a. Phương pháp lấy mẫu
- Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có thành phần glucosamin có tác dụng hỗ trợ trong việc điều trị và phòng viêm xương khớp
- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên
- Địa điểm: Trên địa bàn Thành phố Hà Nội
- Khối lượng mẫu: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/mẫu - Bảo quản và lưu trữ mẫu: Điều kiện thường
b. Phương pháp xử lý mẫu
Đối với các mẫu không chứa chất béo (viên nén, viên nang cứng): Cân khối lượng trung bình của 20 viên, nghiền mịn và đồng nhất (đối với viên nang cứng loại bỏ và làm sạch lớp vỏ nang, tính khối lượng trung bình viên. Ruột nang được gộp lại và đồng nhất kỹ). Thêm 30ml nước cất hai lần, lắc xoáy trong 1 phút bằng máy vortex, rung siêu âm trong thời gian 5 phút, chuyển vào bình định mức và định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Dung dịch phân tích được lọc qua màng lọc 0,45 µm và bơm vào hệ thống UPLC (hình 2.1).
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu không chứa chất béo
Đối với các mẫu chứa chất béo (viên nang mềm):
Cân khối lượng trung bình của 20 viên, lấy phần ruột trong nang và đồng nhất. Mẫu được cân một lượng chính xác vào ống ly tâm 50 ml, thêm 30 ml n-hexan, lắc xoáy trong 1 phút bằng máy Vortex sau đó đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dung môi, thêm nước cất hai lần và đánh siêu âm trong thời gian 5 phút, chuyển vào bình định mức và định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần. Dung dịch phân tích được lọc qua màng lọc 0,45 µm và bơm vào hệ thống UPLC (hình 2.2).
Cân mẫu vào cốc có mỏ 50ml
+ 30ml nước cất 2 lần Rung siêu âm, 5 phút
Chuyển bình định mức 50ml
Đo HPLC-ELSD
Định mức bằng nước cất 2 lần
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu chứa chất béo
Chuẩn bị mẫu cho phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01
Dung dịch phân tích cũng được chuẩn bị như trên đối với mẫu chứa béo và mẫu không chứa béo, sau khi lọc qua màng lọc 0,45 µm, lấy chính xác một thể tích dung dịch phân tích vào bình định mức 5 ml, thêm một thể tích xác định triethylamin (TEA) để trung hòa HCl hoặc H2SO4.Tiến hành dẫn xuất hóa glucosamin tự do bằng một thể tích xác định thuốc thử FMOC-Su 15mM, lắc xoáy bằng máy Vortex, rung siêu âm trong bể ở nhiệt độ 50oC trong khoảng 30 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, định mức tới vạch bằng pha động (dung dịch acidtrifluoroacetic 0,05% (pH=2,4) và acetonitril, 1/1, v/v).Trộn đều dung dịch với máy lắc Vortex, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào hệ thống HPLC.
Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC2005.01 đối với mẫu không chứa béo
Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp tiêu chuẩn AOAC 2005.01 đối với mẫu chứa béo
Li tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút
Gạn bỏ lớp dung môi/ để khô tự nhiên
Phần cặn còn lại (+30ml H2O cất 2 lần) Đo HPLC-PDA Chuyển vào bình định mức 50ml Định mức/ nước cất 2 lần Lọc qua giấy lọc Vial/ Lắc đều
Dẫn xuất hóa với thuốc thử FMOC-Su, 50oC, 30 phút
Lắc Votex 1 phút
Cân mẫu / ống li tâm 50ml
Rung siêu âm hòa tan 5 phút (+30ml n-hexan)
c. Phương pháp HPLC-ELSD
Chúng tôi lựa chọn phương pháp phân tích là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với detector tán xạ bay hơi (HPLC-ELSD) để xác định glucosamin trong thực phẩm chức năng. Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.
d. Phương pháp thẩm định gồm:
Đánh giá độ lặp lại của thiết bị phân tích
Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng phương trình đường chuẩn
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Độ lặp lại và độ đúng của phương pháp
Cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan.
e. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Chất lượng phụ gia và chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, Labo hóa độc - Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 48B - Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội.
f. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích Empower của thiết bị. Xử lý thống kê các số liệu thực nghiệm ðýợc tiến hành bằng phần mềm Statistica 6 ( Statsoft Inc., USA) và Origin 6.0.
g. Phương pháp đánh giá kết quả
- Hàm lượng Glucosamin được tính theo công thức:
m V K C Hcl HglGlu. . . ' Trong đó: ' C nồng độ chất phân tích K: Hệ số phân tích V: Thể tích chất phân tích m: Khối lượng chất phân tích
Hlg . .179 Hlg 179 36,5 Glu Hcl Glu Hlg . H lg .(179.2 98) 179.2 Glu Glu Sulfat
- Hàm lượng phân tích được tính theo công thức:
Hgl . phân tích H lg . viên viên tb Glu m Glu 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ a. Thiết bị:
- Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC Acquity (Waters, Mỹ) với bơm cao áp (Acquity H-Class), bơm mẫu tự động (FTN), buồng nhiệt cột (CHA), detector tán xạ bay hơi (ELSD). Cột sắc ký: Amino Sherisorb (250×4,6 mm, 5µm) (Waters, Mỹ) và tiền cột amino-Sherisorb (10mm x 4,6 mm, 5 µm)
Hình 2.5. Hệ thống máy UPLC Acquity (Waters, Mỹ)
- Máy lắc vortex VELP
- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Germany)
- Cân phân tích Metter Toledo (Thụy Sĩ) (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg) - Cân kỹ thuật (có độ chính xác 0,01g)
b. Dụng cụ
- Ống li tâm 50ml
- Ống đong, phễu, giấy lọc và màng lọc 0,45µm - Cốc có mỏ dung tích 50ml
- Autopipet loại 100 µl ,200 µl, 1000 µl, 5000 µl và đầu côn tương ứng - Vial loại 1,8ml
- Bình định mức dung tích 5, 10, 25, 50, 100ml
2.2.2. Hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
- Chuẩn Glucosamin từ hãng Sigma (St. Louis, MO), độ tinh khiết > 99% - FMOC-Su từhãng Sigma (St. Louis, MO), độ tinh khiết > 99%
- Acetonitril (ACN) (Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký
- Trifluoroacetic acid (TFA)(Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký - Triethylamin (TEA)(Merck), hoá chất tinh khiết dùng cho sắc ký
- Nước cất dùng cho sắc ký lỏng: nước cất hai lần, lọc qua bộ lọc màng 0,45µm sau đó rung siêu âm
Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 26 mg/ml được chuẩn bị bằng một lượng cân chính xác glucosamin hydroclorua pha trong nước cất hai lần và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2-8oC trong 6 tháng. Các dung dịch có nồng độ thấp hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất hai lần.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu các điều kiện xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC- ELSD
3.1.1. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
3.1.1.1. Cột tách
Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Glucosamin chứa nhóm amino, là chất phân cực. Vì vậy, chúng tôi chọn cột amino. Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột. Thông số cột tách và tiền cột:
- Cột: Amino-Sherisorb (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) -Tiền cột: Amino- Sherisorb (10mm x 4,6 mm, 5 µm)
3.1.1.2. Khảo sát chương trình rửa giải của pha động
Glucosamin là một amino monosaccharide có hoạt tính sinh học trong các mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh về xương khớp, trong thành phần của thực phẩm chức năng, ngoài glucosamin còn có chondroitin và một số thành phần khác có ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Do đó, nhằm mục đích tìm được chương trình tối ưu nhất cho quá trình xác định glucosamin chúng tôi tiến hành khảo sát chương trình rửa giải của pha động theo 2 chế độ đẳng dòng (isocratic) và gradient. Dùng dung dịch chuẩn glucosamin 13000ppm để khảo sát thành phần pha động, các điều kiện chạy máy được cố định như sau:
- Cột: Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm) - Tiền cột: Amino- Sherisorb (10mm x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector: ELSD
- Nhiệt độ ống bay hơi: 55oC - Áp suất khí mang: 30psi
- Tốc độ dòng cố định: 1ml/phút
Thay đổi tỉ lệ nồng độ giữa hai kênh A và B theo thời gian. Kết quả khảo sát quá trình rửa giải theo chế độ đẳng dòng được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1- 3.4
Bảng 3.1. Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng
Chế độisocratic Thành phần pha động % Thời gian lưu (phút) Kênh A: H2O Kênh B: ACN
Isocratic 1 20 80 9,8 Isocratic 2 25 75 8,6 Isocratic 3 30 70 7,0 Isocratic 4 40 60 4,8 L S U 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Hình 3.1. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=20:80 L S U -100.00 0.00 100.00 200.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Hình 3.2. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=25:75
L S U 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Hình 3.3. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm sử dụng pha động H2O:ACN=30:70 L S U 0.00 100.00 200.00 300.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Hình 3.4. Sắc đồ chuẩn glucosamin 1300ppm sử dụng pha động H2O:ACN=40:60
Nhận xét: Khi sử dụng chế độ rửa giải đẳng dòng quan sát thấy píc rất
doãng, độ rộng chân píc lớn, píc bị kéo đuôi về phía trước, Mặt khác, khi tỉ lệ acetonitril càng lớn thì thời gian lưu càng tăng, làm tăng thời gian phân tích và tiêu tốn dung môi.
Để có thể vừa tách được các chất, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient. Kết quả được trình bày trong bảng bảng 3.2 và hình 3.5- 3.8.
Bảng 3.2. Khảo sát chương trình gradient Chương trình Gradient Thời gian (phút) Thành phần pha động (%) Thời gian lưu (phút) Kênh A = H2O Kênh B = ACN Gradient 1 0,00 25 75 8,1 4,00 25 75 4,01 40 60 6,00 40 60 6,01 25 75 10,00 25 75 Gradient 2 0,00 25 75 7,3 3,00 25 75 3,01 60 40 6,00 60 40 6,01 25 75 10,00 25 75 Gradient 3 0,01 25 75 5,4 3,00 55 45 5,00 55 45 5,01 25 75 10,00 25 75 Gradient 4 0,00 25 75 5,9 3,00 45 55 6,00 45 55 6,01 25 75 10,00 25 75
L S U 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Hình 3.5. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O: ACN theo chương trình gradient 1
L S U 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Hình 3.6. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O:ACN theo chương trình gradient 2
L S U 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Hình 3.7. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O:ACN theo chương trình gradient 3
L S U 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
Hình 3.8. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha động H2O:ACN theo chương trình gradient 4
Nhận xét:
Nếu sử dụng gradient 1 thì thời gian lưu dài so với gradient 2, 3 và 4 (8,1 phút) dẫn đến tốn dung môi, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế, píc bị doãng, độ rộng chân píc lớn, píc bị kéo đuôi trước, có nghĩa chất phân tích bị rửa giải chậm. Đối với gradient 2 thì chất phân tích lại bị rửa giải quá nhanh, dẫn đến có lẫn dung môi rửa giải, có hiện tượng dính píc do đó ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích.
Khi thay đổi tỉ lệ H2O:ACN theo gradient 3 và 4 thì ta thấy thời gian lưu ngắn hơn, píc nhọn và cân đối hơn so với gradient 1 và 2. Tuy nhiên, gradient 3 vẫn cho píc nhọn, chân píc nhỏ và cân đối hơn so với gradient 4. Do đó, chúng tôi sử dụng gradient 3 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Tối ưu hóa detector ELSD
3.1.2.1. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi
Nhiệt độ ống bay hơi của detector ELSD có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển dòng dung môi chứa chất phân tích từ dạng lỏng thành dạng sương, nếu nhiệt độ qua thấp thì quá trình chuyển pha xảy ra chậm và không hoàn toàn, từ đó dẫn đến quá trình các chất lỏng không được chuyển thành dạng hơi hoàn toàn và một phần hóa lỏng đi vào phần thải gây mất chất phân tích. Mặt khác, nếu nhiệt độ quá cao, các hạt sương có kích thước nhỏ đi
nhanh vào vùng bay hơi theo dung môi cũng gây mất chất phân tích và làm giảm độ nhạy của phương pháp. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ ống bay hơi, kết quả được trình bày trên bảng 3.3 và hình 3.9. Cố định các thông số sau:
- Cột: Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm) - Tiền cột : Amino-Sherisorb (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector: ELSD
- Áp suất khí mang: 30psi
- Hệ pha động gồm: Kênh A: Nước cất 2 lần, kênh B: Acetonitril - Chương trình rửa giải: Gradient 3 (bảng 3.2)
- Tốc độ dòng cố định: 1ml/phút
- Hàm lượng dung dịch chuẩn glucosamin: 13000 ppm
Bảng 3.3. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi
Nhiệt độ Spic tR (min)
40 9193112 5,180 45 9447603 5,188 50 9797965 5,208 55 10197101 5,202 60 9784020 5,165 65 9155643 5,172 70 9017595 5,202 75 8985845 5.205
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nhiệt độ ống hóa hơi
Nhận xét:
Từ kết quả hình 3.9 và bảng 3.3, trong khoảng nhiệt độ ống bay hơi từ 40oC-75oC thì diện tích pic lớn nhất tại nhiệt độ 55oC (Spic =10197101). Đồng thời, tại giá trị nhiệt độ này trên sắc đồ cho pic nhọn, không có hiện tượng chẻ pic và kéo đuôi. Vì vậy, chúng tôi chọn điều kiện nhiệt độ ống bay hơi tối ưu cho quá trình phân tích là 55oC, sắc đồ phân tích glucosamin ứng với nhiệt độ này được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, nhiệt độ ống bay hơi 55oC
3.1.2.2. Khảo sát tốc độ dòng khí mang
Tương tự nhiệt độ ống bay hơi, tốc độ dòng khí mang cũng có ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích. Dòng khí mang dùng tốc độ và áp suất đẩy dòng sương đi vào ống driff và buồng bay hơi. Nếu tốc độ dòng khí mang thấp không đẩy hết được toàn bộ dòng sương lỏng vào bộ phận bay hơi và phát hiện, dẫn đến giảm độ nhạy phân tích, đồng thời nếu còn dư lại trong ống driff (ống dẫn) thì có thể bị lẫn và gây nhiễm cho lần phân tích sau. Ngược lại, nếu tốc độ dòng khí mang lớn có thể làm bay hơi cả chất phân tích cùng với dung môi làm giảm độ nhạy của phương pháp. Vì vậy, tốc độ dòng khí mang cũng là một điều kiện cần khảo sát, kết quả được trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.11. Cố định các thông số sau:
- Cột : Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm) - Tiền cột: Amino -Sherisorb (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector: ELSD
- Nhiệt độ ống bay hơi: 55oC
- Hệ pha động gồm: Kênh A: nước cất 2 lần; kênh B: Acetonitril - Chương trình rửa giải: Gradient 3 (bảng 3.7)
- Tốc độ dòng cố định: 1ml/phút
- Hàm lượng dung dịch chuẩn glucosamin: 13000ppm
Bảng 3.4. Khảo sát tốc độ dòng khí mang Tốc độ (psi) Kết quả Spic tR (min) 20 8491085 5,955 30 9797965 5,028 40 9115005 5,362 50 7426664 5,363 55 7670667 5,413 60 6229692 6,071
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng khí mang N2
Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.4 và hình 3.11 ta thấy với tốc độ dòng khí mang từ 20psi - 60psi thì diện tích píc lớn nhất tại tốc độ 30psi (Spic =9797965 ). Trên sắc đồ ở điều kiện này cho chúng ta pic nhọn, không bị chẻ, không có hiện tượng kéo đuôi hay doãng pic. Như vậy, chúng tôi chọn tốc độ dòng 30psi