NGHIÊN cứu PHÁT HIỆN các BIẾN THỂ ở một số BỆNH NHÂN tự kỷ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH tự TOÀN bộ VÙNG mã hóa (EXOME) (tt)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ VÙNG Mà HĨA (EXOME) Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420116 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ VN Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ VN Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Huy Hoàng Viện Nghiên cứu hệ gen GS TS Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên thức Họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia - Thư viện Viện Công nghệ sinh học Website: http://luanvan.moet.gov.vn MỞ ĐẦU Tự kỷ (Autism Spectrum Disorders -(ASD)) thuộc nhóm rối loạn phát triển, khơng đồng mặt di truyền Tự kỷ biểu khiếm khuyết tương tác xã hội, khó khăn giao tiếp ngơn ngữ phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp lặp lại Một số bệnh thường thấy kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác Điều đáng nói chưa có phương pháp chữa trị dứt điểm cho bệnh nhân tự kỷ Các biện pháp áp dụng để giảm rối loạn hành vi, loại thuốc nhằm giảm hăng, lo âu, trầm cảm,… Ước tính cho thấy ASD ảnh hưởng đến khoảng 68 trẻ em tỷ lệ mắc bệnh bé trai chiếm ưu so với bé gái Nguy di truyền bệnh đề xuất có liên quan đến ảnh hưởng kết hợp biến thể khác Trong nghiên cứu cặp song sinh, đồng kiểu hình ASD cặp song sinh trứng chiếm 7090%, tỉ lệ cặp song sinh khác trứng 0-30% Yếu tố mơi trường có tương tác với yếu tố di truyền gây thay đổi bất thường phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não Giải trình tự tồn vùng mã hóa (WES) sử dụng rộng rãi nghiên cứu lâm sàng vài năm gần đây, đặc biệt việc xác định gen bệnh di truyền theo Mendel Hàng chục nghìn biến thể gen xác định exome nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, Đối với người, trí tuệ tính trạng phức tạp nhiều gen quy định WES coi hướng đắn để nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ Phương pháp giúp xác định điều kiện di truyền cụ thể với trường hợp nghi ngờ mặt lâm sàng, cho thấy tầm quan trọng biến đổi di truyền gen hội chứng tự kỷ Hiện nay, Việt Nam việc nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ cịn mới, đặc biệt chưa có nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tử cao Xuất phát từ thực tiễn đó, luận án “Nghiên cứu phát biến thể số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam phương pháp giải trình tự tồn vùng mã hóa (exome)” thực giúp cho nhà nghiên cứu di truyền học giải thích chế gây bệnh bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, hướng để nâng cao chất lượng sống Mục tiêu đề tài: Giải trình tự phân tích tồn vùng mã hóa (exome) số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Xác định biến thể di truyền gen liên quan đến bệnh tự kỷ số người bệnh tự kỷ Việt Nam Nội dung nghiên cứu: Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ Thu thập mẫu máu tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân gia đình Giải trình tự tồn exome số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam Phân tích số liệu tìm biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ người Việt Nam Những đóng góp luận án: Đưa số liệu biến thể người bệnh tự kỷ Việt Nam Xác định 02 biến thể (p.L111P p.R3048C) gen RYR3 01 bệnh nhân Xác định 02 biến thể (p.R801C p.W819C) gen RYR2 01 bệnh nhân Xác định 06 biến thể gen MUC16 (p.A2224S; p.W13569C; p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) 06 bệnh nhân Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T gen HTR4 04 bệnh nhân Cấu trúc luận án: Luận án trình bày 119 trang (khơng kể tài liệu tham khảo phần phụ lục) Luận án chia thành phần: - Mở đầu: 03 trang Chương Tổng quan tài liệu: 29 trang - Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 13 trang Chương Kết nghiên cứu: 43 trang Chương Bàn luận: 22 trang Kết luận Kiến nghị: 01 trang Các cơng trình cơng bố tác giả: 01 trang Tóm tắt luận án tiếng Anh: 07 trang Luận án gồm 23 bảng, 37 hình, sử dụng 233 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh số trang Web Phần phụ lục Danh sách 101 gen liên quan đến bệnh tự kỷ hãng Illumina; Kết tạo thư viện DNA; Chất lượng liệu fastq mẫu; Thông tin hồ sơ DBCP CARS bệnh nhân NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU BỆNH TỰ KỶ Tự kỷ dạng rối loạn Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ Tự Kỷ), bệnh khởi phát sớm năm đời, tác động đến phát triển trẻ lĩnh vực như: tương tác xã hội, ngôn ngữ, hành vi Tự kỷ rối loạn mãn tính, ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát triển trí tuệ hành vi khả học tập, sinh hoạt khả thích ứng trẻ sau Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ nhóm hội chứng khơng đồng mặt di truyền Tự kỷ biểu khiếm khuyết tương tác xã hội, khó khăn giao tiếp ngơn ngữ phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp lặp lại Ngồi triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, có khoảng 31% bệnh nhân bị khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật Một số bệnh thường thấy kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa, phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác Cơ sở di truyền bệnh đề xuất có liên quan đến ảnh hưởng kết hợp biến thể khác 1.2 NHỮNG YẾU TỐ GÂY BỆNH Ở CẤP ĐỘ DI TRUYỀN HỌC 1.2.1 Các biến thể số lượng (CNVs) Nghiên cứu ban đầu (Jacquemont ML, Sanlaville D et al 2006; Sebat J, Lakshmi B et al 2007; Christian SL, Brune CW et al 2008; Marshall CR, Noor A et al 2008) cho thấy gia tăng tần số CNVs quần thể người ASD so với đối chứng (trung bình 6-10 % so với 1-3%, tương ứng) Gần đây, nhiều chứng cho vị trí CNV phù hợp chức đóng vai trị quan trọng số lượng kích cỡ CNV Phân tích chức thể CNVs cho thấy tham gia locus phát triển khớp thần kinh, sợi trục tế bào thần kinh vận động 1.2.2 Các gen “khớp thần kinh”- neuroligins, SHANK neurexins Một vài gen neurologin, SHANK neurexin mã hóa cho protein quan trọng dẫn đến ổn định, trưởng thành hình thành khớp thần kinh tìm thấy, đột biến gen gây hành vi đặc trưng cho kiểu hình bệnh tự kỷ (Craig AM and Kang Y 2007; Südhof TC 2008; Betancur C, Sakurai T et al 2009) 1.2.3 Các gen định hình chất nhiễm sắc (MECP2) Gen MECP2 cần thiết cho phát triển đảm bảo thực chức não Mất MeCP2 trì hỗn hồn thiện tế bào nơron thần kinh khớp nối thần kinh Các đột biến chức MECP2 nguyên nhân hội chứng Rett (Chahrour M and HY 2007) Tuy nhiên, đột biến MECP2 đơi dẫn đến kiểu hình như: chậm phát triển, tâm thần nhẹ biến thể Rett lời nói, phụ thuộc vào biến đổi cụ thể (Lam CW, Yeung WL et al 2000) Đột biến MECP2 tìm thấy bé gái mắc chứng tự kỷ khơng điển hình 1.2.4 Các gen điều khiển phát triển hình thái - (HOXA1, PTEN, EIF4E) Nhiều bệnh nhân hội chứng tự kỷ thường có biểu hình thái mặt có dị tật nhỏ lớn, đầu nhỏ to Những đứa trẻ với biểu tự kỷ thường có hình thái khn mặt nhỏ (Tripi G, Roux S et al 2008) tỷ lệ phát triển đầu/cơ thể không bình thường (Sacco R, Militerni R et al 2007; Chawarska K, Campbell D et al 2011) Khoảng 20% trẻ tự kỷ có đầu to (Sacco R, Militerni R et al 2007), với phát triển đầu vượt trội năm đầu sinh (Courchesne E, Pierce K et al 2007) Ngược lại nhóm nhỏ bệnh nhân mắc chứng tự kỷ nguyên phát có thể nhỏ đầu nhỏ (Sacco R, Militerni R et al 2007) Một số gen quan trọng nhóm HOXA1, PTEN, EIF4E tìm thấy bệnh nhân tự kỷ có bất thường hình thái 1.2.5 Các gen liên quan tới Ca2+ Một nghiên cứu gần cho thấy số trường hợp tự kỷ bất thường nội cân Ca2+trong trình phát triển thần kinh (Krey J and R 2007) Ngoài ra, số nghiên cứu di truyền xác định gen liên quan đến bệnh tự kỷ mã hóa protein trực tiếp gián tiếp kiểm soát Ca2+nội bào quy định cytosolic Ca2+quá độ Các phân tử bao gồm kênh ion, thụ thể • • protein truyền tín hiệu điều khiển Ca2+liên quan tới phát triển thần kinh trung ương CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng lựa chọn 07 trẻ tuổi chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh tự kỷ bác sĩ chuyên khoa Khoa Tâm bệnh - BV Nhi TƯ có tham gia phụ huynh 2.2 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Thủ tục lấy mẫu tuân theo tiêu chuẩn Hội đồng Y đức Viện Nghiên cứu hệ gen số 02/QĐ-NCHG Tuyên bố Helsinki Hội đồng Y khoa giới 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Giải trình gen hệ mới, giải trình tự gen phương pháp Sanger, khuếch đại gen phản ứng PCR, điện di DNA Phân tích liệu phần mềm tin sinh chuyên sâu: Burrows–Wheeler Alignerv 0.7.10, Picard v1.118, … 2.3.1 Giải toàn vùng gen mã hóa Phương pháp giải trình tự tồn vùng mã hóa bao gồm bước chính: thiết lập thư viện DNA; giải trình tự máy; xử lý phân tích liệu (Schuster SC 2008) Sử dụng SureSelect target enrichment system for Illumina paired-end multiplexed sequencing Toàn trình tạo thư viện DNA gồm bước chính: cắt DNA thành đoạn ngắn theo kit; Các đoạn DNA cắt gắn với adaptors indexes cho mẫu; Lai đoạn DNA với trình tự exon biotin hóa gắn hạt từ phủ streptavidin; Loại bỏ phân tử khơng liên kết, trình tự exon byotin hóa thu lại đoạn chứa exon; Khuếch đại đoạn exon mẫu 2.3.2 Phân tích liệu Thư viện DNA sau giải trình tự máy giải trình tự Dữ liệu trình tự xếp so sánh với ngân hàng gen người (hg19) phần mềm BWA phiên 0.7.10 (Li, Durbin, 2009) Bản phân tử loại bỏ cách sử dụng Picard v1.118 Dữ liệu sau phân tích Genome Analysis Toolkit v3.4 để tìm tất vị trí có thay đổi alen với tần số thống kê cao, bao gồm SNPs, đoạn thêm, ngắn CNVs (McKenna, Hanna et al 2010) Biến thể n biến thể ng SNP ến thể đồng hĩa ến thể sai hĩa êm mã a kết thúc ất ba mã giải phần mềm SnpEff v4.1 sở liệu dbSNP v142, 1000Genome, ClinVar, ESP nhằm xác định ảnh hưởng biến thể (Cingolani et al., 2012) Để chọn lọc biến thể tiềm năng, liệu lọc qua bước lọc sau Đầu tiên, biến thể có giá trị MQ < 40 bị loại bỏ Thứ hai, biến thể có giá trị Sift_Pred đánh dấu “Damaging (D)” “NA (‘.’)” giữ lại Thứ ba, chọn lọc biến thể thay Thứ tư, loại bỏ biến thể được biết đến ngân hàng liệu SNPs 142 2.3.7 Phân tích gen mối tương tác Để phân tích gen liên quan đến ASD, liệu gen chứa biến thể bệnh nhân đưa vào hệ thống ASD@Princeton trường đại học Princeton Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân tích mối tương quan gen liên quan đến đặc điểm đặc trưng người bệnh tự kỷ bao gồm: biểu hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÁC ĐỊNH BIẾN THỂ DI TRUYỀN Ở BỆNH NHÂN TỰ KỶ 3.1.1 Xác định giải biến thể Sử dụng công cụ GATK để xác định biến thể, phần mềm SnpEff sử dụng để phân chia biến thể thành nhóm theo mức độ ảnh hưởng chức biến thể Từ bảng kết 3.1 cho thấy, mẫu số T01 cho tổng số SNP 103.840, tổng số Indel 14.843 % tìm thấy dbSNP142 97,3% Tương tự mẫu bệnh nhân cịn lại có số tổng kết trình bày bảng 3.1 Ngoài ra, kết thu từ nhóm biến thể có đến 97% số biến thể đăng ký ngân hàng dbSNP142 (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Kết xác định giải biến thể Mẫu T01 103.840 11.488 Mẫu T02 105.091 11.539 Mẫu T03 103.809 11.322 Mẫu T06 104.497 11.417 Mẫu T07 104.022 11.276 Mẫu T08 103.954 11.447 Mẫu T09 107.192 11.664 10.546 10.734 10.540 10.456 10.423 102.000 10.644 78 38 80 31 95 36 95 38 84 39 34 37 97 42 t thúc ng số biến ể thêm ột biến lệch ung đọc êm ba mã a ất ba mã a tìm thấy SNP142 10 14.843 15.581 14.898 15.077 14.943 14.793 16.192 284 279 273 283 276 275 306 163 156 148 148 158 155 154 207 207 174 178 185 185 198 97,3 97,2 97,4 97,3 97,3 97,3 97,1 Sau trình lọc, gen/biến thể giữ lại thỏa mãn điều kiện: • Gen có khả gây bệnh liên quan thần kinh • Có số MQ>40 (mapping quality) • SIFT_Pred=D, PolyPhen _ Pred =D (Damaging) • Biến thể khơng có sở liệu dbSNP 142 Bảng Số lượng biến thể sau bước lọc 07 bệnh nhân Tên mẫu Dữ liệu gốc T01 T02 T03 T06 T07 T08 T09 118.687 120.672 118.707 119.574 118.965 118.774 123.386 Thuộc gen có tiềm gây bệnh MQ>40 164.980 164.780 164.950 163.250 161.180 163.890 167.470 SIFT_Pred=D Và PolyPhen _ Pred =D Khơng có dbSNP 142 Thuộc 101 gen ASD 330 342 309 319 305 319 304 14 16 19 11 14 12 16 17 16 17 17 15 22 Ở bảng kết 3.2 cho thấy, liệu gốc mẫu T01 118.687 biến thể gen có liên quan đến bệnh thần kinh trải qua bước lọc số MQ >40 (thuộc gen có tiềm gây bệnh) 164.98 biến thể Tiếp tục lọc qua bước biến thể bị đánh giá có ảnh hưởng đến chức protein (SIFT_Pred=D PolyPhen _ Pred =D (Damaging)) giữ lại 330, Trong có 14 biến thể quan tâm khơng có sở liệu dbSNP142, 16 biến thể gen biết liên quan đến ASD Tương tự với mẫu lại trải qua bước lọc số lượng biến thể cịn lại trình chi tiết bảng 3.2 3.1.2 Biến thể di truyền bệnh nhân T01 15 Theo tính tốn số tin cậy mức độ tương tác gen TSC1, TSC2 0,62 Chỉ số tin cậy mức độ tương tác gen NIPBL với gen khác 0,7 Hình 3.4 Sự tương tác gen bệnh nhân T06 1.5.2 Biến thể gen bệnh nhân T06 Bệnh nhân T06 có 18 biến thể 19 gen: BRF1, ABCA13, ATP2B3, CCNL2, CIT, CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16, MUC5B, RSL1D1, RYR3, SGSM3, TTYH1 WDFY4 3.1.6 Biến thể di truyền bệnh nhân T07 3.1.6.1 Biến thể di truyền gen liên quan đến ASD bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 mang 17 biến thể 16 gen liên quan đến ASD biết: ATRX, AUTS2, DLGAP2,FOXP1, KDM5C, KIRREL3, MED12, PTEN, SHANK2, SMG6, KCNJ10, SOX5, SPAST, ST7, VPS13B, CACNA1H 16 gen đưa vào hệ thống phân tích liệu trường Đại học Princeton để phân tích mối tương quan gen Kết phân tích cho thấy, biểu hành vi, giao tiếp, 16 tương tác xã hội, có gen số 16 gen tham gia ATRX, SPAST, KDM5C, SHANK2 Ngoài ra, gen ATRXN1, PCLB1 gen có vai trị quan trọng, thể kích thước màu xanh vịng trịn đại diện (Hình 3.5) Chỉ sộ độ tin cậy mức độ tương tác gen SPAST PPP1R12A 0,55 số tương tác gen ATN1 KDM5C 0,61 Hình 3.5 Sự tương tác gen bệnh nhân T07 3.1.6.2 Biến thể gen bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 có 11 biến thể nằm 10 gen: HECW2, RYR2, PLCH2, SPEN, ADAMTS9, RBM47, IQCE, MUC5B, MUC16, UMODL1 3.1.7 Biến thể di truyền bệnh nhân T08 3.1.7.1 Biến thể di truyền gen liên quan đến ASD bệnh nhân T08 Kết chọn lọc cho thấy, bệnh nhân T08 có 15 biến thể, biến thể nằm 14 gen liên quan dến ASD: CASK, DLGAP2, 17 DOCK4, FOXP1, GABRB3, RBFOX1, RELN, SCN1A, SHANK2, SHANK3, SOX5, CACNA1D, CACNA1F, KCNMA1 Sau đưa liệu gen vào hệ thống phân tích mối tương quan, kết cho thấy quan trọng gen CACNA1F tham gia vào biểu Gen SHANK2 có mối tương quan với gen PLCB1, EFNB2 gen quan trọng hệ thống, biểu hình trịn đại màu xanh Gen CACNA1F liên quan đến gen ACRV1 (Hình 3.6), với số độ tin cậy 0,63 Hình 3.6 Sự tương tác gen bệnh nhân T08 3.1.7.2 Biến thể gen bệnh nhân T08 Đối với kết chọn lọc biến thể gen mới, bệnh nhân T08 có 14 biến thể, gen: KIAA1109, OR52E8, NFRKB, WHSC1L1, FLG, INSRR, IL17RC, MUC5B, BCL9L, ENO2, GGA2, SMTNL2, MUC16, BTAF1 3.1.8 Biến thể di truyền bệnh nhân T09 3.1.8.1 Biến thể di truyền gen liên quan đến ASD bệnh nhân T09 18 Hình 3.7 Sự tương tác gen bệnh nhân T09 Sau bước chọn lọc, kết phân tích bệnh nhân T09 thu 22 biến thể 19 gen biết liên quan đến bệnh tự kỷ: ANKRD11, ARX, ATRX, AVPR1A, CHD7, CNTNAP5, DOCK4, EHMT1, FOXP1, KCNQ5, KLHL3, MED12, MET, NRXN1, OPHN1, RBFOX1, SMC1A, SOX5, CACNA1G Mối tương quan gen với gen liên quan đến biểu đặc trưng bệnh nhân tự kỷ phân tích Kết cho thấy, số 19 gen đưa vào phân tích, gen MET, CACNA1G AVPR1A tham gia biểu AVPR1A đánh giá gen quan trọng hình thành biểu tương tác xã hội, hành vi, giao tiếp MET có vai trị quan trọng biểu hành vi Các gen đánh dấu màu xanh hình trịn đại diện (Hình 3.7).Các mối tương tác gen có số tin cậy 0,6 3.1.8.1 Biến thể gen bệnh nhân T09 Ở bệnh nhân T09, số biến thể tìm thấy gen sau bước chọn lọc 12 biến thể, bao gồm 11 gen CNTN5, PDE4DIP, KDM3B, ABCA1, CTBP2, MUC5B, TRPM7, CCBE1, MUC16, ZNF208, PGC 19 3.2 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SANGER KIỂM CHỨNG CÁC BIẾN THỂ MỚI TRÊN CÁC GEN TIỀM NĂNG 3.2.1 Gen RYR3 Kết WES từ bệnh nhân cho thấy, bệnh nhân T06 T07 mang biến thể gen RYR2 ( bệnh nhân T07) RYR3 (bệnh nhân T06) Như trình bày phần tổng quan tài liệu, nghiên cứu giới cho thấy số trường hợp tự kỷ bất thường nội cân Ca 2+ trình phát triển thần kinh (Krey and Dolmetsch 2007) Ngồi ra, RYR3 chứng minh có vai trị giải phóng ion Ca 2+ kênh canxi đóng vai trị quan trọng việc điều tiết Ca2+ nội bào tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015) Bên cạnh đó, RYRs cịn nằm nhiễm sắc thể 15q14-q14 khu vực nhạy cảm với bệnh tự kỷ (Sorrentino et al, 1993) Kết giải trình tự Sanger biến thể gen RYR3 bệnh nhân T06 (Hình 3.8) cho thấy bệnh nhân mang hai biến thể thay dạng dị hợp tử Bệnh nhân thừa hưởng