Theo quy định của USFDA, AOAC và ICH đối với các phương pháp phân tích các thông số cần thẩm định bao gồm các chỉ tiêu chính sau [6,7]:
Tính đặc hiệu, tính chọn lọc
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.
Tính chọn lọc: Là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích một số hoặc nhiều chất chung một qui trình. Nếu chất cần xác định phân biệt rõ với chất khác thì phương pháp phân tích có tính chọn lọc.
*Cách xác định:
Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này do thiết bị sắc ký có kết nối detecter ELSD nên chúng tôi so sánh phổ của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4). Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio).
LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3, LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10. Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn [5]
Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích.
Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích.
Để xác định khoảng tuyến tính người ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính.
Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích.
Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ số đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu và hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of corelation), giá trị R phải đạt yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤1.
Độ lặp lại
Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD(%):
Trong đó:
xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i.
x: Nồng độ trung bình tính được của n lần thử nghiệm. n: Số lần thử nghiệm (thong thường lặp lại sáu lần).
Tuy nhiên, khi các mẫu có chứa hàm lượng chất phân tích ở dạng đa lượng để đánh giá độ lặp lại, người ta thường sử dụng chỉ số HorRat. Chỉ số HorRat là giá trị độ lệch chuẩn tương đổi quan sát được (RSDR) chia theo giá trị độ lệch chuẩn tương đổi ước tính (PRSDR), được tính từ công thức Horwitz:PRSDR(%)2.C0,15, ở đây C là nồng độ trung bình của chất phân tích.
(%) (%) R R PRSD RSD
Đối với các thí nghiệm liên phòng giá trị HorRat được chấp nhận trong khoảng từ 0,5-2,0. Đối với các phòng thí nghiệm giá trị HorRat cho phép từ 0,3-1,3. [28]
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ). Có nhiều cách tính độ đúng như cách dùng so sánh với phương pháp chuẩn, tính độ thu hồi, sử dụng vật liệu chuẩn... trong nghiên cứu này chúng tôi xác định độ đúng thông qua việc so sánh với phương pháp chuẩn
Đánh giá độ tương đồng về độ chụm của 2 phương pháp bằng cách so sánh phương sai s2 của hai phương pháp đo, dùng tiêu chuẩn F (Fisher) và so sánh hai giá trị trung bình bằng tiêu chuẩn t (student).
So sánh hai phương sai (chuẩn F-Fisher)
Chuẩn F dùng để so sánh độ lặp lại của hai tập số liệu hoặc hai phương pháp. Với tập số liệu nhỏ, tính toán giá trị Ftn (F thực nghiệm) theo công thức sau đây và so sánh với giá trị Fbảng (F tra bảng)
1 2 2 2 1 S S Ftính
, : Các phương sai của hai phương pháp với quy ước
Nếu: Ftính ≤ Fbảng (α, k1, k2): Hai phương pháp có độ lặp lại (độ chụm) giống nhau
Nếu: Ftính> Fbảng (α, k1, k2): Hai phương pháp có độ lặp lại khác nhau, trong trường hợp này nếu độ lặp của phương pháp thử nghiệm khác với phương pháp chuẩn thì cần xem xét thêm về độ lặp lại
(3)
(4) Chỉ số HorRat
Trong đó:
Fbảng (α, k1, k2): Giá trị F tra bảng với: k1, k2: bậc tự do (k1 = n1-1, k2 = n2-1)
n1, n2: Số lần làm thực nghiệm của hai phương pháp
α: Mức ý nghĩa (significance level), thường lấy α = 0,05 tương ứng độ tin cậy 95%
So sánh hai giá trị trung bình (chuẩn t - student)
Chuẩn t được dùng để so sánh xem có sự khác nhau giữa giá trị thực nghiệm và giá trị thực hay không; phương pháp này được ứng dụng hoặc để so sánh kết quả thực nghiệm với giá trị chuẩn trong mẫu được kiểm tra hoặc để so sánh kết quả của phương pháp phân tích với phương pháp đối chiếu
Trước khi so sánh hai giá trị trung bình cần so sánh hai phương sai. Với số lần phân tích nhỏ hơn 30, khi hai phương sai có sự đồng nhất, tính độ lệch chuẩn chung và giá trị ttn (t thực nghiệm) theo công thức sau đây và so sánh với giá trị tbảng (tra bảng):
) 1 1 ( 2 2 2 1 n n S x x t c tính Trong đó: ttính: Giá trị thực nghiệm
tbảng(α, k): Giá trị tra bảng mức ý nghĩa α, bậc tự do k
n1, n2: số lần thí nghiệm lần lượt của phương pháp thử nghiệm và phương pháp đối chiếu
, : Phương sai lần lượt của phương pháp thử nghiệm và phương pháp đối chiếu
2 1,x
x : Giá trị trung bình lần lượt của phương pháp thử nghiệm và phương pháp đối chiếu
Nếu ttính ≤ tbảng(α, k): Không có sự khác nhau về kết quả của hai phương pháp
Nếu ttính> tbảng(α, k): Có sự khác nhau về kết quả của hai phương pháp, phương pháp thử nghiệm mắc sai số hệ thống.
