định lượng AMK với các điều kiện sau: Dung dịch AMK 1 mg/ ml được chấm lên bản mỏng silicagel 6OF254 (dùng cho HPTLC) Dung môi triển khai: CH3OH: 25%NH3: cnc\,= 5: 5: 1 Dung dịch phát hiện: 0,5% Ninhydrin trong n- butanol Kết quả định lượng được tính toán dựa trên mật độ vết đo ở bước sóng 498 nm. Với khoảng tuyến tính 500- 3000 ng/ ụl. 1.2.4 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detectơ huỳnh quang: [15] AMK trong huyết tương sau khi xử lý được dẫn xuất hoá với thuốc thử 1- methoxycarbonyl- indolizine- 3,5- dicarbaldehyde 15 phút trong bóng tối. Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng điện di mao quản điện động mixen ( MEKC) trong ống mao quản ( 75 cm X 50 ụm), ở nhiệt độ 40 “c, và đặt điện thế 30 kv. Pha động: 40 nM- sodium dodecyl sulfat trong 20 nM đệm phosphat- borat pH= 7. Detectơ huỳnh quang: bước sóng phát xạ 482 nm, bước sóng kích thích 414 nm. [...]...1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong dược điển Anh, Mỹ cũng như một số tài liệu tham khảo khác đã sử dụng hệ thống HPLC để định lượng AMK với các detectơ thích hợp khác nhau Một số các chương trình sắc ký đã được áp dụng aJ Phương pháp HPLC với detectơ điện hoá: [20] Theo dược điển Mỹ 27, AMK được định lượng bằng phương pháp HPLC dựa trên các điều kiện: Cột: 250 X 4 mm với chất nhồi... khả năng phát xạ do đó cần phải tiến hành dẫn xuất hoá Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành triển khai một phương pháp mới sử dụng detectơ tán xạ bay hơi- có khả năng phát hiện trực tiếp các chất ít bay hơi hơn pha động, không dựa trên đặc tính quang học của chất phân tích, thích hợp cho định lượng kháng sinh aminoglycosid Trên cơ sở đó xây dựng phương pháp định lượng AMK bằng HPLC với ELSD 1.3 PHƯƠNG... cho thấy phương pháp có độ đúng đảm bảo 3.3 ứng dụng phương pháp đă xây dựng để định lượng amỉkacỉn trong chế phẩm Áp dụng phương pháp đã xây dựng, chúng tôi tiến hành định lượng chế phẩm chứa AMK có trên thị trường Kết quả trình bày trong bảng 5: Bảng 5 : Kết quả định lượng amikacin Sulfat trong chế phẩm Ị Kết quả % so với Tên mẫu SKS Nơi sản xuất Amikacin 402001 IL.Dong pharm.Co., LTD 93,30 Amikacin. .. với ELSD 1.3 PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TRONG KHOÁ LUẬN 1.3.1 Khái quát về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):[2], [3], [4], [5], [20] Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý dùng để tách, định tính, định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn vào nhau: Pha tĩnh (nhồi trong cột sắc ký) và pha động (dung... Như đã trình bày ở trên, với hoạt chất amikacin, có rất nhiều phương pháp định lượng đã được nghiên cứu dùng HPLC với các detectơ: điện hoá, huỳnh quang hay u v Mỗi phương pháp đều có những điểm ưu việt nhất định, trong nghiên cứu này chúng tôi muốn trình bày một phương pháp mới nhằm mở rộng hơn nữa phạm vi ứng dụng của HPLC, đồng thời cung cấp một phương pháp định lượng AMK với thời gian phân tích... quả tin cậy: Phương pháp HPLC với detectơ tán xạ bay hơi * Detect tán xạ bay hơi ( Evaporatỉve Light Scatterìng Detector ): [6]; [10]; [14]; [16] ELSD mới được đưa vào sử dụng ở Việt Nam dùng để phát hiện các chất không hấp thụ ánh sáng tử ngoại Pha động chứa chất phân tích được mù hoá cùng với khí trơ và được bay hơi trong ống gia nhiệt Các tiểu phân chất phân tích được phát hiện do tán xạ ánh sáng... loại detecto như: detectơ UV- VIS , detectơ điện hóa, detectơ huỳnh quang, detectơ tán xạ bay hơi (ELSD), detectơ khúc xạ ánh sáng Hiện nay phương pháp HPLC được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong phân tích dược phẩm Là thiết bị dùng đ định tính, địnhlượng đồng thời nhiều chất cho kết quả có độ tin cậy cao Tuỳtheo đặc tính của chất phân tích, hệ thống HPLC sẽ được kết nối với các detectơ thích hợp Như... sự ổn định của hệ thống sắc ký * Thẩm định phương pháp định lượng amỉkacỉn t* * Khảo sát độ chọn lọc * Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ AMK và tỷ lệ diện tích pic AMK/IS * Khảo sát độ chính xác của phương pháp * Khảo sát độ đúng của phương pháp Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính Tiến hành sắc ký mẫu thử song song với mẫu chuẩn theo chương... thử song song với mẫu chuẩn theo chương trình đã chọn 2.2.2 ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng amikacin trong chê phẩm Để đảm bảo cho quá trình định lượng giảm thiểu các sai số chúng tôi sử dụng phương pháp định lượng dùng chuẩn nội ở đây tobramycin Sulfat được lựa chọn do đáp ứng được các yêu cầu: trong cùng điều kiện sắc ký amikacin Sulfat và tobramycin Sulfat có thời gian lưu thích hợp, hai... trên sắc ký đồ co, 5 0 T= ^ ,0 2 / Với f khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến mép đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao pic; Woo5 là độ rộng pic ở 1/20 chiều cao pic Trong phép định lượng để tính diện tích pic thì T < 2,5 là chấp nhận được 1.3.3 Các phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký: [3] Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của các chất tỷ lệ với