Nghiên cứu phát triển bộ Kit phát hiện sớm một số bệnh ở gia súc, gia cầm bằng phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)

Bệnh truyền nhiễm được xem như là trở ngại lớn gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển bền vững của ngành chăn nuôi (gia súc và gia cầm). Ở Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh trên gia cầm chủ yếu dựa vào những triệu chứng và các vết bệnh tích ở vật chủ; hình thái, cấu tạo và hoạt tính sinh học của các tác nhân gây bệnh.

Công nghệ sinh học & Giống trồng NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KIT PHÁT HIỆN SỚM MỘT SỐ BỆNH Ở GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) Hà Bích Hồng1, Nguyễn Hải Đăng1, Nguyễn Thị Thu Trang1, Đỗ Văn Hiệp1, Bùi Văn Thắng1 Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Bệnh truyền nhiễm xem trở ngại lớn gây ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển bền vững ngành chăn nuôi (gia súc gia cầm) Ở Việt Nam, cơng tác chẩn đốn bệnh gia cầm chủ yếu dựa vào triệu chứng vết bệnh tích vật chủ; hình thái, cấu tạo hoạt tính sinh học tác nhân gây bệnh Điều ảnh hưởng đến hiệu sử dụng thuốc thuốc kháng sinh bệnh có triệu chứng tương đồng Tình trạng sử dụng thuốc thuốc kháng sinh không hiệu dẫn đến bệnh không tiêu diệt triệt để, hình thành ổ dịch tự nhiên, thúc đẩy tích lũy đột biến tác nhân gây bệnh Với phát triển lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) kéo theo hàng loạt thành tựu khoa học mang tính ứng dụng cao Phương pháp PCR giúp chẩn đoán sớm nhanh bệnh gia súc, gia cầm nhằm tìm tác nhân gây bệnh xác từ có biện pháp điều trị hiệu chống bùng phát dịch Trong nghiên cứu này, phát triển thành công hai kit phát bệnh cầu trùng gà ký sinh trùng Eimeria sp gây bệnh viêm ruột hoại tử lợn vi khuẩn Clostridium perfringens gây nên kỹ thuật PCR Quy trình để phát bệnh tối ưu với tổng thời gian xét nghiệm tính từ lúc nhận mẫu bệnh phẩm tới lúc đưa trả kết Đây hướng ứng dụng hiệu kỹ thuật sinh học phân tử đại vào thực tiễn góp phần đưa dịch vụ xét nghiệm bệnh gia súc, gia cầm trở nên đơn giản phổ biến Từ khóa: Cầu trùng, Clostridium perfringens, Eimeria sp, Kit, PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh truyền nhiễm nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ phát triển bền vững lĩnh vực chăn nuôi; không thiệt hại kinh tế, mà ảnh hưởng đến mơi trường sức khỏe cộng đồng Một số bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam như: dịch cúm gia cầm (12/2003), nước ta phải thiêu hủy 38 triệu tương đương với 380 tỷ đồng (nhandan.com.vn/kinhte/8045602), hàng năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm trận dịch nhỏ, lẻ xảy thường xuyên rải rác khắp nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale), viêm khí quản (Gallid herpesvirus 1), tiêu chảy (Escherichia coli), thương hàn (Salmonella gallinarum), cầu trùng (Eimeria sp.) Những bệnh truyền nhiễm gia súc nói chung lợn nói riêng gây nên thiệt hại kinh tế tỷ lệ chết, giảm thể trọng cộng với chi phí liên quan đến kiểm sốt phòng ngừa điều trị Điển hình trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng (Aphthovirus) gần dịch tả lợn châu Phi (African swine fever virus) gây thiệt hại vô lớn cho ngành chăn ni (Đỗ Tiến Duy, 2015, 2016; Nguyễn Đình Qt, 2015) Do đó, việc phát chẩn đốn sớm bệnh nhiễm, chưa có biểu lâm sàng cần thiết, giúp đưa phác đồ điều trị bệnh kịp thời, đồng thời ngăn chặn bùng phát dịch quy mô lớn gây tổn thất nặng nề kinh tế môi trường Bệnh cầu trùng gà loại bệnh đường ruột ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Eimeria gây Bệnh xảy manh tràng ruột non, làm rối loạn tiêu hóa, ảnh hưởng đến khả hấp thụ dinh dưỡng trao đổi chất vật chủ Vật chủ giảm tăng trọng, còi cọc, chậm lớn suy yếu, bệnh dẫn đến tử vong Ngồi ra, vật chủ bị suy giảm hệ miễn dịch yếu tố cho bệnh hội xảy viêm ruột hoại tử Ký sinh trùng thuộc giống Eimeria, họ Eimeriidae, nhóm ký sinh trùng Apicomplexans Cho đến nay, nhà khoa học xác định 10 loại cầu trùng gà, chín loại xác định rõ tên, kích thước màu sắc gồm: E tenella (Raillient Lucet, 1891); E acervulina, E maxima, E mitis (Tyzzer, 1929); E necatrix, TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 17 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng E praecox (Johnson, 1930); E haganci (Levine, 1938), E brunetti (Levine, 1942) E mivatti (Edgar Seibold, 1969) Theo thống kê, 05 chủng gây bệnh cầu trùng giống Eimeria Việt Nam tần số gây bệnh E tenella cao nhất, E maxia, E acervula, E brunetti E mitis (Fernandez cộng sự, 2003; Hamidinejat cộng sự, 2010; vjol.info/index.php/kkty/article/view/8563/795 0) Bệnh cầu trùng chẩn đốn sau chết diện tổn thương đặc trưng đường ruột, bên cạnh việc chẩn đốn vật chủ chết sau cho kết với độ tin cậy thấp (do thay đổi đường ruột sau tử vong) Chẩn đốn kính hiển vi phát nỗn nang lại khơng đủ luận thể nhận định bệnh Eimeria gây Bệnh viêm ruột hoại tử lợn vi khuẩn Clostridium perfringens gây nên Bệnh phổ biến heo với biểu viêm ruột tơ huyết cấp tính dội với phân đen có máu Tỷ lệ heo chết cao thể mãn tính vần tồn Khi bệnh xuất triệu chứng lâm sàng khó chữa khỏi Chẩn đốn bệnh tiêu chảy Clostridium thực xét nghiệm xác chết, xét nghiệm phết kính mẫu ruột, mơ bệnh học, xét nghiệm độc tố nuôi cấy (Wu cộng sự, 2008; Rood cộng sự, 1991) Với phát triển lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) kéo theo hàng loạt thành tựu khoa học mang tính ứng dụng cao Phương pháp PCR giúp chẩn đốn sớm nhanh bệnh gia súc, gia cầm nhằm tìm tác nhân gây bệnh xác từ có biện pháp điều trị hiệu chống bùng phát dịch PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm a) Thu thập mẫu: Mẫu máu: thu nhận cách cắt tiết lấy máu từ vùng tĩnh mạch (dưới cánh gà) Mẫu mô: thu nhận mẫu nội tạng quan sát thấy vết bệnh tích có nội tạng tương ứng với chẩn đoán lâm sàng 18 Mẫu kén: tùy thuộc vào mô, quan ký sinh chu kỳ sinh sản tác nhân gây bệnh mà ta thu Mẫu phân: phân lấy tăm tiệt trùng b) Bảo quản mẫu: Các ống chứa chất chống đông (EDTA) dùng để chứa bảo quản mẫu máu Các ống chứa cồn tuyệt đối dùng bảo quản mẫu ruột mẫu kén Các mẫu bệnh phẩm bảo quản thùng nhựa giữ nhiệt chứa đá khơ tạo mơi trường thích hợp để ức chế hoạt động enzyme có sẵn mẫu bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm sau bảo quản tủ lạnh 4oC sử dụng 2.2 Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm máu ruột tách chiết ADN tổng số Kit “G-spinTM Total ADN Extraction Kit” thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Tách chiết ADN tổng số mẫu kén trùng Eimeria sp theo phương pháp Saeed ElAshram (2016) 2.3 Phương pháp nhân đoạn gen tác nhân gây bệnh kỹ thuật PCR Thể tích hỗn hợp phản ứng PCR 20l, chứa thành phần nồng độ chất tham gia phản ứng như: 2,0 μl đệm 10X Taq, 2,0 μl hỗn hợp dNTP (2,0 mM), 1,0 μl cho cặp mồi (10 μM), 0,3 μl cho U/μl Taq ADN polymerase, μl ADN khuôn (50 ng/μl) H20 cho tổng thể tích đạt 25 l Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950C phút; (950C: 30 giây, 570C - 620C: 30 giây, 720C: phút) lặp lại 35 chu kỳ; 720C 10 phút; bảo quản sản phẩm PCR 40C Sản phẩm PCR được di gel agarose 1,5% Nhân vùng gen nhân (ITS1-rDNA) kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1_F: 5’ – AATTTAGTCCATCGCAACCCTTG – 3’, ITS1_R: 5’-CGAGCGCTCTGCATACGACA – 3’ (R F Wang cộng sự, 1994); vùng gen ty thể (16S-rRNA) với cặp mồi 16S_F: 5’ – AAAGATGGCATCATCATTCAAC – 3’, TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng 16S_R: 5’ – TACCGTCATTATCTTCCCCAAA – 3’ (Hamidinejat cộng sự, 2010) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm khác DNA tổng số 11 mẫu bệnh phẩm Gà (04 mẫu máu, 02 mẫu kén 02 mẫu ruột) Heo (máu, phân ruột) tách chiết thể hình Đối với ADN tổng số tách chiết từ mẫu máu Gà có chất lượng hàm lượng ADN khác (Hình 1A) Cụ thể, mẫu số 01 có hàm lượng ADN lớn so với mẫu lại chất lượng ADN tương đối tốt thể vạch sáng rộng dải smear (do ADN bị đứt gãy thành đoạn nhỏ) (Giếng 1, Hình 1A) Mẫu 02 03 có hàm lượng ADN thấp hẳn so với mẫu 01, chất lượng ADN tương đối tốt (Giếng 2, 3; Hình 1A) Riêng mẫu số 04 gần khơng nhìn thấy vạch sáng ADN, điều cho thấy hiệu tách chiết ADN từ mẫu chưa tốt (Giếng 4; Hình 1A) mẫu khơng sử dụng cho bước nghiên cứu Hình Kết kiểm tra ADN tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác gel agarose 1% Trong đó, mẫu máu (A), mẫu kén trùng (B), mẫu ruột (C) gà chẩn đoán bệnh cầu trùng; mẫu máu, phân ruột Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử (D) Kết tách chiết ADN tổng số từ 02 mẫu kén bệnh phẩm Gà theo phương pháp Saeed El-Ashram (2016) thể hình 1B Trong đó, 02 mẫu kén chẩn đốn kén cầu trùng có hàm lượng ADN tổng số tương đối lớn Mẫu 01 có hàm lượng chất lượng so với mẫu 02 thể vạch ADN tổng số không sáng vạch ADN tổng số mẫu 02 ADN mẫu 01 bị đứt gãy nhiều so với ADN mẫu 02 (dải smear sáng giếng 1) Mẫu 02 với hàm lượng chất lượng ADN cao hơn, vạch ADN sáng rõ nét với ADN đứt gãy thấp Mặc dù hàm lượng chất lượng ADN tách chiết không đồng với mục đích khuếch đại axit nucleic kỹ thuật PCR kết tách chiết đảm bảo đủ tiêu chuẩn Đối với mẫu có độ tinh thấp hàm lượng ADN cao, tiếp tục pha lỗng đến nồng độ ADN tổng số thích hợp cho phản ứng PCR Việc pha loãng vừa làm tăng độ tinh mẫu ADN khuôn, vừa cung cấp lượng ADN khuôn đủ cho phản ứng PCR Do có tác dụng tăng tính đặc hiệu phản ứng PCR Cả 02 mẫu ADN tách chiết từ kén trùng chứa hàm lượng lớn ARN, thể vạch có trọng lượng phân tử thấp, nằm phía gel Ngun nhân enzyme RNase bị hoạt tính trình ủ enzyme RNase nhiệt độ 37oC khơng đảm bảo Tách chiết ADN từ mẫu kén sử dụng kết hợp phương pháp hóa học phương pháp nghiền học nitơ lỏng thu hàm lượng ADN cao ADN bị đứt gãy nhiều so với tách chiết phương pháp TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 19 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng hóa học kết hợp với phương pháp nghiền hạt thủy tinh (Mohammadi cộng sự, 2015; El-Ashram cộng sự, 2016) Tuy nhiên, với mục đích tách chiết ADN làm khn cho phản ứng PCR khơng u cầu chất lượng ADN cao Do đó, ADN từ 02 mẫu kén trùng đảm bảo đủ tiêu chuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR mẫu ADN cần pha loãng trước tiến hành PCR Kết tách chiết ADN tổng số từ 02 mẫu bệnh phẩm ruột Gà thể Hình 1C Trong đó, mẫu số 01 có hàm lượng ADN tương đối lớn ADN bị đứt gãy thể dải smear kéo dài xuống phía (Giếng 1, Hình 1C) Sự đứt gãy ADN q trình nghiền mẫu ni tơ lỏng với lực mạnh thời gian nghiền mẫu khơng hồn tồn bảo quản lạnh ni tơ lỏng, mà có thời điểm mẫu nghiền hết ni tơ lỏng tạo điều kiện cho enzyme ADNse tế bào hoạt động cắt phần ADN thành đoạn ngắn Với hàm lượng ADN lớn mẫu 01 cần pha lỗng 50 lần để đạt hàm lượng ADN thích hợp cho tiến hành phản ứng PCR Mẫu 02 không xuất vạch ADN (Giếng 2, Hình 1C), điều cho thấy hiệu tách ADN mẫu 02 không đạt mẫu không sử dụng cho bước nghiên cứu Hình 1D kết tách chiết ADN tổng số từ 03 mẫu bệnh phẩm lợn chẩn đoán mắc bệnh viêm ruột hoại tử ADN tách từ mẫu máu (Giếng 1, Hình 1D) mẫu ruột (Giếng 3, Hình 1D) có chất lượng tương đối tốt, hàm lượng ADN không nhiều đủ tiêu chuẩn để làm khuôn cho phản ứng PCR Riêng ADN tách từ mẫu phân (Giếng 2, Hình 1D) gần không quan sát thấy băng sáng nhiên sản phẩm tách ADN sử dụng để tiến hành phản ứng PCR PCR kỹ thuật nhạy cần lượng nhỏ ADN khn nhân đoạn gen mong muốn 3.2 Kết nhân đoạn gen nhân ITS1rDNA chủng E tenella gây bệnh cầu trùng Gà Ribosome bào quan khơng màng có 20 sinh vật nhân sơ sinh vật nhân thực, có chức quan trọng trình dịch mã tạo thành chuỗi polypeptide Cấu tạo ribosome gồm tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ tiểu đơn vị lớn Thành phần cấu tạo nên ribosome chủ yếu RNA ribosome (rRNA) gen rADN hệ gen mã hóa Vùng gen nhân ITS (Internal Transcribed Spacer) vùng đệm nằm gen mã hóa cho tiểu đơn vị khác rRNA sinh vật Đến nay, nhà khoa học phát 03 loại ITS khác nhau: ITS vùng đệm gen mã hóa cho tiểu đơn vị 16S 23S rRNA vi khuẩn cổ khuẩn; ITS1 vùng đệm gen mã hóa cho tiểu đơn vị 18S 5.8S có sinh vật nhân thực; Ngồi ra, có vùng đệm ITS2 nằm vùng mã hóa cho tiểu đơn vị 5.8S 26S thực vật (D L J Lafontaine cộng sự, 2001) Vùng gen ITS cho yếu tố tiềm hiệu để phân biệt khác loài chi/giống với vùng gen ITS có tỉ lệ cao (35,94%), gen 23S (7,29%) gen 16S (5,34%) (Man cộng sự, 2010) Cặp mồi sử dụng nghiên cứu để phát bệnh cầu trùng Gà khuếch đại đoạn ADN thuộc vùng gen nhân (ITS1- rADN) đặc trưng cho phân loài cầu trùng E tenella (Kawahara cộng sự, 2008; Hamidinejat cộng sự, 2010) Trong loài Eimeria gây bệnh cầu trùng Gà lồi E tenella cho phổ biến (Hamidinejat cộng sự, 2010; vjol.info/index.php/kkty/article/view/8563/7950) Do đó, cặp mồi ITS1_F/R khuếch đại đoạn ADN với kích thước 278 bp sản phẩm PCR cặp mồi để phát bệnh cầu trùng Gà loài E tenella gây Đối với cặp mồi sử dụng phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi yếu tố định đến thành công Do đó, với cặp mồi sử dụng nghiên cứu chứng phải tiến hành bước tối ưu nhiệt độ gắn mồi sử dụng chương trình gradient nhiệt độ máy PCR TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng Hình Sản phẩm PCR cặp mồi ITS1_F/R điện di gel agarose 1,5% M - Marker phân tử, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi ITS1-rDNA (A) nhân đoạn gen ITS1-rDNA 03 mẫu bệnh phẩm Gà chẩn đoán bệnh cầu trùng (B) Theo tác giả Hamidinejat cộng (2010) nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi sử dụng 58oC 65oC Để xác định xác nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi ITS1_F/R, chúng tơi tiến hành thí nghiệm PCR gradient với dải nhiệt độ sau: 52oC, 53oC, 56oC, 58oC, 60oC, 62oC, 64oC 65oC Chúng sử dụng ADN tách chiết từ kén trùng thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi Kết tối ưu nhiệt độ gắn cặp mồi ITS-1 (Hình 2A) nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi ITS1_F/R 58oC (Giếng 4, Hình 2) Do đó, nhiệt độ 58oC chọn để tiến hành tiếp phản ứng PCR chẩn đoán bệnh cầu trùng gà với 03 mẫu bệnh phẩm khác (mẫu kén, máu ruột) Có thể thấy việc sử dụng cặp mồi công bố nhiều áp dụng hồn tồn theo quy trình tác giả mà cần có xem xét tối ưu lại kỹ thuật PCR việc sử dụng enzyme polymerase, đệm hóa chất khác làm thay đổi điều kiện để phản ứng PCR thành công Trong tổng số 03 mẫu ADN (kén, máu ruột) Gà có mẫu kén cho kết dương tính với cặp mồi ITS1_F/R Sản phẩm PCR từ mẫu kén có kích thước 278 bp kích thước dự kiến với băng ADN đặc hiệu rõ nét (Giếng 1, Hình 2B) Kích thước đoạn ADN khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS1_F/R nhiệt độ gắn mồi 58oC thu từ mẫu kén tương đồng với kết tác giả Hamidinejat cộng (2010) Điều khẳng định việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát bệnh cầu trùng gà khả thi loài cầu trùng E tenella tác nhân gây bệnh mẫu gà nghiên cứu Tuy nhiên, mẫu ADN từ máu từ ruột lại không xuất băng ADN dự kiến (Giếng 2, 3; Hình 2B) Nguyên nhân mẫu ADN tách từ máu ruột khơng xuất băng ADN mẫu bệnh phẩm khơng chứa ADN lồi E tenella Tác nhân gây bệnh không chưa xâm nhiễm vào hệ thống máu tế bào ruột gà bị bệnh mà tập trung ống ruột sinh kén Hoặc q trình sinh sản vơ tính cầu trùng bị bất hoạt thuốc kháng sinh điều trị cho Gà nên mẫu máu mơ ruột khơng tồn tác nhân gây bệnh, kén trùng (nỗn bào) có thành nỗn nang rắn nên thuốc kháng sinh tác động ly giải nỗn bào khơng có kết hợp với phương pháp nghiền học nhằm làm vỡ noãn nang Như vậy, chúng tơi thành cơng việc chẩn đốn bệnh cầu trùng mẫu kén trùng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi ITS1_F/R Chẩn đoán bệnh cầu trùng Gà kỹ thuật PCR cho ta kết xác nhanh chóng, q trình chẩn đốn khoảng 04 với quy trình tách chiết ADN tổng số thực phản ứng PCR tối ưu Điều đặc biệt quan trọng việc lập kế hoạch phòng ngừa hiệu chương trình kiểm sốt bệnh cầu trùng Theo phương pháp TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 21 Công nghệ sinh học & Giống trồng truyền thống, chẩn đoán bệnh phát nỗn bào Eimeria có phân gà cách đo kích thước nỗn bào đánh giá mức độ tổn thương bệnh lý ruột gà Mặc dù kính hiển vi hồn tồn phát số mẫu phân với phân chủng gây bệnh riêng biệt, nhiên vật chủ nhiễm đồng thời lúc nhiều loài chi Eimeria gây bệnh Gà phương pháp chẩn đốn kính hiển vi khơng có độ tin cậy cao chồng chéo kích thước noãn bào giống Eimeria vị trí nhiễm trùng ruột chúng (Hamidinejat cộng sự, 2010) 3.3 Kết nhân đoạn gen 16S - rRNA chủng C perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử lợn Tiểu đơn vị 16S - rRNA hai tiểu phần quan trọng cấu thành nên ribosome vi khuẩn, chúng ngắn (chỉ 1.542 nucleotide) Với vai trò quan trọng việc dịch mã tổng hợp nên protein ribosome tính bảo thủ lồi sinh giới cao, hầu hết lồi tồn đến hậu duệ loài tổ tiên từ 3,5 tỷ năm trước (Campbel cộng sự, 2008) Tuy nhiên, gen 16S - rRNA từ vi khuẩn khác có vài nucleotide khác nằm rải rác trình tự, dựa vào sai khác mà gen 16S-rRNA thường sử dụng để phân biệt loài Bệnh viêm ruột hoại tử Heo loài vi khuẩn C perfringens gây nên Chủng vi khuẩn C perfringens diện quan tiêu hóa, rong chủ yếu ruột non Trong nghiên cứu này, lựa chọn gen 16S-rRNA để phát tác nhân gây bệnh C perfringens mẫu bệnh phẩm thu từ cá thể lợn chẩn đoán lâm sàng Cặp mồi 16S_F/R sử dụng nghiên cứu bắt cặp bổ sung với đoạn gen mã hóa cho 16S - rRNA C perfringens (Wang cộng sự, 1994) Cặp mồi khuếch đại đoạn ADN có kích thước 279 bp đặc hiệu loài C perfringens Wang cộng (1994) công bố nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 55oC, từ tham khảo chúng tơi chọn dải nhiệt độ (52oC, 55oC, 58oC, 60oC) để thực phản ứng PCR gradient nhằm tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu Đối với ADN tách từ mẫu máu ruột Heo không xuất sản phẩm PCR tất nhiệt độ Mẫu phân hàm lượng ADN tổng số ít, khơng nhìn thấy ảnh điện di kiểm tra ADN tổng số (Giếng 2, Hình 1D) xuất sản phẩm PCR ba nhiệt độ 55oC, 58oC, 60oC, riêng n 52oC khơng xuất sản phẩm PCR (Hình 3A) Dựa vào độ sáng băng sản phẩm PCR hình 3A cho thấy nhiệt độ gắn mồi thích hợp cặp mồi 16S_F/R 60oC Hình Sản phẩm PCR cặp mồi 16S_F/R điện di gel agarose 1,5% M- Marker phân tử; nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho cặp mồi 16S_F/R (A) nhân đoạn gen 16S - rRNA 03 mẫu bệnh phẩm Heo chẩn đoán bệnh viên ruột hoại tử (B) 22 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2020 Công nghệ sinh học & Giống trồng Trong thí nghiệm cặp mồi 16S_F/R sử dụng để nhân đoạn gen 16S-rRNA 03 mẫu bệnh phẩm Heo (mẫu máu, ruột phân) Kết hình 3B có mẫu phân cho kết dương tính với băng ADN đặc hiệu với kích thước gần 300 bp kích thước dự kiến (Giếng 2, Hình 3B), mẫu từ máu ruột khơng xuất băng sản phẩm PCR Với kết này, chúng tơi khẳng định mẫu phân lợn sử dụng nghiên cứu có nhiễm vi khuẩn C perfringens Hai mẫu lại máu ruột, lấy Heo lại không xuất băng ADN đặc hiệu Heo nhiễm khuẩn vi khuẩn chưa xâm nhiễm vào máu ruột Một điều quan trọng mẫu ADN tách từ phân gần không xuất điện di gel agarose 1% kết PCR lại khẳng định có ADN mẫu tách chiết với hàm lượng nhỏ Tuy nhiên hàm lượng ADN đủ để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân thành công đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens 3.4 Quy trình phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR Để phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR cần đảm bảo điều kiện sau: Tách chiết ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm tối ưu hóa phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu tác nhân gây bệnh sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng Do đó, kit phát bệnh gia súc, gia cầm bao gồm: hóa chất tách chiết ADN tổng số, hóa chất PCR, hóa chất chạy điện di Trong nghiên cứu này, quy trình hồn