Trong trường hợp hai phương sai không đồng nhất (khác nhau có ý nghĩa), tính giá trị ttn và bậc tự do k theo các công thức sau và so sánh như trên
) 1 1 ( 2 1 2 2 1 n n S x x t c tính 2 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 2 1 2 2 2 2 1 2 1 n n S n n S n S n S k (6)
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
11 mẫu thực phấm chức năng chứa glucosamin thuộc các dạng bào chế khác nhau được lấy ngẫu nhiên và được đánh số ngẫu nhiên từ sản phẩm 1 đến sản phẩm 11: 4 mẫu dạng viên nang dầu (mẫu 1, mẫu 5, mẫu 8, mẫu 11), 1 mẫu dạng bột (mẫu 10); 3 mẫu dạng viên mềm (mẫu 2, mẫu 3, mẫu 9); 3 mẫu dạng viên nang cứng (mẫu 4, mẫu 6, mẫu 7).
2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Tối ưu các điều kiện chạy máy HPLC-ELSD để xác định glucosamin trong các mẫu thực phẩm chức năng
- Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích
- Ứng dụng phương pháp để xác định một số mẫu thực tế
2.1.3. Nội dung nghiên cứu thực nghiệm
- Tối ưu các điều kiện xác định glucosamin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC-ELSD
+ Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Lựa chọn cột tách
Khảo sát chương trình rửa giải của pha động + Tối ưu hóa detector ELSD
Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi
Khảo sát tốc độ dòng khí mang
+ Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích
Đánh giá độ lặp lại của thiết bị phân tích
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng phương trình đường chuẩn
Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp + Phân tích mẫu thực tế
2.1.4. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp lấy mẫu
- Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có thành phần glucosamin có tác dụng hỗ trợ trong việc điều trị và phòng viêm xương khớp
- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
- Địa điểm: Trên địa bàn Thành phố Hà Nội
- Khối lượng mẫu: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu - Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường
b. Phương pháp xử lý mẫu
Đối với các mẫu không chứa chất béo (viên nén, viên nang cứng): Cân khối lượng trung bình của 20 viên, nghiền mịn và đồng nhất (đối với viên nang cứng loại bỏ và làm sạch lớp vỏ nang, tính khối lượng trung bình viên. Ruột nang được gộp lại và đồng nhất kỹ). Thêm 30ml nước cất hai lần, lắc xoáy trong 1 phút bằng máy vortex, rung siêu âm trong thời gian 5 phút, chuyển vào bình định mức và định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Dung dịch phân tích được lọc qua màng lọc 0,45 µm và bơm vào hệ thống UPLC (hình 2.1).
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu không chứa chất béo
Đối với các mẫu chứa chất béo (viên nang mềm):
Cân khối lượng trung bình của 20 viên, lấy phần ruột trong nang và đồng nhất. Mẫu được cân một lượng chính xác vào ống ly tâm 50 ml, thêm 30 ml n-hexan, lắc xoáy trong 1 phút bằng máy Vortex sau đó đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dung môi, thêm nước cất hai lần và đánh siêu âm trong thời gian 5 phút, chuyển vào bình định mức và định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Dung dịch phân tích được lọc qua màng lọc 0,45 µm và bơm vào hệ thống UPLC (hình 2.2).
