Nghiên cứu xác định glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tái xạ bay hơi (HPLC ELSD)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN TRUNG DŨNG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này được thực hiện tại Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia, 48B Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội và hoàn thành tại Trường Đại học Vinh, với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Trung Dũng. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Trung Dũng, Bộ môn Kỹ thuật Môi trường, Khoa Hóa Lý kỹ thuật, Học viện Kỹ thuật Quân sự đã giao đề tài cũng như hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện bản luận văn. PGS.TS. Nguyễn Khắc Nghĩa và PGS.TS. Trần Đình Thắng đã dành nhiều thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn. Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài này. ThS. Vũ Thị Kim Oanh, ThS.Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh chị trong labo Hóa độc đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Các thầy, cô giảng dạy tại khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hóa Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại. Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Vinh, tháng 10 năm 2014 Học viên Lê Thị Dung MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng 3 1.1.1. Định nghĩa thực phẩm chức năng 3 1.1.2. Tên gọi 5 1.1.3. Phân biệt thực phẩm chức năng 5 1.2. Giới thiệu về glucosamin 8 1.2.1. Cấu tạo, tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8 1.2.2. Quy trình điều chế Glucosamin hydroclorua 10 1.2.3. Tác dụng dược lý của glucosamin 11 1.2.4. Tình hình sử dụng glucosamin trong nước và trên thế giới 12 1.3. Các phương pháp tạo dẫn xuất của glucosamin 15 1.4. Các phương pháp xác định glucosamin 17 1.5. Phương pháp HPLC-ELSD 28 1.5.1. Nguyên tắc hoạt động 28 1.5.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 29 1.6. Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích 32 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 37 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 37 2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu 37 2.1.3. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 37 2.1.4. Phương pháp nghiên cứu 38 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 44 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ 44 2.2.2. Hóa chất 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1. Tối ưu các điều kiện xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC-ELSD 46 3.1.1. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 46 3.1.2. Tối ưu hóa detector ELSD 51 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 56 3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 56 3.2.2. Xác định khoảng tuyến tính và lập phương trình đường chuẩn 58 3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 59 3.2.4. Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp. 60 3.3. Kết quả phân tích một số mẫu thực 62 KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 70 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống 6 Bảng 1.2. Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc 7 Bảng 1.3. Cấu tạo và tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8 Bảng 1.4. Các phương pháp xác định glucosamin 18 Bảng 3.1. Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng 47 Bảng 3.2. Khảo sát chương trình gradient 49 Bảng 3.3. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi 52 Bảng 3.4. Khảo sát tốc độ dòng khí mang 54 Bảng 3.5. Các điều kiện tối ưu xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC-ELSD 56 Bảng 3.6. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57 Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ glucosamin 58 Bảng 3.8. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang cứng 60 Bảng 3.9. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang dầu 60 Bảng 3.10. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên nang mềm 61 Bảng 3.11. Kết quả xác định chuẩn Fisher của 2 phương pháp HPLC ELSD và AOAC 2005.01 61 Bảng 3.12. So sánh hai phương pháp HPLC-ELSD và phương pháp tiêu chuẩn OAC 2005.01 62 Bảng 3.13. Kết quả phân tích glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng 63 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các dạng cấu trúc hóa học của glucosamin 9 Hình 1.2. Bệnh thoái hóa khớp ở người 11 Hình 1.3. Một số thực phẩm chức năng có chứa glucosamin 15 Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 29 Hình 1.5. Cấu tạo của detector ELSD 31 Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu không chứa chất béo 39 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu chứa chất béo 40 Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC2005.01 đối với mẫu không chứa béo 41 Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01 đối với mẫu chứa béo 42 Hình 2.5. Hệ thống máy UPLC Acquity (Waters, Mỹ) 44 Hình 3.1. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H 2 O:ACN=20:80 47 Hình 3.2. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H 2 O:ACN=25:75 47 Hình 3.3. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H 2 O:ACN=30:70 48 Hình 3.4. Sắc đồ chuẩn glucosamin 1300ppm sử dụng pha động H 2 O:ACN=40:60 48 Hình 3.5. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H 2 O: ACN theo chương trình gradient 1 50 Hình 3.6. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H 2 O:ACN theo chương trình gradient 2 50 Hình 3.7. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H 2 O:ACN theo chương trình gradient 3 50 Hình 3.8. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H 2 O:ACN theo chương trình gradient 4 51 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nhiệt độ ống hóa hơi 53 Hình 3.10. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, nhiệt độ ống bay hơi 55 o C 53 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng khí mang N 2 55 Hình 3.12. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, tốc độ dòng khí mang 30psi 55 Hình 3.13. Sắc đồ glucosamin đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57 Hình 3.14. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ glucosamin từ 5,2mg/ml đến 26,0 mg/ml 58 Hình 3.15. Sắc đồ của glucosamin tại giới hạn phát hiện 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Community Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức APCI Atmospheric pressure chemical ionization Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản ELSD Evaporative Light Scattering Detector Detector tán xạ bay hơi EMAE Pharmaceutical Management Agency Europe Cơ quan quản lý dược phẩm Châu Âu ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao NP- HPLC Normal phase high performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận RP- HPLC Reversed phase high performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ICH International Conference on Harmonization Hội đồng hòa hợp quốc tế IFIC International Food Information Council Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế ILSI International Life Science Institute Viện khoa học và đời sống quốc tế LC- MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng PRSD Predicted Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối ước tính PDA Photodiode array Dãy diod quang RSD Relative standard devition Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn USFDA Food and Drug Administration Cục quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ UV Ultraviolet Tia cực tím [...]... cứu xác định Glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tán xạ bay hơi (HPLC- ELSD) 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng 1.1.1 Định nghĩa thực phẩm chức năng Cho đến nay chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về thực phẩm chức năng (TPCN), mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và khu vực về thực phẩm chức năng Mặc... cơ quan chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm, nhất là đối với thực phẩm chức năng, cần phải có một phương pháp phân tích phù hợp để xác định hàm lượng glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng có mặt trên thị trường Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định glucosamin trong các đối tượng khác nhau (thực phẩm chức năng, thuốc, chitosan, chitin, dung dịch sinh học…) bằng nhiều... sản phẩm thực phẩm chức năng thì Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, thực phẩm dinh dưỡng y học” Như vậy, có rất nhiều các định nghĩa về thực phẩm chức năng, song tất cả đều thống nhất: Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm. .. hành nghiên cứu xác định hàm lượng glucosamin bằng nhiều phương pháp như: trắc quang, sắc ký điện di, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các detector khác nhau (HPLC - RID, UV, PDA, FD, MS/MS) trên các đối tượng khác nhau như :thực phẩm chức năng, thuốc, chitosan, chitin, dung dịch sinh học Bảng 1.4 tóm tắt một số phương pháp đã được sử dụng để tiến hành xác định glucosamin 18 Bảng 1.4 Các phương pháp. .. nguyên bản là Thực phẩm vệ sinh Chức năng của các sản phẩm nаy rất rộng, bao gồm cả Dietary Supplement (Thực phẩm bổ sung) và Medical Supplement (Thực phẩm y học hay Thực phẩm điều trị) 1.1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng 1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống 6 Bảng 1.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống [18, 32] TT Tiêu chí phân biệt 1 Chức năng 2 Chế biến... thực phẩm (truyền thống - Food) và thuốc (Drug) Thực phẩm chức năng thuộc khoảng giao thoa (còn gọi là vùng xám) giữa thực phẩm và thuốc Vì thế người ta còn gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm - thuốc (Food-Drug) Khái quát lại có thể đưa ra một định nghĩa như sau: Thực phẩm chức năng (TPCN) là thực phẩm (hoặc sản phẩm) dùng để hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong. .. xuất với thuốc thử FMOC-Su trong môi trường triethylamin ở 50oC với thời gian 30 phút Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để xác định glucosamin trong các đối tượng khác nhau Trong nghiên cứu của mình, chúng tôi sử dụng phương pháp AOAC 2005.01 như là một phương pháp tiêu chuẩn để so sánh với phương pháp mới HPLC-ELSD 1.4 Các phương pháp xác định glucosamin Trên thế giới... là một trong những lựa chọn đầu tiên mà con người hướng tới Nhưng thực tế hiện nay, việc hiểu biết và sử dụng đúng thực phẩm chức năng còn rất hạn chế Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể con người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình... gia, glucosamin chưa được công nhận là thuốc, chỉ được công nhận là thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị thoái hóa khớp 13 Có 3 dạng glucosamin dùng trong điều trị là glucosamin sulfat, glucosamin hydroclorua và N-Acetylglucosamin, trong đó dạng muối sulfat được cho là dễ hấp thu, dung nạp tốt nhất và cho hiệu quả nhất trong điều trị Dạng thường gặp của glucosamin trong thực phẩm chức năng. .. là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại Hiệp Hội thông tin thực phẩm quốc tế (IFIC) cho rằng Thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khỏe nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản” [18, 31] Tại Việt Nam, thông tư số 08/TT-BYT ngày 23-8-2004 của Bộ Y tế quy định: Thực phẩm chức năng là thực phẩm để hỗ trợ các chức năng của các bộ phận trong . cứu xác định Glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD) 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức. HỌC VINH LÊ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD) Chuyên ngành:. VINH LÊ THỊ DUNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD) LUẬN VĂN