Nghiên cứu xác định glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tái xạ bay hơi (HPLC ELSD)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI HPLC-ELSD Chuyên ngành:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR

TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR

TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN TRUNG DŨNG

NGHỆ AN - 2014

Bản luận văn này được thực hiện tại Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội và hoàn thành tại Trường Đại học Vinh, với sự hướng dẫn của TS Nguyễn Trung Dũng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Trung Dũng, Bộ môn Kỹ thuật Môi trường, Khoa Hóa Lý

kỹ thuật, Học viện Kỹ thuật Quân sự đã giao đề tài cũng như hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện bản luận văn

PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa và PGS.TS Trần Đình Thắng đã

dành nhiều thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn

Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc

Gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài này

ThS Vũ Thị Kim Oanh, ThS.Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh

chị trong labo Hóa độc đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Các thầy, cô giảng dạy tại khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô trong

bộ môn Hóa Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Vinh, tháng 10 năm 2014

Học viên

Lê Thị Dung

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng 3

1.1.1 Định nghĩa thực phẩm chức năng 3

1.1.2 Tên gọi 5

1.1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng 5

1.2 Giới thiệu về glucosamin 8

1.2.1 Cấu tạo, tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8

1.2.2 Quy trình điều chế Glucosamin hydroclorua 10

1.2.3 Tác dụng dược lý của glucosamin 11

1.2.4 Tình hình sử dụng glucosamin trong nước và trên thế giới 12

1.3 Các phương pháp tạo dẫn xuất của glucosamin 15

1.4 Các phương pháp xác định glucosamin 17

1.5 Phương pháp HPLC-ELSD 28

1.5.1 Nguyên tắc hoạt động 28

1.5.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 29

1.6 Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích 32

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 37

2.1.3 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 37

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 44

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 44

2.2.2 Hóa chất 45

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định glucosamin bằng phương pháp

HPLC-ELSD 46

3.1.1 Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 46

3.1.2 Tối ưu hóa detector ELSD 51

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 56

3.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 56

3.2.2 Xác định khoảng tuyến tính và lập phương trình đường chuẩn 58

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 59

3.2.4 Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp 60

3.3 Kết quả phân tích một số mẫu thực 62

KẾT LUẬN 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 70

Bảng 1.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống 6

Bảng 1.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc 7

Bảng 1.3 Cấu tạo và tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8

Bảng 1.4 Các phương pháp xác định glucosamin 18

Bảng 3.1 Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng 47

Bảng 3.2 Khảo sát chương trình gradient 49

Bảng 3.3 Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi 52

Bảng 3.4 Khảo sát tốc độ dòng khí mang 54

Bảng 3.5 Các điều kiện tối ưu xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC-ELSD 56

Bảng 3.6 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57

Bảng 3.7 Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ glucosamin 58

Bảng 3.8 Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang cứng 60

Bảng 3.9 Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang dầu 60

Bảng 3.10 Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang mềm 61

Bảng 3.11 Kết quả xác định chuẩn Fisher của 2 phương pháp HPLC ELSD và AOAC 2005.01 61

Bảng 3.12 So sánh hai phương pháp HPLC-ELSD và phương pháp tiêu chuẩn OAC 2005.01 62

Bảng 3.13 Kết quả phân tích glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng 63

Hình 1.1 Các dạng cấu trúc hóa học của glucosamin 9

Hình 1.2 Bệnh thoái hóa khớp ở người 11

Hình 1.3 Một số thực phẩm chức năng có chứa glucosamin 15

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 29

Hình 1.5 Cấu tạo của detector ELSD 31

Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu không chứa chất béo 39

Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu chứa chất béo 40

Hình 2.3 Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC2005.01 đối với mẫu không chứa béo 41

Hình 2.4 Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01 đối với mẫu chứa béo 42

Hình 2.5 Hệ thống máy UPLC Acquity (Waters, Mỹ) 44

Hình 3.1 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=20:80 47

Hình 3.2 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=25:75 47

Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=30:70 48

Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn glucosamin 1300ppm sử dụng pha động H2O:ACN=40:60 48

Hình 3.5 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O: ACN theo chương trình gradient 1 50

Hình 3.6 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O:ACN theo chương trình gradient 2 50

Hình 3.7 Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O:ACN theo chương trình gradient 3 50

động H2O:ACN theo chương trình gradient 4 51Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nhiệt độ

ống hóa hơi 53Hình 3.10 Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, nhiệt độ

ống bay hơi 55oC 53Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ

dòng khí mang N2 55Hình 3.12 Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, tốc độ

dòng khí mang 30psi 55Hình 3.13 Sắc đồ glucosamin đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57Hình 3.14 Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ

glucosamin từ 5,2mg/ml đến 26,0 mg/ml 58

Hình 3.15 Sắc đồ của glucosamin tại giới hạn phát hiện 59

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

pha đảo

ICH International Conference on Harmonization Hội đồng hòa hợp quốc tế

về xương khớp

Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng

để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể con người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật Một số nhà kinh doanh và sản xuất đã lợi dụng lòng tin của người tiêu dùng nên đã thổi phồng quá mức tác dụng của thực phẩm chức năng khiến không ít người coi thực phẩm chức năng như là “thần dược” chữa bách bệnh

Glucosamin là một amino-mono-saccharid có nguồn gốc nội sinh, giúp tổng hợp glycosaminoglycan cấu tạo nên mô sụn trong cơ thể Có 3 dạng glucosamin dùng trong điều trị là glucosamin sulfat, glucosamin hydroclorua

và N-Acetylglucosamin, trong đó dạng muối sulfat được cho là dễ hấp thu, dung nạp tốt nhất và cho hiệu quả nhất trong điều trị

Tuy nhiên, vì tác dụng của nó đối với cơ thể con người mà và đặc biệt

là lợi nhuận, các nhà sản xuất kinh doanh có thể gian lận, bổ sung glucosamin vào trong thực phẩm chức năng nhằm kích thích tác dụng nhanh chóng của

sản phẩm mà không quan tâm tới tác hại, tác dụng phụ của nó khi dùng lâu dài và sai mục đích Do đó, để góp phần giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ quan chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm, nhất là đối với thực phẩm chức năng, cần phải có một phương pháp phân tích phù hợp để xác định hàm lượng glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng có mặt trên thị trường

Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định glucosamin trong các đối tượng khác nhau (thực phẩm chức năng, thuốc, chitosan, chitin, dung dịch sinh học…) bằng nhiều kỹ thuật hiện đại như: sắc ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các detector khác nhau (HPLC - RID, UV, PDA,

FD, MS/MS) Tuy nhiên, nhược điểm chung của các phương pháp này trước khi phân tích phải tiến hành tạo dẫn xuất với một thuốc thử thích hợp, quá trình tạo dẫn xuất phức tạp và kéo dài, xảy ra nhiều quá trình phụ, làm tăng

thời gian phân tích Từ những lý do trên chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xác định Glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD)”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng

1.1.1 Định nghĩa thực phẩm chức năng

Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ

về thực phẩm chức năng (TPCN), mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng Mặc dù thuật ngữ “Thực phẩm chức năng”, chưa có một định nghĩa thống nhất quốc tế, nhưng được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Gần đây các định nghĩa về thực phẩm chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau

Khái niệm Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật

sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khỏe cho người sử dụng [18, 31]

Các nước châu Âu, Mỹ, Nhật đưa ra định nghĩa thực phẩm chức năng

là một loại thực phẩm ngoài 2 chức năng truyền thống là: cung cấp các chất dinh dưỡng và thoả mãn nhu cầu cảm quan, còn có chức năng thứ 3 được chứng minh bằng các công trình nghiên cứu khoa học như tác dụng giảm cholesterol, giảm huyết áp, chống táo bón, cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột…

Hiệp Hội thực phẩm sức khoẻ và dinh dưỡng thuộc Bộ Y tế Nhật Bản định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm bổ sung một số thành phần

có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần bất lợi Việc bổ sung hay loại bỏ phải được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học và được Bộ Y tế cho phép xác định hiệu quả của thực phẩm đối với sức khoẻ”

Viện Y học thuộc viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Mĩ, định nghĩa

“Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến nhiều lợi ích cho sức khoẻ, là bất cứ thực phẩm nào được thay đổi thành phần qua chế biến hoặc có các

thành phần của thực phẩm có lợi cho sức khoẻ ngoài thành phần dinh dưỡng truyền thống của nó”

Theo Viện khoa học và đời sống quốc tế (ILSI) thì thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi hay có hại, cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể, như cải thiện tình trạng sức khỏe và làm giảm nguy cơ măc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại

Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC) cho rằng “Thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khỏe nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản” [18, 31]

Tại Việt Nam, thông tư số 08/TT-BYT ngày 23-8-2004 của Bộ Y tế quy định: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm để hỗ trợ các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh”

Theo Dự thảo 15, ngày 19/11/2012 của Bộ Y tế Việt Nam, thông tư “Hướng dẫn quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” thì “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, thực phẩm dinh dưỡng y học”

Như vậy, có rất nhiều các định nghĩa về thực phẩm chức năng, song tất

cả đều thống nhất: Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm nằm giới hạn giữa thực phẩm (truyền thống - Food) và thuốc (Drug) Thực phẩm chức năng thuộc khoảng giao thoa (còn gọi là vùng xám) giữa thực phẩm và thuốc Vì thế người ta còn gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm - thuốc (Food-Drug)

Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: “Thực phẩm chức năng (TPCN) là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật”

Tùy theo công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi khác như: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, sản phẩm dinh dưỡng

y học

1.1.2 Tên gọi

TPCN tuỳ theo công dụng, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng,

có các tên gọi khác nhau:

+ Việt Nam và nhiều nước khác (như Nhật Bản, Hàn Quốc ):

(1) Thực phẩm chức năng-Functional foods

(2) Thực phẩm bổ sung (vitamin vа khoáng chất) - Food Supplement (3) Sản phẩm bảo vệ sức khoẻ - Health Produce

(4) Thực phẩm đặc biệt - Food for Special use

(5) Sản phẩm dinh dưỡng y học - Medical Supplement

+ Mỹ: Dietary Supplement (thực phẩm bổ sung) và Medical Supplement (thực phẩm y học hay thực phẩm điều trị)

+ EU: Thực phẩm bổ sung (giống như thuật ngữ Dietary Supplement của Mỹ) hoặc thực phẩm thuốc (Nutraceuticals)

+ Trung Quốc: Sản phẩm bảo vệ sức khoẻ hay được dịch nguyên bản là Thực phẩm vệ sinh Chức năng của các sản phẩm nаy rất rộng, bao gồm cả Dietary Supplement (Thực phẩm bổ sung) và Medical Supplement (Thực phẩm y học hay Thực phẩm điều trị)

1.1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng

1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống

Bảng 1.1 Phân biệt thực phẩm chức năng

và thực phẩm truyền thống [18, 32]

- Cung cấp các chất dinh dưỡng

- Thỏa mãn về nhu cầu cảm quan

- Cung cấp các chất dinh dưỡng

- Chức năng cảm quan

- Lợi ích vượt trội về sức khỏe (giảm cholesterol, giảm HA, chống táo bón, cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột…)

Chế biến theo công thức thô (không loại bỏ được chất bất lợi)

Chế biến theo công thức tinh (bổ sung thành phần

có lợi, loại bỏ thành phần bất lợi) được chứng minh khoa học và cho phép của

cơ quan quản lý ATTP (VFA)

3 Tác dụng tạo năng

- Mọi đối tượng

- Có định hướng cho các đối tượng: Người già, trẻ

- Hoạt chất, chất chiết từ thực vật, động vật và vi sinh vật (nguồn gốc tự nhiên)

1.1.3.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc

Bảng 1.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc [33]

1 Định nghĩa

Sản phẩm dùng để hỗ trợ các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có hoặc không tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ bệnh tật

Là chất hoặc hỗn hợp chất dùng cho người nhằm mục đích phòng bệnh, chữa bệnh, chẩn đoán bệnh hoặc điều trị chức năng sinh lý cơ thể, bao gồm thuốc thành phẩm, nguyên liệu làm thuốc, vaccine, sinh phẩm y tế, trừ TPCN (luật Dược 2005)

- Phải có chỉ định, kê đơn của bác sĩ

- Từng đợt

- Dễ có biến chứng, tác dụng phụ, tai biến

- Dễ tác dụng âm tính

- Tổng hợp

1.2 Giới thiệu về glucosamin

1.2.1 Cấu tạo, tính chất các dạng tồn tại của glucosamin

Bảng 1.3 Cấu tạo và tính chất các dạng tồn tại của glucosamin [22, 34]

Điểm nóng chảy:

88oC Điểm sôi: 150oC

pKa: 12,27

pKb:1,72 Tan được trong nước

và trong methanol sôi,

ở điều kiện thường tan ít trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform

300oC Tan được trong nước 0,1g/ml

3

Glucosamin sulfat

Tên khoa

học:2-amino-2-deoxy- glucose sulfat;

D-glucosamin sulfat

C6H13O5N.H2SO4; 277,24

Hình 1.1 Các dạng cấu trúc hóa học của glucosamin

Một số phản ứng của glucosamin:

Phản ứng tráng bạc:

- 100oC trong thời gian 6,5 giờ Tẩy màu rửa sạch, sấy khô Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 100oC trong thời gian 4 giờ Lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 2oC trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sấy khô ở 50 - 60oC.[3, 34]

Quy trình 2:

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô Khử hoàn toàn protein trong

NaOH 5%, đun sôi Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô Chitin thu được

có màu trắng phớt hồng Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 100oC, tẩy màu băng than hoạt tính, để kết tinh và lọc Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng Hiệu suất quá trình 51,4%.[3, 34]

1.2.3 Tác dụng dược lý của glucosamin

Glucosamin, một đường amino, là tiền chất trong quá trình tổng hợp sinh hoá để tạo ra proteoglycan và collagen, đây là những chất cơ bản kích thích quá trình tạo sụn ở khớp Glucosamin đồng thời ức chế enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxide phá hủy các tế bào sụn Nhờ tác dụng của glucosamin trên sự chuyển hoá sụn, nó có thể giúp cho cơ thể hồi phục lại sụn bị tổn thương hay

bị ăn mòn Ngoài ra glucosamin còn kích thích sinh mô liên kết của xương, giảm triệu chứng mất calci ở xương, làm tăng sản sinh chất nhầy ở dịch khớp

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch nhớt nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh phát triển Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bênh viêm khớp xương phát triển (hình 1.2).[2, 22]

Hình 1.2 Bệnh thoái hóa khớp ở người

 Tác dụng dược động học của glucosamin

Glucosamin sulfat được hấp thụ hoàn toàn sau khi uống (qua nghiên cứu cho thấy thuốc được hấp thu 90-98%), khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit clohydric (pH = 1-3) sẵn có trong dạ dày Glucosamin nhanh chóng khuếch tán vào mô và kết hợp với protein huyết thanh và những cấu trúc sinh học của

cơ thể Nồng độ cực đại của glucosamin trong huyết tương có thể đạt đến sau

8 đến 10 giờ Gan, thận, sụn, khớp là những nơi tập trung glucosamin cao nhất Tại gan, glucosamin tham gia các chuyển hóa dưới tác dụng của các enzyme khác nhau Tại đây một phần glucosamin bị chuyển hóa thành những sản phẩm chuyển hóa nhỏ hơn, cuối cùng là CO2 (bài tiết qua đường hô hấp), nước và urê Khoảng 28% lượng glucosamin đã dùng được tìm thấy trong nước tiểu của người sau 120 giờ và ít hơn 1% được tìm thấy trong phân [19 ]

1.2.4 Tình hình sử dụng glucosamin trong nước và trên thế giới

Glucosamin (2-amino-2-deoxy-d-glucose) là một amino-mono-saccharid

có nguồn gốc nội sinh, giúp tổng hợp glycosaminoglycan cấu tạo nên mô sụn trong cơ thể Glucosamin được xem như là một chất bổ sung dinh dưỡng trong các thuốc Các viên bổ sung glucosamin được sản xuất trong các phòng thí nhiệm từ chitin, một chất được tìm thấy trong vỏ của tôm, cua, tôm hùm và các sinh vật biển khác Ngoài bổ sung dinh dưỡng ra, glucosamin còn được sử dụng cho thức uống trong thể thao và mĩ phẩm Glucosamin thường kết hợp với chondrotin sulfate, một phân tử cũng hiện diện tự nhiên trong các sụn

Từ năm 1994, glucosamin sulfat đã được dùng trong điều trị thoái hóa khớp Trên thế giới, có khoảng 70 quốc gia công nhận glucosamin là thuốc điều trị thoái hóa khớp Tuy nhiên, ở Mỹ và nhiều Quốc gia, glucosamin chưa được công nhận là thuốc, chỉ được công nhận là thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị thoái hóa khớp

Có 3 dạng glucosamin dùng trong điều trị là glucosamin sulfat, glucosamin hydroclorua và N-Acetylglucosamin, trong đó dạng muối sulfat được cho là dễ hấp thu, dung nạp tốt nhất và cho hiệu quả nhất trong điều trị Dạng thường gặp của glucosamin trong thực phẩm chức năng hoặc trong chế phẩm dược thường là dạng đơn hoặc ở dạng kết hợp với chondroitin [22, 23]

Glucosamin sulfat hiện đang có các dạng: thuốc viên 250mg, bột pha uống 1,5gam, thuốc tiêm 400mg/3ml và viên thuốc sủi Thuốc thường được dùng trong điều trị thoái hóa khớp gối, háng, tay, cột sống, vai, trong viêm quanh khớp, loãng xương, gãy xương, teo khớp, viêm khớp cấp và mạn tính Uống thuốc 15 phút trước bữa ăn, thuốc không gây rối loạn dạ dày, ruột

Vì có bản chất tự nhiên nên glucosamin ít gây dị ứng và độc hại, không gây rối loạn tiêu hoá và có thể điều trị lâu dài Liều khuyến cáo là 1250 mg đến 1500 mg glucosamin/ngày, chia làm 3 lần Ngoài ra, nếu kết hợp với chondroitin thì liều được khuyên dùng là 1200mg chia 3 lần/ngày Thời gian dùng tùy theo chủ thể, ít nhất dùng liên tục trong 2 đến 3 tháng để đảm bảo hiệu quả điều trị Thuốc không được dùng (chống chỉ định) trong trường hợp

dị ứng với glucosamin sulfat Thận trọng dùng cho phụ nữ có thai và người đái tháo đường vì thử nghiệm trên động vật có biểu hiện làm gia tăng đề kháng insulin [9]

Glucosamin tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, cấu trúc sụn khớp Từ tuổi 45 - 50 trở lên bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60-70, 45% ở tuổi 80) Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hóa, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp Tuy nhiên, theo nghiên cứu của tiến sĩ Ronal

Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ ko có hiệu quả chống đau Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều

Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID Nhược điểm của NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ Một vài dị ứng không đáng

kể với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc

Đã có nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [23]:

 Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài

 Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID

 Người ta dùng phối hợp glucosamin và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn

 Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngừng thuốc Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài nhiều tháng sau này

 Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy

Hiện nay tại Việt Nam, chúng ta đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như: Lubrex, Lubrex-F, Glusivac, thực phẩm chức năng chứa glucosamin của các thương hiệu nổi tiếng như Schiff (Mỹ), Kirkland, Amway, Schitton… (hình 1.3)

Hình 1.3 Một số thực phẩm chức năng có chứa glucosamin

1.3 Các phương pháp tạo dẫn xuất của glucosamin

Glucosamin là chất phân cực chứa poliancol và nhóm amino, vì vậy trong quá trình xử lý mẫu rất khó để tách và làm sạch nó từ các nền mẫu phức tạp đặc biệt là các dung dịch sinh học Mặt khác, glucosamin không có các nhóm mang màu mạnh, hấp thụ yếu trong vùng tử ngoại Vì vậy, để tăng cường khả năng hấp thụ (phân tích bằng phương pháp HPLC-UV, PDA), hấp phụ trên pha đảo và tăng độ nhạy của phương pháp phân tích, người ta tiến hành dẫn xuất hóa glucosamin (qua nhóm amino) với các thuốc thử: 9-fluorenylmethyl chloroformat (FMOC-Cl), 1-napthyl isothiocyanate (NITC), phenylisothiocyanat (PITC), 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC), axit 8-aminopyrenesulfonic (APTS), o-phthalaldehyd /acid 3-mercaptopropionic (OPA/3-MPA) và N-(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy) succinimid (FMOC-Su) [21, 26]

Zhu X, ZhangL.J và cộng sự tiến hành tạo dẫn xuất giữa glucosamin với thuốc thử FMOC-Cl, điều kiện tối ưu cho quá trình dẫn xuất hóa xảy ra ở

20oC, tại pH=7 trong khoảng thời gian 30 phút Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đồng thời với quá trình tạo dẫn xuất còn xảy ra các phản ứng phụ khác, đặc biệt là phản ứng thủy phân của thuốc thử tạo ra sản phẩm ancol, làm giảm hiệu suất phản ứng tạo dẫn xuất

Ali Aghazadeh-Habashi và cộng sự đã sử dụng NITC như là thuốc thử tạo dẫn xuất và xác định glucosamin trong huyết tương thỏ bằng phương pháp HPLC-UV Theo phương pháp này, quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện bằng cách thêm 0,2ml 1-naphthyl isothiocyanat (88mg/ml) được hòa tan trong hỗn hợp methanol-acetonitril-triethylamin, 1:1:0,3) Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ phòng trong thời gian 20 phút, kết thúc phản ứng thêm 0,4ml dung dịch acid acetic 1,5% Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là khi xác định bằng phương pháp HPLC-UV, thành phần pha động phức tạp (acetonitril: nước: acid acetic: triethylamin (4,5: 95,5:0,1:0,05; pH=4,5), thời gian phân tích kéo dài (thời gian lưu 29 phút đối với glucosamin)

Wang X và các cộng sự sử dụng AQC như là thuốc thử tạo dẫn xuất huỳnh quang với glucosamin và xác định bằng phương pháp HPLC-FD, quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện trong môi trường đệm borat 0,2M, pH=8,8:

Guan và cộng sự sử dụng OPA/3-MPA tạo dẫn xuất với glucosamin, quá trình được thực hiện trong môi trường đệm borat 0,05M (pH=9,3), tại nhiệt độ phòng và kéo dài trong thời gian 15 phút

Zhou và các cộng sự đã thiết lập phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01, theo phương pháp này trước khi phân tích bằng HPLC-UV, glucosamin được tạo dẫn xuất với thuốc thử FMOC-Su trong môi trường triethylamin ở 50oC với thời gian 30 phút Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để xác định glucosamin trong các đối tượng khác nhau

Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi sử dụng phương pháp AOAC 2005.01 như là một phương pháp tiêu chuẩn để so sánh với phương pháp mới HPLC-ELSD

1.4 Các phương pháp xác định glucosamin

Trên thế giới rất nhiều các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu xác định hàm lượng glucosamin bằng nhiều phương pháp như: trắc quang, sắc ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các detector khác nhau (HPLC

- RID, UV, PDA, FD, MS/MS) trên các đối tượng khác nhau như:thực phẩm chức năng, thuốc, chitosan, chitin, dung dịch sinh học Bảng 1.4 tóm tắt một

số phương pháp đã được sử dụng để tiến hành xác định glucosamin

Bảng 1.4 Các phương pháp xác định glucosamin

Phương

pháp

Đối tượng phân tích Điều kiện phân tích

Đánh giá phương pháp phân

-LOD=1,3mg/g -Độ thu hồi R (%)=95,1-104,3%

-RSD(%)= 4,1-5,4

[8]

CE-UV

Các chế phẩm dinh dưỡng (nutraceutical formulations)

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: axit anthranilic (acid aminobenzoic) và natri cyanoborohydrua hòa tan trong methanol và đệm -acetate-borat, gia nhiệt ở 80oC trong

40 Hệ số tương quan: R2 = 0,980

- LOD = 200pg

- LOQ = 500pg

- RSD(%): 2,8-5,1%

[16]

- Hệ số tương quan R2 = 0,9995

- LOD =0.0705 μg/mL -LOQ = 0.235 μg/mL

- Hệ số tương quan R2 = 0,9995

[14]

- Chất tạo dẫn xuất: phenylisothiocyanate (PITC), đệm phosphat (pH 8,0), thời gian dẫn xuất 10 phút, thổi khô bằng khí nitơ ở 50oC

- Cột tách: Cột C18 Bondclon, 30cm x 3,9mm, 5µm, (Phenomenex, Macclesfield Cheshire, UK)

- Pha động: MeOH:H2O:CH3COOH=10:89,96:0,04

- Tốc độ dòng: 1,2ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 254nm

-Hệ số tương quan R2 ≥ 0.99 -Khoảng tuyến tính:1,25-20 µg/ml

ở dạng liều dùng rắn hoặc lỏng

- Cột tách: amino Phenomenex Luna (150 mm×4,6 mm, 5µm)

- LOD = 37 µg/ml -LOQ = 149 µg/ml

[20]

- Thời gian lưu: 10 phút

- Chất tạo dẫn xuất: N-(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy) succinimid (FMOC-Su)

- Cột tách: Phenomenex Prodigy ODS-3 (150 mm×3,2

mm, 5µm), tiền cột Phenomenex Prodigy ODS-3 (40 mm×3 mm)

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: 9-Fluorenylmethoxycacbonyl clorua (FMOC-Cl), trong môi trường đệm borat

-Khoảng tuyến tính: 100-500

(pH=7,0), thực hiện phản ứng ở 20 C, thời gian dẫn xuất

30 phút

- Cột tách: ZORRBAX Eclipse XDB-C8 (150mm x 4,6mm, 4µm( Agilent, USA)

- RSD (%) <4,0%

- Độ thu hồi R(%)= 98,7%

- Chất nội chuẩn: galactosamin

- Kết tủa protein: acetonitril

- Phương pháp chiết: chiết pha rắn-trao đổi ion (styren divinylbenzen quaternary ammonium ion) (Alltech

- Khoảng tuyến tính: 1.25 

400 µg/ ml

- Hệ số tương quan R2 = 0,99 -LOD = 0,63 µg/ml

[7]

Associates Inc (Deerfield, IL, USA)

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: 1-naphthyl isothiocyanat (NITC)

- Cột tách: C18 Chromatography Sciences Co, St-Laurent,

QC, Canada) (100 mm×4,6 mm, 5µm ) tiền cột C18 (Waters, Mississauga, ON, Canada)

- Chất nội chuẩn: tolterodin tartrat

- Kết tủa protein: acetonitril

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd/acid mercaptopropionic (OPA/3-MPA)

3 Cột tách: ODS (150mm×4,6mm,5µm) (Phenomenex, Tor-rance, CA, USA)

- Khoảng tuyến tính: 0,41  82,7 µg/ ml

- Hệ số tương quan R2 = 0,9999

- LLOQ = 2 ng/ml

- RSD(%)= 3,93 % (n=5)

[10]

- Kết tủa protein: acetonitril

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: phenyl isothiocyanat (PITC) trong acetonitril tại 60oC trong 40 phút

- Hệ số tương quan R2 = 0,9991

- LOD = 35 ng/ml

- RSD (%) =8,7-11,4%

-Độ thu hồi R (%)=73%

[11]

MS

Huyết tương chó

- Chất nội chuẩn: Miconazol

- Kết tủa protein: Kẽm sunphat 10% vа dung dịch NaOH 500 mM

- Phương pháp chiết: pha rắn ( trao đổi cation)

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd/acid mercaptopropionic (OPA/3-MPA)

3 Cột tách: Cyano Zorbax SB (250mm×4,6mm, 5µm) (Agilent Waldbronn, Germany), tiền cột C18 (20 mm×4,6mm, 3,5µm) (Waters, Milford, MA, USA)

- Chất nội chuẩn: D-[1-13C] glucosamin

- Kết tủa protein: acid trichloroacetic

-Khoảng tuyến tính: 600 ng/ml - 2000 ng/ml [17]

Hoạt dịch người

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd/acid mercaptopropionic (OPA/3-MPA)

3 Cột tách: Asahipak NH2P3 50 2D (150 mm×2.0mm, 5 µm), tiền cột Shodex Asahipak NH2P-50G 2A (30 mm×2.0 mm, 5 µm) (Kanagawa, Japan)

- Kết tủa protein: acetonitril

- Thuốc thử tạo dẫn xuất: 9-Fluorenylmethoxycacbonyl clorua (FMOC-Cl), Dung dịch đệm borat pH=8.0, thực hiện dẫn xuất bằng cách đun cách thủy ở 30oC, trong 30 phút

- Cột tách: DiamonsilTM C18 (150mm x4,6mm, 5µm)

-Khoảng tuyến tính: 10µg/ mL

0,1 Hệ số tương quan R2= 0,9996

-LOD=15ng/mL

[27]

- Kết tủa protein: Ethanol

- Nhiệt độ ống hóa hơi: 325oC

- Sự phân mảnh: m/z: 180,1→ 162,1 đối với glucosamin

-Khoảng tuyến tính:

53,27-3409 ng/mL -Hệ số tương quan R2=0,994 -LOQ = 53,27ng/mL

-RSD(%) = 6.5%

- Độ thu hồi R(%)>101,7% [39]

không phổ biến cho các phòng thí nghiệm

- Để phân tích trực tiếp glucosamin (không dẫn xuất hóa trước khi phân

tích) bằng phương pháp HPLC-PDA, RID, các tác giả sử dụng cột tách phân cực chọn lọc như amino, cyano, cột trao đổi ion hoặc sử dụng các detector đo

chỉ số khúc xạ và khối phổ

- Glucosamin không có các nhóm mang màu mạnh, vì vậy để tăng cường khả năng hấp thụ và phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC-UV, PDA, FLD, MS, MS-MS) người ta tiến hành dẫn xuất hóa glucosamin với các thuốc thử FMOC-Su, FMOC-Cl, NITC, PITC, AQC, APTS,OPA/3-MPA Tuy nhiên, nhược điểm chung của các phương pháp này

là ngoài quá trình tạo dẫn xuất còn xảy ra các quá trình phụ, gây ảnh hưởng tới phản ứng tạo dẫn xuất Mặt khác, quá trình tạo dẫn xuất phức tạp và kéo dài, làm tăng thời gian phân tích Các sản phẩm tạo thành thường kém bền, cần tiến hành loại bỏ lượng dư của thuốc thử và các sản phẩm phụ

Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi xây dựng và thẩm định phương pháp mới xác định hàm lượng glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD)

1.5 Phương pháp HPLC-ELSD

1.5.1 Nguyên tắc hoạt động

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Khi tiến hành chạy sắc ký,

các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau

Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.[1,4,5]

Các chất sau khi tách ra khỏi nhau được hóa hơi nhờ nhiệt độ tạo thành các hạt sương có kích thước nhỏ tại buồng hóa hơi, sau đó đi qua một đường ống dài (driff) và dưới tác dụng của dòng khí dung môi được làm bay hơi để lại các hạt chất tan được làm khô Dòng hạt này làm tán xạ chùm ánh sáng chiếu tới, cường độ của tia tán xạ đo được tỷ lệ tương ứng với nồng độ chất phân tích

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1.5.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

a Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký lỏng pha thường (NP-HPLC) và sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC)

- Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó làcác silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN…)

- Sắc ký lỏng pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là -C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất

đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

b Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh

- Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp

+ Loại thứ nhất có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược

+ Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, pentan, heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluen…

n-Để tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là gradient pha động

c Detector trong sắc ký lỏng

Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo