3.1.2.1. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi
Nhiệt độ ống bay hơi của detector ELSD có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển dòng dung môi chứa chất phân tích từ dạng lỏng thành dạng sương, nếu nhiệt độ qua thấp thì quá trình chuyển pha xảy ra chậm và không hoàn toàn, từ đó dẫn đến quá trình các chất lỏng không được chuyển thành dạng hơi hoàn toàn và một phần hóa lỏng đi vào phần thải gây mất chất phân tích. Mặt khác, nếu nhiệt độ quá cao, các hạt sương có kích thước nhỏ đi
nhanh vào vùng bay hơi theo dung môi cũng gây mất chất phân tích và làm giảm độ nhạy của phương pháp. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ ống bay hơi, kết quả được trình bày trên bảng 3.3 và hình 3.9. Cố định các thông số sau:
- Cột: Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm) - Tiền cột : Amino-Sherisorb (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector: ELSD
- Áp suất khí mang: 30psi
- Hệ pha động gồm: Kênh A: Nước cất 2 lần, kênh B: Acetonitril - Chương trình rửa giải: Gradient 3 (bảng 3.2)
- Tốc độ dòng cố định: 1ml/phút
- Hàm lượng dung dịch chuẩn glucosamin: 13000 ppm
Bảng 3.3. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi
Nhiệt độ Spic tR (min)
40 9193112 5,180 45 9447603 5,188 50 9797965 5,208 55 10197101 5,202 60 9784020 5,165 65 9155643 5,172 70 9017595 5,202 75 8985845 5.205
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nhiệt độ ống hóa hơi
Nhận xét:
Từ kết quả hình 3.9 và bảng 3.3, trong khoảng nhiệt độ ống bay hơi từ 40oC-75oC thì diện tích pic lớn nhất tại nhiệt độ 55oC (Spic =10197101). Đồng thời, tại giá trị nhiệt độ này trên sắc đồ cho pic nhọn, không có hiện tượng chẻ pic và kéo đuôi. Vì vậy, chúng tôi chọn điều kiện nhiệt độ ống bay hơi tối ưu cho quá trình phân tích là 55oC, sắc đồ phân tích glucosamin ứng với nhiệt độ này được thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, nhiệt độ ống bay hơi 55oC
3.1.2.2. Khảo sát tốc độ dòng khí mang
Tương tự nhiệt độ ống bay hơi, tốc độ dòng khí mang cũng có ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích. Dòng khí mang dùng tốc độ và áp suất đẩy dòng sương đi vào ống driff và buồng bay hơi. Nếu tốc độ dòng khí mang thấp không đẩy hết được toàn bộ dòng sương lỏng vào bộ phận bay hơi và phát hiện, dẫn đến giảm độ nhạy phân tích, đồng thời nếu còn dư lại trong ống driff (ống dẫn) thì có thể bị lẫn và gây nhiễm cho lần phân tích sau. Ngược lại, nếu tốc độ dòng khí mang lớn có thể làm bay hơi cả chất phân tích cùng với dung môi làm giảm độ nhạy của phương pháp. Vì vậy, tốc độ dòng khí mang cũng là một điều kiện cần khảo sát, kết quả được trình bày trên bảng 3.4 và hình 3.11. Cố định các thông số sau:
- Cột : Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm) - Tiền cột: Amino -Sherisorb (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột: 40oC
- Detector: ELSD
- Nhiệt độ ống bay hơi: 55oC
- Hệ pha động gồm: Kênh A: nước cất 2 lần; kênh B: Acetonitril - Chương trình rửa giải: Gradient 3 (bảng 3.7)
- Tốc độ dòng cố định: 1ml/phút
- Hàm lượng dung dịch chuẩn glucosamin: 13000ppm
Bảng 3.4. Khảo sát tốc độ dòng khí mang Tốc độ (psi) Kết quả Spic tR (min) 20 8491085 5,955 30 9797965 5,028 40 9115005 5,362 50 7426664 5,363 55 7670667 5,413 60 6229692 6,071
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng khí mang N2
Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.4 và hình 3.11 ta thấy với tốc độ dòng khí mang từ 20psi - 60psi thì diện tích píc lớn nhất tại tốc độ 30psi (Spic =9797965 ). Trên sắc đồ ở điều kiện này cho chúng ta pic nhọn, không bị chẻ, không có hiện tượng kéo đuôi hay doãng pic. Như vậy, chúng tôi chọn tốc độ dòng 30psi cho các nghiên cứu tiếp theo. Sắc đồ phân tích glucosamin bằng detector ELSD ứng với tốc độ dòng này được thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, tốc độ dòng khí mang 30psi
Như vậy, các điều kiện tối ưu cho quá trình xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC-ELSD được trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5. Các điều kiện tối ưu xác định glucosamin bằng phương pháp HPLC-ELSD
Thông số Điều kiện tối ưu HPLC-ELSD
Cột tách Amino-Sherisorb (250 mm×4,6mm, 5µm)
Tiền cột Amino-Sherisorb (10 mm x 4,6 mm, 5 µm) Nhiệt độ cột tách 40oC
Pha động Kênh A: H2O, kênh B: ACN
Chương trình gradient
Ban đầu giữ ở 75% kênh B trong 3 phút, sau đó giảm đến 45% kênh B trong 2 phút vа quay về 75% kênh B, giữ ở điều kiện trong 5 phút để ổn định cột cho phân tích các lần phân tích sau
Tốc độ dòng 1ml/phút
Nhiệt độ ống bay hơi 55oC Tốc độ dòng khí mang N2 30 psi Thể tích bơm mẫu 10µl