chỉnh từ nhận mẫu bệnh phẩm tới trả kết tối ưu hóa với tổng thời gian Điều cho thấy hiệu việc sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán sớm bệnh gia súc, gia cầm KẾT LUẬN Hai kit phát sớm bệnh cầu trùng Gà bệnh viêm ruột hoại tử Heo nghiên cứu thành cơng Trong đó, bệnh cầu trùng Gà phát nhờ cặp mồi ITS1_F/R nhân đoạn ADN đặc hiệu vùng gen nhân (ITS1-rDNA) có chủng E tenella, chủng gây bệnh cầu trùng phổ biến Gà Bệnh viêm ruột hoại tử Heo vi khuẩn C perfringens gây nên phát sớm dựa mẫu phân Heo nhiễm bệnh sử dụng cặp mồi 16S_F/R để nhân đoạn gen ty thể (16S-rRNA) đặc hiệu lồi vi khuẩn Tồn quy trình chẩn đốn bệnh tối ưu hóa với tổng thời gian từ nhận mẫu đến có kết Đây sở để tiếp tục phát triển kit phát bệnh dựa kỹ thuật multiplex PCR (PCR đa mồi), phát - bệnh phản ứng PCR TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tiến Duy Nguyễn Tất Tồn (2015), Phát triển quy trình multiplex PCR phát mầm bệnh vi khuẩn virus gây rối loạn hơ hấp heo, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Số 7, Tập 22, 28-36 Đỗ Tiến Duy Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Lê Thanh Hiền, Nguyễn Thị Phước Ninh (2016), Xác định diện Duck Circovirus Reimerella Anatipestifer từ ca bệnh bại huyết vịt kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Số 6, 14-21 Nguyễn Đình Quát, Lê Thị Tuyết Toan, Phạm Ngọc Như Ý, Nguyễn Thị Thu Năm, Nguyễn Thị Phước Ninh (2015), Chẩn đoán Actinobacillus Pleuropneumoniae (APP) xác định typ 1,2,5,8 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ - 2020 23 Công nghệ sinh học & Giống trồng kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nơng Lâm nghiệp, Số 3, 15-20 Neil A Campbell Jane B Reece (2008), Sinh học tái lần (Biology 4th Fourth Edition) S Fernandez, A.H Pagotto, M.M Furtado, A.M Katsuyama, A.M Madeira, A Gruber (2003), A multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of the seven Eimeria species that infect domestic fowl, Parasitology, Vol.127, No.4, 317-325 F Kawahara, K Taira, S Nagai, H, Onaga, M Onuma, T Nunoya (2008), Detection of five avian Eimeria species by species-specific real-time polymerase chain reaction, 10.1637/8351-050908-Reg.1 Hakan Kalender (2004), Isolation of Clostridium perfringens from Chickens and Detection of the Alpha Toxin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR), Turk J Vet Anim Sci, Vol.29, No.3, 847-851 H Hamidinejat, M.R Seifiabad Shapouri, M Mayahi, M.P Borujeni (2010), Characterization of Eimeria Species in Commercial Broilers by PCR Based on ITS1 Regions of rDNA, Iranian J Parasitol, Vol.5, No.4, 48-54 J Wu, WW Zhang, B Xie, M Wu, X Tong, J Kalpoe, D Zhang (2008), Detection and Toxin Typing of Clostridium perfringens in Formalin-Fixed, ParaffinEmbedded Tissue Samples by PCR, 10.1128/JCM.01324-08 10 N Mohammadi, B Kazemi, G Roozkhosh, K Masoomi, M T Farghadani (2015), A simple, Inexpensive and Safe Method for DNA Extraction of Frigid and Clotted Blood Samples, Novelty in Biomedicine, Vol.3, No.3, 10.22037/nbm.v3i3.9507 11 J I Rood, S T Cole (1991), Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens, Microbiol Rev, Vol.55, No.4, 621-648 12 R F Wang, W W Cao, W Franklin, W Campbell, C E Cerniglia (1994), A 16S rDNA-based PCR method for rapid and specific detection of Clostridium perfringens in food, 10.1006/mcpr.1994.1018 13 S M Man, N O Kaakoush, S Octavia, H Mitchell (2010), The Internal Transcribed Spacer Region, a New Tool for Use Species Differentiationn and Delineation of Systematic Relationships within the Campylobacter Genus, Appl Environ Microbiol, Vol.76, No.10, 3071-3081 14 S El-Ashram, I Al-Nasr, X Suo (2016), Nuleic Acid protocols: Extraction and Optimization, Biotechnol Rep (Amst), Vol.12, 33-39 15.https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/804560 2-.html 16.www.vjol.info/index.php/kkty/article/view/8563/7950 RESEARCH AND DEVELOPMENT OF KITS FOR EARLY DETECTION OF SOME DISEASES IN CATTLE AND POULTRY BY PCR TECHNIQUE (Polymerase Chain Reaction) Ha Bich Hong1, Nguyen Hai Dang1, Do Van Hiep1, Nguyen Thi Thu Trang1, Bui Van Thang1 Vietnam National University of Forestry SUMMARY Infectious diseases are considered as the biggest obstacle affecting the growth and sustainable development of the livestock industry (cattle and poultry raising) In Vietnam, cattle and poultry disease diagnosis is mainly based on host symptoms and lesions; morphology, structure and biological activity of pathogens That affects the efficacy of drugs and antibiotics for diseases with similar symptoms The ineffective use of drugs and antibiotics leads to the disease not being completely eradicated, forming natural diseases outbreaks, and promoting the accumulation of mutations in pathogens With the development of the field of molecular biology, typically the polymerase chain reaction (PCR) technique has led to a series of highly applied scientific achievements The PCR method helps to quickly diagnose diseases in cattle and poultry in order to find the exact pathogens, thereby effectively treating as well as combating diseases outbreaks In this study, we have successfully developed two kit for detecting coccidiosis in chickens caused by the parasite Eimeria sp and necrotic enterocolitis in pigs caused by Clostridium perfringens using PCR technique The procedure for detecting the disease is optimal with a total test time of hours from the time of sample receipt to the time when results are returned This is an effective application of modern molecular biology techniques in practice, contributing to simplify and popularize disease testing services for cattle and poultry Keywords: Clostridium perfringens, Coccidiosis, Eimeria sp, Kit, PCR Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng 24 : 06/12/2019 : 07/02/2020 : 14/02/2020 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ – 2020 ... khuôn cho phản ứng PCR nhân thành công đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens 3.4 Quy trình phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR Để phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR cần đảm bảo... chẩn đoán sớm nhanh bệnh gia súc, gia cầm nhằm tìm tác nhân gây bệnh xác từ có biện pháp điều trị hiệu chống bùng phát dịch PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm a) Thu thập... kỹ thuật PCR chẩn đoán sớm bệnh gia súc, gia cầm KẾT LUẬN Hai kit phát sớm bệnh cầu trùng Gà bệnh viêm ruột hoại tử Heo nghiên cứu thành cơng Trong đó, bệnh cầu trùng Gà phát nhờ cặp mồi ITS1_F/R