Cân mẫu vào cốc có mỏ 50ml
+ 30ml nước cất 2 lần Rung siêu âm, 5 phút
Chuyển bình định mức 50ml
Đo HPLC-ELSD
Định mức bằng nước cất 2 lần
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu chứa chất béo
Chuẩn bị mẫu cho phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01
Dung dịch phân tích cũng được chuẩn bị như trên đối với mẫu chứa béo và mẫu không chứa béo, sau khi lọc qua màng lọc 0,45 µm, lấy chính xác một thể tích dung dịch phân tích vào bình định mức 5 ml, thêm một thể tích xác định triethylamin (TEA) để trung hòa HCl hoặc H2SO4.Tiến hành dẫn xuất hóa glucosamin tự do bằng một thể tích xác định thuốc thử FMOC-Su 15mM, lắc xoáy bằng máy Vortex, rung siêu âm trong bể ở nhiệt độ 50oC trong khoảng 30 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, định mức tới vạch bằng pha động (dung dịch acidtrifluoroacetic 0,05% (pH=2,4) và acetonitril, 1/1, v/v).Trộn đều dung dịch với máy lắc Vortex, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào hệ thống HPLC.
Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC2005.01 đối với mẫu không chứa béo
Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01 đối với mẫu chứa béo
Li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút
Gạn bỏ lớp dung môi/ để khô tự nhiên
Phần cặn còn lại (+30ml H2O cất 2 lần) Đo HPLC-PDA Chuyển vào bình định mức 50ml Định mức/ nước cất 2 lần Lọc qua giấy lọc Vial/ Lắc đều
Dẫn xuất hóa với thuốc thử FMOC-Su, 50oC, 30 phút
Lắc Votex 1 phút
Cân mẫu / ống li tâm 50ml
Rung siêu âm hòa tan 5 phút (+30ml n-hexan)
c. Phương pháp HPLC-ELSD
Chúng tôi lựa chọn phương pháp phân tích là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD) để xác định glucosamin trong thực phẩm chức năng. Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.
d. Phương pháp thẩm định gồm:
Đánh giá độ lặp lại của thiết bị phân tích
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng phương trình đường chuẩn
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.
e. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Chất lượng phụ gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, Labo hóa độc - Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 48B - Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội.
f. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích Empower của thiết bị. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm ðýợc tiến hành bằng phần mềm Statistica 6 ( Statsoft Inc., USA) và Origin 6.0.
g. Phương pháp đánh giá kết quả
- Hàm lượng Glucosamin được tính theo công thức:
m V K C Hcl HglGlu. . . ' Trong đó: ' C nồng độ chất phân tích K: Hệ số phân tích V: Thể tích chất phân tích m: Khối lượng chất phân tích
Hlg . .179 Hlg 179 36,5 Glu Hcl Glu Hlg . H lg .(179.2 98) 179.2 Glu Glu Sulfat
- Hàm lượng phân tích được tính theo công thức:
Hgl . phân tích H lg . viên viên tb Glu m Glu 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị:
- Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC Acquity (Waters, Mỹ) với bơm cao áp (Acquity H-Class), bơm mẫu tự động (FTN), buồng nhiệt cột (CHA), detector tán xạ bay hơi (ELSD). Cột sắc ký: Amino Sherisorb (250×4,6 mm, 5µm) (Waters, Mỹ) và tiền cột amino-Sherisorb (10mm x 4,6 mm, 5 µm)
Hình 2.5. Hệ thống máy UPLC Acquity (Waters, Mỹ)
- Máy lắc vortex VELP
- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Germany)
- Cân phân tích Metter Toledo (Thụy Sĩ) (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) - Cân kỹ thuật (có độ chính xác 0,01g)
b. Dụng cụ
- Ống li tâm 50ml
- Ống đong, phễu, giấy lọc và màng lọc 0,45µm - Cốc có mỏ dung tích 50ml
- Autopipet loại 100 µl ,200 µl, 1000 µl, 5000 µl và đầu côn tương ứng - Vial loại 1,8ml
- Bình định mức dung tích 5, 10, 25, 50, 100ml
2.2.2. Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
- Chuẩn Glucosamin từ hãng Sigma (St. Louis, MO), độ tinh khiết > 99% - FMOC-Su từhãng Sigma (St. Louis, MO), độ tinh khiết > 99%
- Acetonitril (ACN) (Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký
- Trifluoroacetic acid (TFA)(Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký - Triethylamin (TEA)(Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký
- Nước cất dùng cho sắc ký lỏng: nước cất hai lần, lọc qua bộ lọc màng 0,45µm sau đó rung siêu âm
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 26 mg/ml được chuẩn bị bằng một lượng cân chính xác glucosamin hydroclorua pha trong nước cất hai lần và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8oC trong 6 tháng. Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất hai lần.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu các điều kiện xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC- ELSD
3.1.1. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
3.1.1.1. Cột tách
Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Glucosamin chứa nhóm amino, là chất phân cực. Vì vậy, chúng tôi chọn cột amino. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột: