Phát hiện nhanh một số corticoid pha trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng kĩ thuật khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp

Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát điều kiện và khả năng phát hiện một số corticoid phổ biến pha trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp. Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN NHANH MỘT SỐ CORTICOID PHA TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG KĨ THUẬT KHỐI PHỔ VỚI CHẾ ĐỘ TIÊM MẪU TRỰC TIẾP Nguyễn Quang Nam*, Trần Hùng** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát điều kiện khả phát số corticoid phổ biến pha trộn trái phép chế phẩm đông dược phương pháp khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp Đối tượng: Chất chuẩn corticoid chuẩn cung cấp Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM Các mẫu thuốc đông dược thu mua nhà thuốc hay mua bán trôi địa bàn TPHCM Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng thuốc giả lập từ khảo sát, xây dựng qui trình chiết corticoid pha trộn Tối ưu hóa điều kiện vận hành thiết bị khối phổ Quatromicro API chế độ ghi nhận ESI+ ESI- từ xác định điều kiện chung áp dụng cho định tính phát corticoid sử dụng nghiên cứu Khảo sát mẫu có pha trộn trái phép corticoid dựa so sánh với phổ corticoid chuẩn Kết quả: Đã tìm phương pháp xử lý mẫu để chiết corticoid từ công thức giả lập Đã chọn điều kiện phân tích khối phổ, xác định ion mẹ ion phân mảnh để phát corticoid pha trộn mẫu giả lập mẫu thử Đã tìm giới hạn phát corticoid mẫu chuẩn mẫu giả lập thêm chuẩn Đã ứng dụng quy trình phân tích để phát corticoid mẫu thuốc đông dược thị trường Kết 24 mẫu phân tích, phát có 18 mẫu pha trộn trái phép corticoid Kết luận: từ kết đạt cho thấy phương pháp phổ khối với chế độ tiêm mẫu trực tiếp phương pháp hữu dụng, đơn giản đáng tin cậy việc xác định chất pha trộn trái phép chế phẩm thuốc đông dược Từ khóa: tiêm mẫu trực tiếp, corticoid, chế phẩm đơng dược, khối phổ ABSTRACT RAPID DETERMINATION OF CORTICOID ADULTERANTS IN HERBAL MEDICINES USING ELECTROSPRAY IONIZATION MASS SPECTROMETRY – DIRECT INJECTION MODE Nguyen Quang Nam, Tran Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 633 - 641 Objective: Investigation of optimum MS conditions and screening ability to detect some common corticoid adulterants in herbal medicines by using mass spectrometry with direct injection mode Subjects: Authenticated standards of dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone acetat, dexamethasone acetate were purchased from Drug Quality Control Institute at HCM city Herbal medicines were purchased in oriental drugstores or float market Method: Establishing a simulation formulas for development of an extraction method to analyze some corticoids adulterant and invetigation of optimum MS conditions for detecting corticoids in herbal medicines The Quatromicro API instrument operated in modes ESI+ and ESI- was used for MS investigations *Labo hóa hợp chất tự nhiên,Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM **Bộ Môn Dược Liệu, Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com Chuyên Đề Dược Khoa 633 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Results: A method for sample preparation and the optimized MS conditions for detection of corticoids in herbal medicines were established Charateristics of mother ions of corticoid standards, which were spiked in blank herbal matrix at concentration of 1ppm were still detectable in spectra, The results were more clearly in MS/MS mode in either ESI+ or ESI- with limit of detection (LOD) of corticoids ranged from 0,1 ppm to 0,5 ppm Application of analysis methods was performed in real samples of herbal medicines Among 24 herbal products investigated, 18 samples were adulterated with corticoids Conclusion: MS direct infusion was proven to be a useful and reliabe method to identify corticoids in counterfeit products Key words: corticoid, herbal medicines, electrospray ionization, mass spectrometry, direct injection cách sử dụng phương pháp khối phổ với chế MỞ ĐẦU độ tiêm mẫu trực tiếp Trong thập kỉ trở lại đây, thuốc có THỰC NGHIỆM nguồn gốc tự nhiên ngày thể vai trò quan trọng cơng tác chăm sóc sức khỏe Đối tượng nghiên cứu người xem tương đối an tồn Chuẩn dexamethason, betamethason, tác dụng phụ Tuy nhiên, đa số prednison, prednisolon, hydrocortison acetat, thuốc từ dược liệu cần thời gian điều trị tương dexamtethason acetat (Hình 1) mua đối dài thuốc phát huy tác dụng Vì mục Viện kiểm nghiệm TP.HCM Các mẫu thuốc tiêu lợi nhuận hay nhằm gia tăng tác động trị đông dược thu mua nhà thuốc hay mua liệu, số nhà sản xuất pha trộn thêm trôi địa bàn TP.HCM Hầu hết hóa chất tổng hợp vào sản phẩm Trong đó, mẫu thuốc mua có xuất xứ từ Trung corticoid nhóm hố chất Quốc, Malaysia thuốc sản xuất thường pha trộn vào dạng bào nước Một số chế phẩm không rõ xuất xứ Mẫu chế đông dược nhằm gia tăng tác dụng kháng bảo quản nhiệt độ phòng 25o C, tiến viêm, giảm đau, chống dị ứng chế hành nghiên cứu tiến hành xử lí mẫu phẩm Sử dụng corticoid thời gian dài có O C H2O R5 thể gây số tác dụng phụ cho người sử R2 dụng hội chứng cushing, loét dày tá OH tràng, tình trạng lỗng xương, suy giảm chức R3 R tuyến thượng thận… Việc phát R1 diện corticoid chế phẩm O đơng dược gặp khơng khó khăn phức tạp mẫu thử, hầu hết việc định tính Hình Cơng thức cấu tạo số Corticoid sử dụng định lượng corticoid chế phẩm đông nghiên cứu dược thực phẩm chức dựa ∆ R1 R2 R3 R4 R5 giúp đỡ hệ thống phân tích kĩ thuật Dexamethason 1-2 -F -OH -CH3 -H -H Betamethason 1-2 -F -OH -H -CH3 -H cao LC-UV, LC-MS, GC-MS Cho tới nay, Dexamethason 1-2 -F -OH -CH3 -H -COCH3 chưa thấy có báo cáo đề cập đến việc sử dụng acetat phương pháp MS với chế độ tiêm mẫu trực Hydrocrotison acetat-H -OH -H -H -COCH3 Prednison 1-2 -H =O -H -H -H tiếp xác định diện corticoid Prednisolon 1-2 -H -OH -H -H -H chế phẩm đông dược Mục tiêu đề Hóa chất thiết bị tài nhằm nghiên cứu điều kiện khả phát số corticoid phổ biến pha trộn Dung môi hóa chất sử dụng nghiên trái phép chế phẩm đông dược cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đạt chuẩn HPLC (Merck) 634 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Thiết bị nghiên cứu: máy khối phổ MS Quatromicro-ESI (MicroMass, Anh quốc) thiết bị thí nghiệm thuộc Trung tâm Nghiên cứu Đào tạo Phát triển Thuốc có Nguồn gốc Tự nhiên - Đại Học Y Dược TP.HCM Phương pháp xử lí mẫu Mẫu chuẩn: Chất chuẩn dạng bột pha loãng dần MeOH đến nồng 0,1-1 ppm từ dung dịch mẹ 0,1% để khảo sát điều kiện phân tích MS giới hạn phát Mẫu thử: KL 3g 3g 2g 3g xử lí theo qui trình xử lí áp dụng cho mẫu rắn Dược điển Việt nam IV, sau phân thành 0,1 g phần Mỗi phần riêng rẽ thêm tiếp 1-10 µl dung dịch corticoid chuẩn nồng độ µg/ml MeOH Với mẫu nguyên liệu lỏng, mẫu nguyên liệu Dạng rắn: Một lượng bột thuốc tương đương với liều định ghi nhãn sản phẩm loại tạp phân cực n-hexan có hỗ trợ sóng siêu âm (15 phút x lần, lần 15ml/1 g bột thuốc) Cắn sau loại n-hexan tiếp tục chiết siêu âm với dung môi MeOH-H2O (3:7) (15 phút x lần, lần 15 ml/1 g cắn) Dịch lọc chiết phân bố với ethyl acetat (3 lần, lần 15ml) Gạn lấy lớp ethyl acetat, đến cắn, hòa lại 10 ml MeOH Dạng lỏng: Một thể tích chế phẩm lỏng tương ứng với liều định ghi nhãn sản phẩm chiết phân bố với n-hexan (3 lần, lần 15ml/ 20 ml chế phẩm), lấy lớp Lớp chế phẩm lỏng tiếp tục lắc phân bố với ethyl acetat Dịch ethyl acetat thu cô đến cắn, hòa lại 10ml MeOH Xây dựng cơng thức mẫu thuốc giả lập Thành phần, hàm lượng dược liệu mẫu thuốc giả lập (Bảng 1) xây dựng dựa tần suất dược liệu thuốc dân gian chế phẩm đông dược Các dược liệu chọn dược liệu phổ biến đa dạng nhóm hoạt chất Việc khảo sát chi tiết thành phần thuốc giả lập trình bày báo khác Bảng Công thức thuốc giả lập Chuyên Đề Dược Khoa Dược Liệu Thành phần hóa học Radix Angelica sinensis Tinh dầu Radix Achyranthis bidentatae Saponin, sterol Radix Saposhnikoviae Glycoside, đường, tinh divaricatae dầu Rhizoma Smilacis glabrae Saponin, tannin, nhựa Bốn gram bột nguyên liệu mẫu thuốc giả lập Phương pháp nghiên cứu Dược Liệu Thành phần hóa học Radix Glycyrrhizae Flavonoid, saponin Radix Angelica pubescentis Fatty Acid, sterol, angelicol Cortex Eucommiae Alkaloid, glycoside Nghiên cứu Y học rắn ban đầu chiết với ethanol (1 g/ 15ml), sau thực bước qui trình xử lí áp dụng cho mẫu lỏng Phương pháp định tính phổ khối Khảo sát điều kiện ghi nhận tín hiệu tối ưu mẫu chuẩn corticoid chế độ ESI+ ESI- để áp dụng phân tích mẫu thử Trong nitrogen sử dụng tác nhân loại dung môi argon 99,99% dùng làm tác nhân gây phân mảnh ion chế độ MS/MS Nhiệt độ buồng ion hóa nhiệt độ hóa dung mơi, điện ion hóa điện phân mảnh chung cho corticoid khảo sát Giá trị giới hạn phát (LOD) ghi nhận tỉ số tín hiệu nhiễu đường lớn Mẫu chuẩn giả lập với mẫu phân tích khảo sát so sánh với phổ chuẩn corticoid Mẫu thử âm tính khơng ghi nhận ion mẹ phân mảnh đặc trưng corticoid phổ đồ nhận diện ion ban đầu phân mảnh phổ đồ không tương ứng với với phổ chuẩn Kết dương tính xác nhận trường KL 1g 2g hợp ion mẹ ion phân mảnh đặc trưng ghi nhận phổ đồ 3g 635 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thơng số vận hành máy phân tích phổ khối Khảo sát thơng số phân tích MS mẫu chuẩn để thu điều kiện tối ưu (ion mẹ phân tích MS ion phân tích MS/MS có cường độ tối ưu) cho chất để từ tìm điều kiện phân tích chung cho chất cho kết quả: Ion source Source temperature Desolvation temperature Capillary voltage ESI+, ESIo 100 C o 150 C 3,2kV Cone voltage Collision voltage Flow rate of desolvation gas Rf lens 25V 15 eV 250 L/h 0,2 V Dữ liệu phổ khối Trước khảo sát phân mảnh corticoid chuẩn, chế độ quét full scan ghi nhận nhằm xác định ion mẹ dùng phân tích Ở chế độ ESI+, mảnh thu [M+23]+ [M+1]+ tương ứng với ion mẹ [M+Na]+ [M+H]+ Trong chế độ MS/MS ion chọn khảo sát [M+23]+, [M+1]+ đánh giá phân mảnh đặc trưng, phù hợp với nghiên cứu trước đây(1,5) Kết khảo sát cho thấy ion [M+1]+ ion thích hợp cho phân tích MS/MS Ảnh hưởng acid formic 0,1% (v/v) tạo thành ion(2) khảo sát Kết cho thấy có acid formic, tín hiệu đỉnh [M+23]+ giảm rõ rệt cường độ đỉnh [M+H]+ tăng lên Với chế độ ESI-, điều kiện acid formic mảnh [M-H]- có acid formic mảnh [M -H + 46]([M+HCOO]-) Sự diện formic cho tín hiệu phổ tốt hai chế độ MS MS/MS Một điều thú vị điều kiện này, phổ thu có đến phân mảnh đặc trưng với cường độ tín hiệu cao rõ rệt Trong đa số trường hợp, phân mảnh [M-H-30]- hay [M-H-CH2O]- thành lập từ acid formic sau tiếp formaldehyd từ gốc hydroxymethyl ion ban đầu [M+HCOO]- Riêng dạng muối acetat dexamethason hydrocortison ion phân mảnh chiếm ưu [M-H]- Vì thế, chế độ phân tích có acid formic sử dụng ghi nhận phổ chế độ ESI- Bảng Ion mẹ ion phân mảnh đặc trưng tương ứng corticoid Chuẩn Ion mẹ Ion phân mảnh Betamethason 415 > 393 373, 355, 337, 309, 319, 291, 279, 267, 237 Dexamethason 415 > 393 373, 355, 337, 309, 319, 291, 279, 267, 237 + ESI Prednison 381 > 359 341, 323, 305, 313, 295, 267, 253, 237, 213 Prednisolon 383 > 361 343, 325, 307, 297, 279, 265, 239, 223 Dexamethason acetat 457 > 435 415, 397, 379, 355, 337, 327, 319, 309, 291 Hydrocortison acetat 427 > 405 387, 373, 345, 327, 309, 267, 241 437 > 391 361 ESIBetamethason Dexamethason 437 > 391 361 Prednison 403 > 357 327 Prednisolon 405 > 359 329 Dexamethason acetat 479 > 433 433 Hydrocortison acetat 449 > 403 403, 373 636 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng trình bày giá trị ion mẹ ion phân mảnh đặc trưng tương ứng corticoid khảo sát nghiên cứu Những ion phân mảnh gạch dùng việc đánh giá giới hạn phát định kết phân tích mẫu thử Chưa ghi nhận khác biệt phổ trường Nghiên cứu Y học hợp đồng phân dexamethason/ betamethason Điều trở ngại lớn thực tế, dù dexamethason hay betamethason bị cấm pha trộn vào chế phẩm đơng dược Kết phân tích trình bày Bảng Hình – Hình Phổ MS Dexamethason mẫu chuẩn (dưới) mẫu lỏng giả lập thêm chuẩn (trên) Hình Giới hạn phát Dexamethason mẫu giả lập thêm chuẩn 1: Mẫu giả lập thêm chuẩn dexamethason 1μg/ml 2: Mẫu giả lập thêm chuẩn dexamethason 10μg/ml 3: Mẫu trắng giả lập Chuyên Đề Dược Khoa 637 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 A B Hình Ảnh hưởng acid formic ghi nhận tín hiệu chế độ ESI+ A: Mẫu chuẩn pha MeOH + 0,1% acid formic B: Mẫu chuẩn pha MeOH Hình Phổ đồ mẫu thử NLV (trên) có chứa Dexa Acetat so sánh với Dexa Acetat chuẩn (dưới) chế độ ESI+- MS/MS 638 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Hình Phổ đồ mẫu thử KP (trên) có chứa Dexamethason/Betamethason so sánh với Betamethason chuẩn (dưới) chế độ ESI- - MS/MS lập nồng độ mà nồng độ tín hiệu Giới hạn phát ion mẹ phân mảnh Giới hạn phát mẫu chuẩn mẫu phát phân biệt với tín hiệu giả lập thêm chuẩn khảo sát nồng đường (tín hiệu/nhiễu đường ≥ 3) độ khác hai chế độ ghi nhận ion (Bảng 3, 4) âm ion dương Giới hạn phát xác Bảng Giới hạn phát Corticoid mẫu chuẩn + ESI Chuẩn (µg/ml) Bình thường MS MS/MS Dexamethason 0,2 0,2 Betamethason 0,2 0,1 Prednison 0,1 0,1 Prednisolon 0,1 0,1 Dexamethason acetat 0,2 0,5 Hydrocortison acetat 0,2 0,2 + 0,1% Formic MS MS/MS 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,5 0,2 0,2 ESIBình thường + 0,1% Formic MS 0,5 0,5 1 0,1 MS/MS 0,5 0,5 1 0,5 MS MS/MS 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,5 0,1 0,1 Bảng Giới hạn phát corticoid mẫu giả lập thêm chuẩn Dexamethason Betamethason Prednison Prednisolon Dexamethason acetat Hydrocortison acetat Chuyên Đề Dược Khoa Mẫu giả lập dạng rắn Mẫu giả lập dạng lỏng (µg/ml) (µg/ml) + ESIESI+ ESIESI MS MS/MS MS MS/MS MS MS/MS MS MS/MS 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 639 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Nếu tính liều dùng trung bình corticoid để có tác dụng dược lí mg/lần xem tồn lượng corticoid liều lần chế phẩm chiết vào dung dịch thử theo qui trình nồng độ corticoid dung dịch phân tích 0,5 mg/ml, cao gấp 5×103 lần giới hạn phát của phương pháp cho đa số corticoid khảo soát Kết khảo sát mẫu thử Kết áp dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế (Bảng 5) cho thấy: 24 mẫu phân tích, có 18 mẫu cho kết dương tính với corticoid xác nhận hai chế độ ion âm ion dương 66,67% (12/18) kết dương tính xác nhận dexa- betamethason Bốn mười mẫu thử chế phẩm có số đăng kí cho kết dương tính có nguồn gốc nước Bảng Kết khảo sát mẫu thử thu thập thị trường STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Sản Phẩm HTP NLTPTCH HSTTH KC TLPTL TLĐ NLV CTB CTH KPHLĐ KK TM TTSN TTh TTr HL CLĐ CLTTL PTH DHTKS TPTTT KPTTT PTT BTN Dạng bào chế Viên nang Hoàn cứng Viên nang Viên nang Viên nang Viên nang Viên nang Viên nang Hoàn cứng Hoàn cứng Hoàn cứng Hoàn cứng Viên nang Hoàn cứng Hoàn cứng Hoàn cứng Viên nang Viên nang Hoàn cứng Hoàn cứng Dung dịch uống Dung dịch uống Dung dịch uống Xịt mũi Nguồn gốc Vietnam HK-China Malaysia Malaysia Malaysia China China China Vietnam China Vietnam Vietnam Malaysia Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Malaysia China Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam Vietnam KẾT LUẬN Các kết thu nhận cho thấy phương TÀI LIỆU THAM KHẢO pháp khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp phương pháp hữu dụng, đơn giản đáng tin cậy việc xác định chất pha trộn trái phép chế phẩm thuốc đơng dược Tính liều dùng trung bình corticoid, giới hạn phát phương pháp thấp liều dùng trung bình 5×103 đảm bảo cho khả phát chất thực tế 640 Hoạt chất tìm thấy -Dexa-/betamethason acetat Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason acetat, Prednison Dexa-/betamethason -Dexa-/betamethason -Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason Dexa-/betamethasone acetat Hydrocortisone acetat -Dexam-/betamethason Dexa-/betamethasone acetat -Dexa-/betamethason Dexa-/betamethason -Prednisolon Bevalot F., Gaillard Y., Lhermitte, M.A Gilbert Pepin (2000), Analysis of corticosteroids in hair by liquid chromatographyeletrospray ionization mass spectrometry Journal of Chromatography B, 740, 227-236 Cui Xiaoliang, Shao Bing, Zhao Rong, Meng Juan, Tu Xiaoming (2006), Simultaneous determination of twelve glucocorticoid residues in milk by ultra performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry Chinese Journal of Chromatography, 24(3), 213-217 Liang Quionglin, Qu Jun, Luo Guoan, Wang Yiming (2006), Rapid and reliable determination of illegal adulterant in herbal medicines and dietary supplements by LC-MS/MS Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, 305-311 Maciej J Bogusz, Huda Hassan, Eid Al-Enazi, Zuhour Ibrahim, Mohammed Al-Tufail (2006), Application of LCESI/MS/MS for detection of synthetic adulterants in herbal Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 remedies Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 554-564 Van den Hauwe O., Dumoulin F., Antignac J.P., Bouche M.P., Elliott C., Peteghem C.V (2002), Liquid chromatoraphic-mass Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học spectrometric analysis of 11 glucocorticoid residues and an optimization of enzymatic hydrolysis conditions in bovine liver Analytica Chimica Acta, 473, 127-134 641 ... KHẢO pháp khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp phương pháp hữu dụng, đơn giản đáng tin cậy việc xác định chất pha trộn trái phép chế phẩm thuốc đơng dược Tính liều dùng trung bình corticoid, ... điều kiện khả phát số corticoid phổ biến pha trộn Dung mơi hóa chất sử dụng nghiên trái phép chế phẩm đông dược cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đạt chuẩn HPLC (Merck) 634 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học... phẩm Trong đó, mẫu thuốc mua có xuất xứ từ Trung corticoid nhóm hố chất Quốc, Malaysia thuốc sản xuất thường pha trộn vào dạng bào nước Một số chế phẩm không rõ xuất xứ Mẫu chế đông dược nhằm gia