Nghiên cứu phát hiện một số glucocorticoid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu băng cao

Các chất này rất hay được trộn một cách khéo léo và tinh vi : ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc… vào thuốc đông dược có chỉ định điều trị thấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60 73 15

Người hướng dẫn khoa học: TS Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI, NĂM 2012

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Cao Sơn, người thầy đã tận tình hướng dẫn trực tiếp, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám giám hiệu, phòng quản lý đào tạo sau đại học, bộ môn hóa phân tích và các thày cô giáo trường Đại học Dược Hà nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường cũng như quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Trịnh Văn Lẩu, Thạc sỹ Phạm Thị Giảng là những người đã giúp đỡ, tạo các điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và làm luận văn

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sỹ Nguyễn Tuấn Anh, người đã giúp đỡ tôi rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong thời gian tôi thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám đốc và các bạn đồng nghiệp Khoa kiểm nghiệm đông dược-dược liệu- Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành tốt khóa học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012

DS Trịnh Thị Quy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 VÀI NÉT VỀ GLUCOCORTICOID 3

1.1.1 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các Glucocorticoid 3

1.1.2 Đặc tính của các glucocorticoid nghiên cứu Dexamethason 4

1.1.3 Các phương pháp định tính định lượng glucocorticoid 5

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 6

1.2.1 Phương pháp chiết trực tiếp 6

1.2.2 Phương pháp chiết lỏng lỏng 6

1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn 6

1.3 Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao 10

1.3.1 Khái niệm 10

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng 12

1.3.3 Ứng dụng 15

1.4 THỰC TRẠNG THUỐC ĐÔNG DƯỢC TRỘN TÂN DƯỢC 16

1.4.1 Vài nét về thuốc đông dược 16

1.4.2 Tình hình thuốc đông dược bị trộn trái phép tân dược 17

1.4.3 Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở trong nước 19

1.4.4 Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở ngoài nước 19

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Xây dựng đối tượng nghiên cứu 23

2.1.2 Chuẩn bị đối tượng nghiên cứu 23

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn 24

2.2.2 Thiết bị- dụng cụ 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Khảo sát phương pháp chiết 26

2.3.1.1 Khảo sát chiết trực tiếp: 26

2.3.1.2 Khảo sát chiết lỏng - lỏng: 26

2.3.1.3 Khảo sát chiết SPE: 26

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc ký 26

2.3.3 Đánh giá phương pháp 26

2.3.4 Áp dụng trên một số mẫu chế phẩm đông dược 27

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 29

3.1.1 Chiết trực tiếp 29

3.1.2 Chiết lỏng lỏng 31

3.1.3 Chiết pha rắn 33

3.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 36

3.3 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 36

3.4 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 37

3.4.1 Khảo sát độ đặc hiệu 37

3.4.2 Khảo sát tính tuyến tính 42

3.4.3 Khảo sát độ đúng 44

3.4.4 Khảo sát độ chính xác 48

3.4.4.1 Độ lặp lại 48

3.4.4.2 Độ chính xác trung gian: 50

3.4.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 52

3.4.5.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 52

3.4.5.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 57

3.5 ÁP DỤNG TRÊN MỘT SỐ MẪU THỬ 58

3.5.1 Chuẩn bị mẫu thử 58

3.5.2 Kết quả phân tích các mẫu thử 60

Chương 4 BÀN LUẬN 65

4.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 654.2 KÊT QUẢ ÁP DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MỘT SỐ MẪU THUỐC ĐÔNG DƯỢC 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

DAD Diode array Detector (detector chuỗi Diod)

GC-MS Gas Chromatography- Mass Spectrometry (Sắc ký khí khối phổ) HLB Hydrophilic Lipophilic Balance

HPLC High Perform Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS High Perform Liquid Chromatography - Mass Spectrometry (Sắc ký

lỏng khối phổ)

IR Infrared Spectrophotometry (Phổ hấp thụ hồng ngoại)

RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

SI Similarity index (Hệ số tương đồng)

SKĐ Sắc ký đồ

SPE Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn)

UFLC Ultra Fast Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng siêu nhanh)

UV – VIS Ultraviolet and Visible absorption Spectrophotometry (Phổ hấp thụ

tử ngoại khả kiến) USP 34 The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34)

YHCT Y học cổ truyền

BP 2010 The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loại pha tĩnh thường dùng trong SPE 8

Bảng 1.2: Lựa chọn pha tĩnh thường dùng trong SPE 9

Bảng 1.3: Một số phương pháp chiết glucocorticoid của một số tác giả 21

Bảng 1.4: Một số chương trình sắc ký của một số tác giả 22

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát chiết trực tiếp 30

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát chiết lỏng lỏng 32

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát chiết SPE: 35

Bảng 3.4: Kết quả so phổ các mẫu thử 41

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính của dexamethason, prednisolon acetat và dexamethason acetat 42

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason trên nền mẫu 1 44

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng đối với prednisolon acetat trên nền mẫu 1 45

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason acetat trên nền mẫu 1 45

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason trên nền mẫu 2 46

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng đối với prednisolon acetat trên nền mẫu 2 47

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng đối với dexamethason acetat trên nền mẫu 2 47

Bảng 3.12: Kết quả độ thích hợp của hệ thống 48

Bảng 3.13: Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu thử 1 49

Bảng 3.14: Kết quả độ lặp lại trên nền mẫu thử 2 50

Bảng 3.15: Kết quả độ chính xác trung gian trên nền mẫu 1 51

Bảng 3.16: Kết quả độ chính xác trung gian trên nền mẫu 2 51

Bảng 3.17: Kết quả so sánh độ lặp lại giữa hai lần thử nghiệm 52

Bảng 3.18: Kết quả giá trị đáp ứng của các glucocorticoid trong mẫu trắng 1 53

Bảng 3.19: Kết quả giá trị đáp ứng của các glucocorticoid trong mẫu trắng 2 55

Bảng 3.20: Các mẫu thuốc được phân tích 59

Bảng 3.21: Kết quả phân tích một số mẫu thuốc 62

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức hóa học của dexamethason 4

Hình 1.2: Công thức hóa học của Prednisolon acetat 4

Hình 1.3: Công thức hóa học của dexamethason aceatat 5

Hình 1.4: Cột SPE 7

Hình 1.5: Quá trình chiết pha rắn 10

Hình 1.6: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 25

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chiết trực tiếp 30

Hình 3.2: Sắc ký đồ khảo sát chiết lỏng lỏng 32

Hình 3.3: Sắc ký đồ khảo sát chiết SPE 34

Hình 3.4: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu 39

Hình 3.5: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch chuẩn 40

Hình 3.6: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch thử 1 40

Hình 3.7: Phổ các chất nghiên cứu trong dung dịch thử 2 41

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện tích pic (mAU.s) 43

Hình 3.9: SKĐ mẫu trắng 1 chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ 2 µg/ml 54

Hình 3.10: SKĐ mẫu trắng 2 chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ 2 µg/ml 55

Hình 3.11: SKĐ mẫu trắng chứa 3 chất nghiên cứu ở nồng độ LOD 57

Hình 3.12: Sắc ký đồ một số mẫu phát hiện có glucocorticoid 63

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xu hướng sử dụng thuốc đông dược trong điều trị bệnh đang gia tăng trong nước cũng như trên thế giới, đặc biệt là các bệnh mãn tính như : thấp khớp, hen phế quản, gout do thuốc đông dược dễ uống, ít tác dụng không mong muốn Tuy nhiên trên thực tế, nhiều cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền (YHCT) thậm chí nhiều nhà sản xuất lớn đã lén lút (trái phép) trộn thêm các loại tân dược hoặc chất cấm vào để tăng hiệu quả tức thời, cố tình lờ đi những biến cố nguy hiểm mà người bệnh có thể mắc phải khi dùng các sản phẩm này

Các tân dược được trộn thêm gồm nhiều nhóm khác nhau, trong đó đáng chú

ý là: nhóm thuốc tăng cường sinh lý, thuốc giảm béo, thuốc giảm đau hạ sốt, thuốc chống viêm, thuốc điều trị tiểu đường… [8], [20], [24]

Tại diễn đàn Hòa hợp YHCT khu vực Châu Á – Tây Thái Bình Dương (Forum in Herbal medicines Harmonisation, FHH) tổ chức tại Hà nội 11/2011, đã nhìn nhận vấn đề trộn trái phép tân dược vào chế phẩm đông dược là hiểm họa lớn Tất cả các sản phẩm này được coi là thuốc giả, lưu hành ở tất cả các nước trong khu vực và trên thế giới Từ tháng 11/2009 – 10/2011, đã ghi nhận tai biến ở 28 sản phẩm với 81 trường hợp tại 3 khu vực Hồng Kông, Nhật Bản và Singapore Hội nghị phòng chống thuốc giả toàn cầu (London, 5/2011) và Hội nghị phòng chống thuốc giả của các nước thuộc diễn đàn hợp tác kinh tế APEC (Bắc Kinh, 9/2011), cũng có báo cáo nhấn mạnh phải có biện pháp kỹ thuật và kiểm soát chặt chẽ các sản phẩm này

Nhóm glucocorticoid là thuốc chống dị ứng, chống viêm mạnh với nhiều tác dụng phụ, khoảng điều trị hẹp, cần được bác sỹ kê đơn và phải theo dõi khi dùng [4], [9], [16] Các chất này rất hay được trộn một cách khéo léo và tinh vi : (ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc…) vào thuốc đông dược có chỉ định điều trị thấp khớp, hen phế quản, gout… hay thuốc bổ do tác dụng nhanh, mạnh và tác dụng không mong muốn gây tích nước, béo phì giả tạo

Ở nước ta, Bộ y tế đã có công văn đình chỉ lưu hành hai mẫu thuốc: Tân hòa truy phong tê thấp thủy năm 2009 và Hạnh đức khu phong tê thấp thủy vào năm

2010 do các thuốc này đã trộn trái phép betamethasone [13] Ngoài ra còn có rất nhiều chế phẩm khác được phát hiện có tân dược như: Mẫu thuốc bột định xuyễn của Trung Quốc có Prednisolone acetat, Tăng phì hoàn của Đài loan, Nam liên truy phong thấu cốt hoàn của Trung Quốc có dexamethasone acetat [22], [24], [36] Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã phân tích một số mẫu thuốc đông dược có nghi ngờ trộn tân dược do bệnh nhân hay bác sỹ điều trị gửi tới Kết quả cho thấy phần lớn các mẫu này có chứa các glucocorticoid, trong đó hay gặp là prednisolone acetate, dexamethasone và dexamethasone acetat

Phương pháp phát hiện các chất thuộc nhóm glucocorticoid hiện nay được áp dụng cho dạng kem bôi da, thuốc bột, thuốc hoàn [12], [20], [22], [24], [33], chủ yếu ở mức độ sàng lọc, định tính Trong khi đó, việc xác định hàm lượng các chất này trộn trái phép trong thuốc đông dược rất cần thiết Trên thực tế các phương pháp trên cũng không thể áp dụng cho thuốc nước do kỹ thuật chiết tách cũng như phân tích trên nền mẫu thuốc nước phức tạp hơn Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài:

« Nghiên cứu phát hiện một số glucocorticoid trộn trái phép trong chế phẩm

đông dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao »

với mục tiêu :

- Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, prednisolon acetat, dexamethason acetat trong chế phẩm đông dược dạng thuốc nước bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD

- Áp dụng phương pháp xây dựng được trên một số chế phẩm đông dược dạng thuốc nước có nghi ngờ trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ GLUCOCORTICOID

1.1.1 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các Glucocorticoid

Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: mineralcorticoid có tác dụng trao đổi chủ yếu lên chất khoáng, glucocorticoid có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat carbon và các steroid sinh dục Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất là hydrocortison và cortison Glucocorticoid tổng hợp gồm rất nhiều chất khác nhau được nghiên cứu biến đổi công thức để cải thiện tác dụng, kéo dài thời gian tác dụng và giảm tác dụng phụ [10]

Tác dụng của glucocorticoid: Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể: Tác dụng trên chuyển hóa, trên các cơ quan và tuyến,… Trong đó tác dụng chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn tính như: thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang [4], [6], [9]

Tác dụng không mong muốn của glucocorticoid: phù, loét dạ dày tá tràng, suy thượng thận, tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em,…Những tác dụng này thường gặp ở những người dùng thuốc lâu dài hoặc dùng quá liều Một số tác dụng không mong muốn hay gặp:

- Gây suy tuyến thượng thận: do khi dùng thuốc glucocorticoid từ ngoài vào

cơ thể sẽ làm ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả năng bài tiết glucocorticoid của chính cơ thể người đó Lúc đó cơ thể hay mệt mỏi, nôn ói, nặng hơn nữa có thể gây huyết áp thấp hay tụt huyết áp

- Tăng cân do giữ muối nước, cơ thể bệnh nhân mập ra, bụng to, chân tay teo lại, da mỏng dễ bầm máu, nứt da bụng

- Loét dạ dày tá tràng

- Loãng xương: uống corticoid lâu ngày làm cho xương bị mỏng dần nên rất

dễ bị gãy xương

- Thai kỳ: có thể gây hại cho thai

- Làm trẻ em chậm phát triển chiều cao, dẫn đến bị lùn

Chỉ định của corticoid: Điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ hormon, bệnh tự miến, dị ứng, shock phản vệ, hen phế quản, viêm cơ khớp, viêm da,…

Liều dùng của glucocorticoid: Liều dùng glucocorticoid dao động rộng từ 0,5-20mg/ lần tùy thuộc tác dụng của thuốc và mục đích điều trị [4], [6], [9]

1.1.2 Đặc tính của các glucocorticoid nghiên cứu

Dexamethason C 22 H 29 FO 5 [4],[5],[10],[28],[29]

Dexamethason là 9-fluoro-11b, 17, 21-trihydroxy-16a-methylpregna-1,4- 3,20-dione

diene Tính chất: Không tan trong nước,

ít tan trong ethanol, hơi tan trong

methylen clorid, tan trong aceton

- Liều dùng: 0,5-10mg/ ngày

Hình 1.1: Công thức hóa học của dexamethason

Prednisolon acetat C23H30O6[5],[10],[28],[29]

Prednisolon acetat là 11b, 17-dihydroxy-3,20-dioxopregna,-1,4-dien-21-yl acetate

- Tính tan: không tan

trong nước, hơi tan

Dexamethason acetat C24H31FO6 [5],[10],[28],[29]

Dexamethason acetat là 9-fluoro-11b,17 - dihydroxy-16a-methyl-3,20-

dioxopregna-1,4-dien-21-yl acetate

- Tính chất: Không tan trong nước,

tan tự do trong aceton, cồn, hơi tan

trong methylen clorid

- Liều dùng trung bình: 0,5-10mg/

ngày

Hình 1.3: Công thức hóa học của dexamethason aceatat

1.1.3 Các phương pháp định tính định lượng glucocorticoid

- Định tính

+ Đo phổ hấp thụ UV VIS: Hòa tan mẫu hoặc tạo màu thích hợp, so với phổ của chất chuẩn Phương pháp này chỉ áp dụng cho nguyên liệu và một số chế phẩm có thành phần đơn giản [5], [10], [28]

+ Đo phổ hấp thụ hồng ngoại: so với phổ của chất chuẩn Phương pháp này áp dụng cho nguyên liệu, đa số chế phẩm không áp dụng được [5], [10], [28].+ Sắc ký lớp mỏng: Do đặc tính hấp thụ quang của các glucocorticoid, đa số các chất thuộc nhóm này được chiết và phân tích bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm hoặc phun thuốc thử hiện màu thích hợp [5],[10],[28],[29]

- Định lượng:

+ Dạng nguyên liệu, dạng viên nén, thuốc tiêm: Đo độ hấp thụ tử ngoại [5], [10], [28], [29]

+ Dạng thuốc kem: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [28], [29]

+ Dạng thuốc nước: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lớp mỏng điều chế và đo phổ hấp thụ tử ngoại [28], [29]

- Xác định tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [5], [28], [29]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU

1.2.1 Phương pháp chiết trực tiếp

- Chiết trực tiếp với dung môi hữu cơ là phương pháp chiết phổ biến nhất trong kiểm nghiệm thuốc nhằm hòa tan dược chất Tùy vào độ tan của dược chất và tính chất của dung môi mà người ta lựa chọn cách hòa tan như ngâm, khuấy, lắc cơ học, lắc siêu âm… Khi chiết trực tiếp, còn có thể thay đổi thời gian chiết, nhiệt độ… để tăng hiệu suất chiết [8]

- Phương pháp chiết trực tiếp thường được áp dụng cho các mẫu dạng rắn: thuốc bột, thuốc viên, dược liệu… hoặc dạng bán rắn như thuốc kem, thuốc mỡ

1.2.2 Phương pháp chiết lỏng lỏng

- Là phương pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang dung môi thứ hai không đồng tan với môi thứ nhất, cất thu hồi dung môi thu được chất phân tích Tùy vào bản chất chất phân tích và mục đích nghiên cứu có thể chiết dạng phân tử hay chiết cặp ion, chiết nội phức [3]

- Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: độ tan của chất phân tích trong dung môi, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hòa tan khác trong dung dịch

- Ứng dụng: Chiết lỏng lỏng được áp dụng khá phổ biến trong kiểm nghiệm các dạng thuốc dạng dung dịch như: thuốc nước, siro, rượu thuốc… hay các mẫu dịch sinh học như máu, nước tiểu… Ngoài ra, đối với mẫu phân tích dạng rắn, người ta chuyển vào pha nước rồi chiết lỏng lỏng tách các nhóm chất, tinh chế dịch chiết

1.2.3 Phương pháp chiết pha rắn

- Là quá trình tách một chất từ hệ phức tạp bằng một chất rắn được gọi là chất liên kết (sorbant) Bước tiếp theo là rửa giải chất đó bằng một dung môi hữu

cơ Các tài liệu tiếng anh gọi là SPE (Solid phase extraction) Kỹ thuật này đã được

sử dụng từ lâu để tinh chế dịch chiết trong chiết xuất lỏng - lỏng Công nghệ tiên tiến đã tạo ra nhiều chất liên kết chọn lọc, hiệu quả nên trong vài thập kỷ qua SPE ngày càng được ứng dụng rộng rãi SPE không chỉ được dùng độc lập mà còn được cài đặt vào các hệ GC/MS, HPLC/MS tạo thành một hệ phân tích tự động hoàn chỉnh (online-method) [2], [3]

Ngày nay SPE được áp dụng rộng rãi để chiết tách, tinh chế, làm giàu mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi lượng, môi trường… [3], [15], [19]

※ Một số loại cột và pha tĩnh thường dùng

Thân cột:Thường làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo

tinh khiết chịu dung môi (polypropylen), có dạng

hình trụ Cột rỗng được mô tả thể tích và chiều dài

thân cột, cũng có khi được mô tả đường kính trong

(ID) của thân và thể tích cột…

Hình 1.4: Cột SPE Pha tĩnh: Tương tự trong sắc ký lỏng, pha tĩnh dùng trong chiết pha rắn có 3 dạng:

pha thuận, pha đảo và trao đổi ion Ngoài ra người ta cũng dùng than hoạt tính, chất nhồi HLB hay dạng hỗn hợp chất nhồi pha đảo với trao đổi ion để nhồi vào cột SPE [15], [19] Một số loại pha tĩnh thường dùng được ghi trong bảng 1.1

Th©n cét chiÕt b»ng thuû tinh hoÆc polypropylen

Mμng läc b»ng PTFE Pha tÜnh

Bảng 1.1: Một số loại pha tĩnh thường dùng trong SPE

Lượng pha tĩnh trong cột thường là 50 mg, 100mg, 200mg, 500mg, 1g, 2g, 5g và 10g

※ Cơ chế chiết: Tương tự sắc ký lỏng [15], [19], [41].

Hấp phụ (pha thuận): Sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp

phụ Về cơ bản, sử dụng các điều kiện sắc ký pha thuận Chất hấp phụ hay được

dùng nhất là silica gel, magnesi silicat (Florisil®), nhôm oxyd

Phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã thay đổi, được gắn thêm các

nhóm chức hoá học khác nhau tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố Kiểu pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích (hoặc/và tạp chất) phân cực, cho phép các chất phân tích không (hoặc/và tạp chất) phân cực đi qua cột Kiểu này

thường sử dụng các dung môi ít hoặc không phân cực Kiểu pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngược lại với kiểu trên, dung môi sử dụng thường có độ phân cực nhất định

Trao đổi ion: Bề mặt chất hấp phụ được gắn với các nhóm chức có thể ion hoá Cơ

chế tách chiết tương tự sắc ký trao đổi ion

※ Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu thường qua 5 bước [40], [41], [42]

X Chọn loại cột pha rắn: Tùy thuộc kiểu chiết như mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức

độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lượng và loại pha tĩnh khác nhau (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Lựa chọn pha tĩnh thường dùng trong SPE

Mẫu

thử

Dung dịch nước (dịch sinh học, nước, dịch chiết nước, )

Pha hữu cơ (dịch chiết hữu cơ,chất tan hòa trong nhexan, chloroform,….) _| _ |

cation/ anion mạnh

DSC-SAX

DSC-SCX

DSC-WCX DSC-NH2

DSC-Si DSC-CN DSC-Diol DSC-NH2

Y Luyện cột: Luyện cột chiết pha rắn nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu

cần chiết và loại một số tạp chất còn ở trên cột

Z Chuyển mẫu vào cột chiết: Chuyển mẫu chiết lên cột, sau đó sử dụng áp suất

giảm hoặc áp lực đẩy hoặc để mẫu tự chảy bằng áp lực tỷ trọng

[ Rửa:Nếu chất quan tâm lưu trên cột, rửa tạp chất không lưu bằng dung dịch đã dùng để chuẩn bị mẫu hoặc bằng một dung dịch khác mà nó không rửa giải chất quan tâm

\ Rửa giải:Sử dụng lượng nhỏ dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại tạp chất không loại được trong quá trình rửa

Hình 1.5: Quá trình chiết pha rắn

làm sạch hóa chất bảo vệ thực vật từ mẫu dược liệu.So sánh với các kỹ thuật chiết lỏng- lỏng truyền thống, SPE đơn giản, thuận tiện hơn, và dễ dàng hơn

để tự động hóa Lợi thế của SPE là: (1) Lượng dung môi hữu cơ sử dụng ít hơn so với chiết lỏng lỏng Điều này đặc biệt có ý nghĩa, đặc biệt đối với những dung môi độc hại như chloroform, toluen; (2) thao tác đơn giản, không tốn thời gian và không cần xử lý mẫu trước khi chiết; (3) độ thu hồi và lặp lại tốt; (4) có thể tự động hóa Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn tương đối đắt, kỹ thuật SPE chưa được phổ biến rộng rãi, do đó phương pháp này chưa được áp dụng rộng rãi ở Việt Nam

1.3 Phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao [1],[5],[11]

1.3.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách

dưới dạng dung dịch Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là phương pháp phổ biến nhất hiện nay được sử dụng để định tính và định lượng trong phân tích kiểm nghiệm Ra đời từ năm 1967 - 1968 trên cơ sở phát triển

và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ

Trong HPLC, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu được ghi trên sắc đồ

Hình 1.6: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Pha tĩnh hay dùng nhất trong HPLC là pha tĩnh mà trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:

| |

– Si – O – Si – R

Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril pha động là dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau Cột thông dụng là cột ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10μm Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UFLC) vào ứng dụng rộng rãi Trong UFLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 - 2,2μm)

và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm)

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt Pha động có hai loại phân cực và ít phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient dung môi

Có nhiều loại detector khác nhau như detector tử ngoại - khả kiến VIS),tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối (MS) trong đó detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký Detector này có một hoặc hai mảng diod

(UV-để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser Quang phổ và sắc ký

đồ có thể hiển thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng

- Thời gian lưu (tR): là thời gian cần thiết để một chất tan dịch chuyển từ lúc

nó được nạp vào đầu cột sắc ký đến thời điểm được phát hiện ở nồng độ cực đại (Cmax) Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan

QSP VSP tR – t0 k’= = KD hoặc k’=

- Hệ số phân bố K : Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh Cs và trong pha động Cm tại thời điểm cân bằng

Khi nồng độ chất tan không quá lớn thì K là một hằng số và phụ thuộc vào bản chất hai pha và nhiệt độ Đối với một chất K càng lớn thì nồng độ chất tan trong pha tĩnh càng lớn vì vậy tR lớn và ngược lại

- Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor): mô tả tốc độ di chuyển của một chất

Ta có:

Trong đó: QSP, QMP: lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động

VSP, VMP: thể tích lưu và thể tích chết của cột (thể tích pha

động có trong cột từ nơi tiêm mẫu đến detector) Vậy k’ phụ thuộc bản chất 2 pha, chất phân tích, nhiệt độ và đặc điểm cột (VSP/VMP) k’<<1 quá trình rửa giải nhanh nên khó xác định chính xác tR Ngược lại nếu k’ quá lớn (20 - 30) quá trình rửa giải quá dài Thực tế chọn điều kiện phân tích sao cho k’ = 1-5 là tối ưu

- Hệ số chọn lọc α (Selectivity factor): là đại lượng đặc trưng cho tốc độ

di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B

Cs

K =

Cm

Theo quy ước: KB> KA → tR,B> tR,A nên α > 1

α khác 1 càng nhiều thì thì khả năng tách càng rõ ràng (α từ 1,05 đến 2,0 là tối ưu)

- Độ phân giải R (Resolution)

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau Độ phân giải giữa 2 píc (píc

số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:

−

=+

−

=

1

14

)(

18,1)(

2

2 / 1 2

/ 1

, , ,

,

W W

t

t W

W

t t R

B

B A

B

A R B R A

B

A R B R s

N

αα

với: W là độ rộng đáy pic

Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu

là R=1,0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn vì vậy khi tính diện tích pic sẽ không chính xác

- Hệ số bất đối AF(assymetry factor)

a

2

20 / 1

=Trong đó:

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a: khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong phép định lượng thì yêu cầu AF nằm trong khoảng 0,8-2

- Số đĩa lý thuyết N (Theoretical plates):là đại lượng biểu thị Hiệu lực của

cột sắc ký trong điều kiện sắc ký nhất định

Có thể tính số đĩa lý thuyết N theo các công thức sau:

N

2 / 1

54 , 5 16

2 2

h

N

2 2

28 , 6

2 π

trong đó: h: chiều cao pic A: diện tích của pic

Ngoài ra, người ta còn quan tâm tới hệ số match (một số phần mềm dùng SI- similarity index) để đặc trưng cho mức độ tương đồng các pic khi so phổ đồ

Khi giá trị này càng gần với 1 thì độ tương đồng càng cao

1.3.3 Ứng dụng

- Định tính:

Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở của phép thử định tính Trên các máy HPLC hiện đại với detector diod array ta có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index)

- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại

- Phương pháp dùng chuẩn nội

- Phương pháp thêm chất chuẩn

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích

Về cơ sở của cách thử tạp chất cũng giống như định lượng Ngoài ra, đối với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chất chuẩn thì có thể tính tỉ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp so với hoạt chất

1.4 THỰC TRẠNG THUỐC ĐÔNG DƯỢC TRỘN TÂN DƯỢC

1.4.1 Vài nét về thuốc đông dược

Theo tổ chức y tế thế giới, thuốc đông dược là những chế phẩm được làm từ thảo dược hay động vật được chế biến theo các phương pháp cổ truyền nhằm mục đích phòng bệnh, chữa bệnh

Ở nước ta, bên cạnh các cơ sở điều trị bằng YHCT (bắt mạch, kê đơn thuốc,

sử dụng thuốc thang), có nhiều cơ sở sản xuất thuốc đông dược với các dạng bào chế tiện lợi như: Hoàn cứng, hoàn mềm, thuốc nang, thuốc nước, siro, rượu thuốc,…Số đăng ký thuốc đông dược qua các năm tăng khá nhanh, chiếm khoảng 20% tổng số các thuốc được cấp số đăng ký Ngoài ra, thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược cũng phát triển mạnh mẽ Chỉ định của các chế phẩm này rất phong phú, từ các bệnh cấp tính, mãn tính đến thuốc bổ dưỡng, thực phẩm chức năng, áp dụng cho nhiều đối tượng bệnh nhân ở các lứa tuổi khác nhau Các thuốc đông dược và thực phẩm chức năng lại được bán tự do không cần đơn Đây là cơ hội tốt cho người bệnh lựa chọn các sản phẩm để điều trị hiệu quả, tuy nhiên, cũng

là thách thức lớn cho các cơ quan quản lý chất lượng khi các cơ sở không thực hiện tốt việc cam kết chất lượng

Theo thống kê, số thuốc đông dược không đạt chất lượng tăng mạnh vào năm

2008, trong đó có một số mẫu trộn trái phép tân dược và được coi như thuốc giả

Điều trị bệnh mãn tính như thấp khớp hay hen phế quản được nhiều người tìm đến thuốc đông dược Bệnh nhân có thể khám bệnh, bốc thuốc tại các cơ sở hành nghề y học cổ truyền được cấp phép Đôi khi họ cũng nghe mách bảo để điều trị ở những cơ sở không có giấy phép, khi có vấn đề liên quan đến chất lượng thuốc không đảm bảo, cơ quan chức năng gặp khó khăn trong xử lý Ngoài ra có rất nhiều dạng chế phẩm được bào chế ở dạng tiện dụng và bày bán ở các hiệu thuốc mà

không cần đơn Các chế phẩm này có công thức rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên phần lớn là dựa trên các bài thuốc cổ phương gia giảm Ví dụ thuốc điều trị thấp khớp gia giảm từ bài độc hoạt tang ký sinh thang, thuốc bổ dưỡng đa số gia giảm từ bài tứ quân, tứ vật hoặc thập toàn đại bổ, thuốc ho hen gia giảm từ bài nhị trần thang…

1.4.2 Tình hình thuốc đông dược bị trộn trái phép tân dược

Xu hướng thế giới cũng như ở Việt nam quay về với các sản phẩm nguồn gốc tự nhiên do tính an toàn đã được khẳng định hàng ngàn năm Lợi dụng tâm lý thích sử dụng thuốc đông dược của người bệnh, nhiều cơ sở lén lút trộn thêm tân dược để giảm nhanh triệu chứng của bệnh, nhờ vậy, họ bán được số lượng nhiều với giá cao và trục lợi Tuy nhiên việc này dễ gây tai biến, dị ứng thuốc cho bệnh nhân Thậm chí đã có bệnh nhân phải nhập viện trong tình trạng nguy kịch như suy thận cấp, suy hô hấp… do quá liều hay dị ứng thuốc tân dược bị trộn lẫn [8], [36], [43] Điều này xảy ra do người bệnh chủ quan dùng không đúng chỉ dẫn, hoặc dùng kèm

cả thuốc tân dược đang điều trị tại các bệnh viện gây quá liều Cũng có thể do việc trộn thêm tân dược khó kiểm soát hàm lượng, cách chia liều uống của bệnh nhân khó chính xác (mỗi lần một thìa cà phê, thìa con, thìa sữa chua, một phần mười gói )

Các nhóm thuốc tân dược hay được trộn thêm vào thuốc đông dược: Thuốc chữa tiểu đường, thuốc giảm đau hạ sốt, các glucocorticoid, thuốc kháng histamin, thuốc an thần gây ngủ, các dẫn chất sidenafil…Các mẫu thuốc đông dược hay bị lợi dụng để trộn thêm tân dược thường gặp ở nhóm thuốc chữa thấp khớp, hen và thậm chí có cả ở thuốc bổ Điều này có thể hiểu được do các glucocorticoid có tác dụng chống viêm, chống dị ứng mạnh và tác dụng không mong muốn gây thèm ăn, giữ nước, tăng cân Bệnh nhân điều trị lâu dài bằng những loại thuốc này có triệu chứng béo phì giả tạo do giữ nước, tuy nhiên cũng có thể gặp những tai biến nặng nề

Năm 2010 đã phát hiện cơ sở sản xuất thuốc YHCT Hinh hòa có mẫu khu phong tê thấp thủy, và Truy phong tê thấp thủy bị trộn betamethason[13] Gần đây, tháng 2-2011, theo công văn của trung tâm kiểm nghiệm dược mỹ phẩm Đà Nẵng, viện kiểm nghiệm thuốc trung ương kiểm tra phát hiện mẫu Thuốc bổ tỳ tâm của

Phước Lợi Đường-Đà Nẵng có trộn cyproheptadin và dexamethason Sau đó, cơ sở này vẫn tiếp tục sản xuất thuốc tương tự với tên gọi Thuốc Bổ Tỳ trộn trái phép dexamethason và bị phát hiện vào tháng 9-2012 [38]

Trên thực tế, có một số người hành nghề YHCT tư nhân (chủ yếu là hành nghề không phép) trộn thêm tân dược vào bột thuốc đông dược và cho bệnh nhân dùng kèm thuốc thang Năm 2009, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương phát hiện Thuốc thận khí hoàn của ông lang Hiếu - Bắc Giang có trộn glibenclamide Thuốc giải biểu hoàn của ông lang Hiếu- Bắc Giang và thuốc chỉ thống của một ông lang ở thuận thành Bắc Ninh có trộn paracetamol [13] Một số mẫu thuốc kem bôi chàm mua tại chợ Hàng Da, chợ Thái Hà- Hà Nội có trộn triamcinolon Một số mẫu thuốc đông dược điều trị gout bị phát hiện có paracetamol hoặc indomethacin hoặc dexamethasonacetat Năm 2011, chương trình khảo sát an toàn thuốc đông dược của WHO đã phát hiện mẫu Thuốc chữa bệnh xương khớp, Thuốc trị viêm đại tràng mua tại một cơ sở tại Yên Bái có chứa dexamethason acetat Chất này cũng bị trộn vào thuốc bột chữa ho, hen bán tại một cơ sở tại Hà Nội

Ngoài ra có các mẫu thuốc do các cá nhân gửi để phát hiện tân dược khi người dùng thuốc có biểu hiện của tác dụng không mong muốn nặng nề: suy thượng thận (một bệnh nhân của khoa cấp cứu bệnh viện Bạch Mai), phù nặng (một bệnh nhân của khoa chống độc), Hai mẫu này được phát hiện có dexamethason acetat,

Các chế phẩm thuốc đông dược nhập khẩu bán trôi nổi trên thị trường Việt Nam cũng bị phát hiện có trộn trái phép tân dược: thuốc dân tộc cứu nhân vật của Campuchia trộn 5 loại tân dược: paracetamol, chlopheniramin, cyproheptadin, diazepam và dexamethason Thuốc tăng phì hoàn của Đài Loan có trộn cyproheptadin và dexamethason, Nam liên truy phong thấu cốt hoàn của Trung Quốc có dexamethason acetat [22], [24], [36]

Việc trộn thêm tân dược vào đông dược không chỉ là vấn đề của riêng nước

ta mà là vấn đề chung của các nước trong khu vực như: Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Nhật Bản, Campuchia,… Theo Yee Shen Kuan, năm 2009 tại Singapore phát hiện phenolphtalein trong thuốc Pochai Pills, paracetamol trong Qing Xin Dao

Chi Pian[36] Các thuốc đông dược bị trộn thêm tân dược hay gặp ở Nhật là dẫn chất của sidelnafil Tại Na uy và Singapore cũng phát hiện các thuốc chữa xương khớp có trộn dexamethason và indomethacin [43] Theo báo cáo tại hội nghị hòa hợp thuốc đông dược khu vực châu Á thái bình dương, nhiều mẫu thuốc đông dược điều trị ho, hen, thấp khớp bị phát hiện có trộn prednisolon hoặc dexamethason [24]

Như vậy có thể thấy tình hình thuốc đông dược trộn trái phép thuốc tân dược đang xảy ra rất phổ biến và được phát hiện ở các vùng miền, từ các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Đà Nẵng đến các vùng xa như Bắc Giang, Yên Bái, Bình Định Các đối tượng bị trộn tân dược cũng rất đa dạng và phong phú, chủ yếu là các thuốc không có số đăng ký bán trôi nổi trên thị trường Trong đó nhóm thuốc đông dược bị trộn glucocorticoid hay gặp nhất và cũng gây ra nhiều tác hại cho người tiêu dùng và gây bức xúc trong dư luận [37], [38], [39], [43]

1.4.3 Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở trong nước

Trước thực tế đặt ra, đã có nhiều nhóm nghiên cứu phát hiện tân dược trộn trái phép trong đông dược Hoàng Thanh Tâm nghiên cứu phát hiện glucocorticoid trong kem bôi da bằng HPLC-DAD [12], Trần Thị Hoàng Chi nghiên cứu phát hiện glucocorticoid trong thuốc đông dược dạng thuốc bột Một số nhóm nghiên cứu phát hiện glucocorticoid trong thuốc đông dược dạng thuốc bột, hoàn cứng bằng sắc

ký lớp mỏng [7] Các nghiên cứu này đa số ở mức độ phát hiện định tính Trong khi

đó, việc xác định chính xác hàm lượng của các chất này trộn lẫn trong đông dược có

ý nghĩa quan trọng trong công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc Phát hiện tân dược trộn trong thuốc đông dược cũng là một trong những định hướng cho mạng lưới kiểm nghiệm trong các năm tới, khi mà đã có tới khoảng bảy mươi phần trăm các trung tâm kiểm nghiệm có trang bị HPLC [13]

Chưa có phương pháp nào được đưa ra để phát hiện các glucocorticoid trong chế phẩm đông dược dạng thuốc nước

1.4.4 Nghiên cứu phát hiện glucocorticoid ở ngoài nước

Nghiên cứu định tính định lượng các glucocorticoid trộn trái phép vào thuốc đông dược, thực phẩm chức năng hay mỹ phẩm đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu Do nền mẫu thuốc đông dược tương đối phức tạp và việc định hướng hoạt chất bị trộn trái phép gặp khó khăn nên các tác giả Trung Quốc vẫn sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng để sàng lọc [32],[33],[34]

Một số tác giả đã đặt vấn đề định lượng glucocorticoid trong thuốc đông dược bằng sắc ký lỏng Đa số các nghiên cứu đưa ra phương pháp phân tích bằng HPLC-MS hoặc HPLC MS-MS [16],[22],[23] Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, hệ thống HPLC-MS đắt tiền và không phổ biến so với HPLC-DAD Một số tác giả dùng detector khác hoặc phương pháp khác để phát hiện các glucocorticoid.[27],[30]

Ngày nay hệ thống HPLC- DAD khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại các phòng thí nghiệm Vì vậy cũng có nhiều tác giả tập trung theo hướng này Tuy nhiên, các nghiên cứu đa số tập trung vào dạng thuốc bột, thuốc hoàn, thuốc nang [7],[21],[35] Các phương pháp xử lý này không áp dụng cho thuốc nước được

Việc phát hiện các tân dược gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là trong dạng thuốc nước do thành phần của dạng thuốc nước rất đa dạng và phức tạp, bản thân nhóm thuốc glucocorticoid cũng gồm nhiều chất với đặc tính và liều dùng khác nhau

Vì vậy, việc xây dựng được một phương pháp khoa học, đáng tin cậy, dễ áp dụng rộng rãi để có thể phát hiện glucocorticoid trong chế phẩm đông dược dạng thuốc nước là rất cấp thiết, góp phần ngăn chặn những hậu quả đáng tiếc cho người bệnh, loại trừ những sản phẩm kém chất lượng, giữ uy tín cho các sản phẩm đông dược lưu hành trên thị trường

Một số phương pháp chiết và các chương trình sắc ký của một số tác giả được liệt kê trong bảng 1.3 và bảng 1.4

Bảng 1.3: Một số phương pháp chiết glucocorticoid của một số tác giả

Tác giả Nền mẫu PP chiết Dung môi/cột Tác

BP 2010 [28]

Thuốc nước

Pha loãng

Methanol-nước (9:1) Dược điển Mỹ

USP 34 [29]

Thuốc nước

Pha loãng, lỏng lỏng

Methanol-nước (1:1) Ethyl acetat Ly tâm Andersen JH và

Trực tiếp

Cloroform-methanol (9:1)

Ly tâm 68,0-107,2%

Bảng 1.4: Một số chương trình sắc ký của một số tác giả

Nước - ACN (56:44)

1,0 ml/phút

UV (240nm) Trần Thị Hoàng

Chi [7]

C18, 5µm (15cm×4,6mm)

Nước - ACN (55:45)

1,3 ml/phút

DAD (240nm)

300C

Dược điển Anh

BP 2007 [28]

C18, 5µm (25cm×4,6mm)

Nước - ACN (75:25)

2,5 ml/phút

DAD (254nm)

450C

USP 34 [29] C18, 5µm

(25cm×4,6mm)

Nước - ACN (75:25)

2,5 ml/phút

DAD (239nm) Dongmei

Chenet al., [18]

C18, 5µm (25cm×4,6mm)

Acid formic 0,2% - ACN (gradient)

1,0 ml/phút

MeOH - ammonium acetat- ACN (gradient)

0,8 ml/phút

DAD (240nm)

300C

HUANG Ping

[22]

C18, 5µm (25cm×4,6mm)

ammonium MeOH (30:70)

format-0,4ml/phút

DAD (270nm)

ammonium acetat 0,1mmol/L-ACN (gradient)

1,0 ml/phút

DAD (240nm)

XU Ya-ling

[35]

C18, 5µm (25cm×4,6mm)

Nước- ACN (24:76)

1,0 ml/phút

DAD (254nm)

300C

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Xây dựng đối tượng nghiên cứu

Qua tham khảo tài liệu tham khảo và tình hình thuốc đông dược bị trộn

glucocorticoid chúng tôi nhận thấy các chế phẩm đông dược này đa số có công

dụng chữa thấp khớp và thuốc bổ dưỡng.[7],[23],[39]

Trong nhóm thuốc chữa thấp khớp, Độc hoạt tang ký sinh thang là một bài

thuốc cổ phương có thành phần từ 15 vị thuốc với các nhóm hoạt chất đa dạng Đây

cũng là bài thuốc được rất nhiều cơ sở sản xuất, gia giảm thành các dạng bào chế

khác nhau Vì vậy chúng tôi lựa chọn bài thuốc này để xây dựng công thức mẫu

trắng 1 và mẫu tự tạo 1

Đối với nhóm thuốc bổ dưỡng, chúng tôi lựa chọn bài thuốc thập toàn đại bổ

gồm 10 vị thuốc để xây dựng công thức mẫu trắng 2 và mẫu tự tạo 2 Bài thuốc này

đã bao gồm hai bài cổ phương là tứ quân (đảng sâm, bạch linh, bạch truật, cam

thảo) có tác dụng bổ khí và tứ vật (xuyên khung, đương quy, thục địa, bạch thược)

có tác dụng bổ huyết, gia thêm hoàng kỳ, nhục quế

Chúng tôi thêm các chất glucocorticoid nghiên cứu vào công thức với lượng

tương ứng khoảng 0,5 mg mỗi chất vào 10 ml mẫu thử Đây là mức liều uống tối

thiểu của glucocorticoid

2.1.2 Chuẩn bị đối tượng nghiên cứu

♦ Chuẩn bị mẫu tự tạo 1 (TT1): Chuẩn bị mẫu đông dược có công dụng chữa thấp

khớp theo công thức bài độc hoạt tang ký sinh thang, có thêm 3 glucocorticoid:

- Cân dexamethason, prednisolon acetat, dexamethason acetat hòa tan trong

10ml ethanol

- Cân các dược liệu, thêm nước cho ngập, đun sôi nhẹ trong 3 giờ, lọc qua

bông, cô trên cách thủy đến khi còn khoảng 150 ml, thêm 3 chất

glucocorticoid đã hòa trong ethanol ở trên, thêm đường, natri benzoat, khuấy

kỹ, để nguội, thêm nước vừa đủ

♦ Chuẩn bị mẫu tự tạo 2 (TT2): Chuẩn bị mẫu đông dược có công dụng bổ dưỡng

theo bài thập toàn đại bổ, có thêm 3 chất glucocorticoid:

Bào chế mẫu TT2 tương tự mẫu TT1

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất- thuốc thử- chất chuẩn

- Các chất đối chiếu hóa học:

+ Dexamethason: chất đối chiếu hóa học quốc gia, SKS: 0197025, hàm

- Acetonitril loại dùng cho HPLC

- Cloroform, ethyl acetat, aceton, methanol, ethanol: loại tinh khiết phân tích

2.2.2 Thiết bị- dụng cụ

Các thiết bị dụng cụ tại Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương (được hiệu

chuẩn theo ISO/IEC 17025 và GLP) gồm có:

- Máy lắc siêu âm

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204

- Cân kỹ thuật SARTORIUS BP 310S

- Máy hút chân không

- Bộ chiết xuất pha rắn (hình 2.1.c)

- Dụng cụ thủy tinh các loại

a: Máy HPLC Hitachi b: Máy HPLC Shimadzu

c: Bộ chiết pha rắn

Hình 2.1: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Khảo sát phương pháp chiết

- Mục đích: tìm được phương pháp chiết có hiệu suất chiết cao, loại được nhiều tạp chất Phương pháp chiết phải đơn giản dễ tiến hành, nhanh chóng,

- Tiến hành chiết các chất nghiên cứu trong mẫu tự tạo bằng các cách khác nhau Định lượng hoạt chất theo quy trình đã lựa chọn Đánh giá và tìm ra cách chiết phù hợp

2.3.1.1 Khảo sát chiết trực tiếp:

- Chiết các mẫu tự tạo bằng cách cô tới cắn rồi chiết bằng dung môi khác

nhau, tiến hành phân tích So sánh hiệu suất chiết giữa các dung môi

2.3.1.2 Khảo sát chiết lỏng - lỏng:

- Chiết các mẫu tự tạo bằng cách lắc lỏng lỏng với các dung môi khác nhau,

tiến hành phân tích So sánh hiệu suất chiết giữa các dung môi

2.3.1.3 Khảo sát chiết SPE:

- Chiết các mẫu tự tạo với bộ chiết pha rắn, dung các loại cột khác nhau tiến

hành phân tích So sánh hiệu suất chiết giữa các loại cột

2.3.2 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp ba chất nghiên cứu trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector (DAD) nhằm lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp

2.3.3 Đánh giá phương pháp

Chiết các mẫu nghiên cứu theo cách chiết đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

♦ Tính đặc hiệu:Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không cho pic có thời gian lưu

tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn

♦ Khảo sát tính tuyến tính

Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương quan tuyến

tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ cần đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x)

Xây dựng đường chuẩn 6 điểm (X1 đến X6) của dung dịch có chứa chất chuẩn dexamethason, prednisolon acetat, dexamethason acetat ở trong khoảng nồng

độ phù hợp

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r của từng chất

♦ Khảo sát độ đúng

Áp dụng quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng Tiến hành trên ba điểm hàm lượng 80%, 100% và 120% nồng độ định lượng Tính tỷ lệ lượng chuẩn thu hồi lại được và lượng chuẩn thêm vào để có hiệu suất chiết hay độ đúng của phương pháp

- Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác (Shimadzu)

♦ Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD) của mỗi chất được xác định dựa vào hệ số góc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của đáp ứng

- Giới hạn định lượng (LOQ) được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện

2.3.4 Áp dụng trên một số mẫu chế phẩm đông dược

- Thu thập một số chế phẩm đông dược dạng thuốc nước có công dụng: chữa

khớp, thuốc bổ, thuốc ho hen,… hoặc mẫu thuốc do các cá nhân, đơn vị nghi ngờ gửi tới

- Tiến hành phân tích các mẫu thử trên theo quy trình đã xây dựng, định tính (định lượng - nếu có) các chất nghiên cứu trên

- Tiến hành phân tích mẫu thử thêm chuẩn theo điều kiện đã khảo sát, định lượng các chất nghiên cứu trên

- Tính độ thu hồi của mẫu thử thêm chuẩn

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào công thức hoặc dựa vào các hàm

số trong Microsoft Excel

- Tính giá trị trung bình:

- Tính độ lệch chuẩn:

(có thể tính toán bằng hàm Stdev trong Microsoft Excel)

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:

y = ax + b

- Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel

- Hệ số chắn b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel

- Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel

∑

=

i xin

% 100

×

=

X S RSD

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT

3.1.1 Chiết trực tiếp

Do các glucocorticoid tan trong chloroform và aceton, chúng tôi dùng hai dung môi này làm dung môi chiết để tiến hành khảo sát chiết trực tiếp

™ Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn

- Dung dịch thử 1: Lấy chính xác 10 ml mẫu tự tạo 1, bốc hơi trên cách thủy đến cạn Khuấy 3 lần, mỗi lần bằng 10 ml dung môi chiết Gạn lấy các dịch chiết, bốc hơi trên cách thủy đến cạn Hòa tan cắn bằng methanol vừa đủ 10 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử 2: Lấy chính xác 10 ml mẫu tự tạo 2 làm tương tự mẫu tự tạo1

- Dung dịch chuẩn: Cân và pha các chất nghiên cứu trong methanol để được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 50 µg/ml mỗi chất, lọc qua màng lọc 0,45 µm

™ Tiến hành: Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn được ở mục 3.2

™ Tính toán kết quả: Tính hàm lượng các chất nghiên cứu chiết được từ 2 mẫu

tự tạo, so sánh với hàm lượng thực tế các chất này được thêm vào công thức (hiệu suất chiết)

Kết quả thu được như ở hình 3.1, bảng 3.1

a: SKĐ mẫu tự tạo 1 chiết bằng cloroform b:SKĐ mẫu tự tạo 2 chiết bằng cloroform

c:

SKĐ mẫu tự tạo 1 chiết bằng aceton d:SKĐ mẫu tự tạo 2 chiết bằng aceton

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chiết trực tiếp

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát chiết trực tiếp

Dexa methason

Prednisolon acetat

Dexamethason acetat

Dexa methason

Prednisolon acetat

Dexamethason acetat

Nhận xét:

- Sắc ký dồ mẫu thử chiết trực tiếp tương đối sạch Tuy nhiên thực tế khi

phân tích dịch chiết trực tiếp bằng dung môi hữu cơ, áp suất cột tăng nhanh, có thể

do mẫu thử còn nhiều tạp

- Hiệu suất chiết thấp, cao nhất chỉ đạt 65,0% Hiệu suất chiết khác nhau nhiều giữa hai mẫu, đối với cả 3 chất phân tích và trên cả hai dung môi chiết là cloroform và aceton

3.1.2 Chiết lỏng lỏng

Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi thấy một số tác giả dùng ethyl acetat để chiết glucocorticoid Ngoài ra cloroform hòa tan được các chất này và không đồng tan với nước Vì vậy, chúng tôi dùng hai dung môi này làm dung môi chiết để tiến hành khảo sát chiết lỏng lỏng

™ Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn

- Dung dịch thử 1: Lấy chính xác 10 ml mẫu tự tạo 1, lắc kỹ 3 lần với dung môi chiết, mỗi lần 10 ml, để yên cho tách lớp (Ly tâm nếu nhũ hóa) Gạn lấy lớp dung môi hữu cơ, bốc hơi trên cách thủy đến cạn Hòa tan cắn bằng methanol vừa

đủ 10 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử 2: Lấy chính xác 10 ml mẫu tự tạo 2 làm tương tự mẫu tự tạo1

- Dung dịch chuẩn: Cân và pha các chất nghiên cứu trong methanol để được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 50µg/ml mỗi chất, lọc qua màng lọc 0,45µm

™ Tiến hành: Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn được ở mục 3.2

™ Tính toán kết quả: Tính hàm lượng các chất nghiên cứu chiết được từ 2 mẫu

tự tạo, so sánh với hàm lượng thực tế các chất này được thêm vào công thức (hiệu suất chiết)

Kết quả thu được như ở hình 3.2 và bảng 3.2