biến thể p.L111P từ bố biến thể p.R3048C từ mẹ Biến thể (p.L111P) xảy exon 4, T thay C vị trí 332 cDNA, dẫn đến việc thay Leu (L) Pro (P) vị trí 111 protein RYR3 Biến thể thứ hai (p.R3048C) quan sát thấy exon 65, C thay T vị trí 9142, dẫn đến thay đổi amino acid vị trí 3048, nơi Arg (R) thay Cys (C) protein RYR3 Ngồi ra, biến thể p.L111P cịn nằm vùng domain MIR1 protein RYR3 MIR1 nằm vị trí amino acid 100 đến 150 Domain MIR biết đến vùng chức quan trọng RYRs Cả biến thể nằm vùng bảo thủ RYR3 cho thấy mức độ quan trọng vị trí độ biến 20 Hình 3.8 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Leu111Pro p.Arg3048Cys gen RYR3 bệnh nhân T06 3.2.2.Gen RYR2 Hình 3.9 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Arg801Cys gen RYR2 bệnh nhân T07 Tương tự gen RYR3, RYR2 có vai trị giải phóng ion Ca2+ kênh canxi đóng vai trị quan trọng việc điều tiết Ca2+ nội bào tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu AT et 21 al, 2012; Schmunk G et al 2015) Jihane Soueid cộng tìm biến thể trùng lặp gen RYR2 bệnh nhân tự kỷ Lebanese cho thấy liên quan đáng kể gen đến bệnh tự kỷ (Jihane Soueid et al, 2016) Hình 3.10 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể p.Tyr819Cys gen RYR2 bệnh nhân T07 Các nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng RYR2 việc kiểm soát cân nồng độ ion Ca2+ nội mô, liên quan đến vấn đề stress, nhận thức Kết giải trình tự phương pháp Sanger cho thấy, bệnh nhân T07 mang biến thể dị hợp vị trí c.2401 C>T, gây biến đổi protein vị trí 801, amino acid Arg bị biến đổi thành Cys Biến thể di truyền từ người mẹ không mang bệnh Biến thể xảy làm xuất liên kết Hydro amino acid Cys801 Leu803 Biến thể thứ vị trí c.2456A thành G, gây biến đổi amino acid Tyr thành Cys protein vị trí 819 Đây biến thể phát sinh, không di truyền từ bố mẹ Mơ hình mơ cấu trúc khơng gian biến thể cho thấy, biến thể xảy ra, ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc protein, làm xuất cầu nối Hydro Cys801 Leu803 3.2.3 Gen MUC16 22 Kết WES cho thấy tần suất xuất biến thể gen MUC16 bệnh nhân tự kỷ nghiên cứu nhiều 6/7 bệnh nhân mang biến thể gen MUC16 (Bảng 3.3).Các biến thể bệnh nhân gia đình kiểm chứng lại phương pháp giải trình tự Sanger Trong nội dung tóm tắt này, kết giải trình tự phương pháp Sanger bệnh nhân trình bày Kết giải trình tự cho thấy, biến thể biến thể dị hợp tử phát sinh, khơng di truyền từ bố mẹ (Hình 3.11) Bảng 3.3 Tổng hợp biến thể gen MUC16 bệnh nhân tự kỷ STT Bệnh nhân T02 HGVS.c HGVS.p c.6670G>T p.Ala2224Ser c.40707G>C p.Trp13569Cys T03 c.39687T>A p.Asp13229Glu T06 c.39511C>T p.Leu13171Phe c.38605G>A p.Glu12869Lys T07 c.39499G>C p.Val13167Met T08 c.40707G>C p.Trp13569Cys T09 c.6670G>T p.Ala2224Ser 23 Hình 3.11 Kết giải trình tự phương pháp Sanger phát biến thể gen MUC16 bệnh nhân tự kỷ 3.2.4 SNP rs7725785 gen HTR4 rs7725785 phát 4/7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Tuy số cịn nhỏ, chưa có ý nghĩa thống kê, kết góp phần làm sáng tỏ vai trò rs7725785 di truyền bệnh tự kỷ nói chung bệnh tự kỷ Việt Nam nói riêng 24 Hình 3.12 Biến thể c.507+53G>T gen HTR4 BN T01, T07, T08, T09 3.3 CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Hình 13 Các họ kênh ion gen liên quan Gần đây, phương pháp giải trình tự genome, exome áp dụng nhiều nghiên cứu liên kết đa hình biến thể gen nhạy cảm với ASD liên quan đến kênh canxi, natri kali Từ kết WES, thống kê biến thể gen phụ trách kênh vẩn chuyển ion Ca 2+, Na+, K+ (hình 3.13) Có thể thấy rằng, gen chứa biến thể thuộc nhóm gen tham gia vận chuyển ion Ca2+ nhiều Từ cho thấy, vai trị quan trọng kênh vận chuyển ion Ca2+ bệnh tự kỷ CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Dẫn truyền tín hiệu thần kinh tất khía cạnh phát triển não Để hiểu rõ rối loạn ASD, nhà khoa học tìm kiếm gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh Một số gen mã hóa kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn 25 truyền tín hiệu tế bào thần kinh Các biến thể gen liên quan đến kênh ion ảnh hưởng đến tồn tại, khác biệt, di cư, phát triển tự nhiên, hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh Tế bào thần kinh mã hóa thơng tin thơng qua tín hiệu có nguồn gốc từ kênh ion Khi tế bào thần kinh nhận tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thơng qua khớp thần kinh, tùy thuộc vào loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu tế bào thần kinh trở thành tích cực hay tiêu cực Các đột biến gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường kích thích não Những biến đổi gen liên quan đến kênh ion có khả ảnh hưởng đến vơ số chức não (Naisbitt S, Kim E et al 1999; Boeckers TM, Bockmann J et al 2002) Kênh ion chí cung cấp liên kết di truyền mơi trường yếu tố mơi trường thủy ngân tín hiệu tăng canxi Vai trị rộng lớn kênh ion giúp giải thích bệnh nhân ASD thường kèm theo biến chứng thần kinh khác vấn đề giấc ngủ bệnh động kinh 4.2 CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN BỆNH ĐẶC TRƯNG CỦA ASD Bộ kit TruSight Autism hãng Illumina nghiên cứu phát triển để phát biến thể 101 gen chứng minh có liên quan đến bệnh tự kỷ Trong khuôn khổ luận án này, danh sách 101 sử dụng để sàng lọc biến thể từ kết giải trình tồn vùng mã hóa Bảng 4.1 Tổng kết gen liên quan đến bệnh tự kỷ 07 bệnh nhân TT Gen 10 CASK ANKRD11 ATRX AUTS2 AVPR1A CACNA1C CACNA1D CACNA1E CACNA1F CACNA1G T01 x T02 x T03 Bệnh nhân T06 T07 x x x x x T08 T09 x x x x x x x x 2 1 1 1 26 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 CACNA1H CACNA1I CDKL5 CHD7 CNTNAP5 DLGAP2 DOCK4 DPP6 EHMT1 FOXP1 GABRB3 GRIN2B HOXA1 KATNAL2 KCNJ10 KCNMA1 KCNQ5 KDM5C KIRREL3 KLHL3 MED12 MET NEGR1 NIPBL NRXN1 OPHN1 PDE10A PTCHD1 PTEN RBFOX1 RELN SCN1A SCN2A SCN3A SCN5A SCN8A SHANK2 SHANK3 SLC6A4 SMC1A x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 1 1 3 1 1 1 4 1 1 1 1 1 1 1 27 51 SMG6 52 SPAST 53 ST7 54 TCF4 55 TRPM1 56 TSC1 57 TSC2 58 UBE3A 59 VPS13B 60 ZEB2 Tổng Điểm DBC-P Điểm CARS x x x x x x 1 1 2 x x x x x x 11 27/17 x x 14 29/17 42,5 42,5 x x 12 29/1 41,5 13 29/17 14 25/17 12 29/17 17 29/17 40,5 42,5 40,5 44 Trong 07 bệnh nhân tự kỷ có đến 60 gen 101 gen liên quan đến bệnh ASD mang biến thể Trong bệnh nhân, bệnh nhân T09 có nhiều gen mang liên quan đến bệnh tự kỷ biến thể Đây bệnh nhân có điểm CBC-P cao đạt 29/17 điểm CARS cao đạt 44 điểm Bộ kit Bock I cộng sử dụng nghiên cứu họ để chứng minh giải thiết tự phát bệnh ASD (Bock et al, 2016) Trong nghiên cứu nhóm tác giả Bock I, biến thể gen liên quan đến bệnh sàng lọc dựa cơng cụ tin sinh Theo báo cáo, nhóm nghiên cứu sàng lọc 10 biến thể có khả liên quan đến bệnh tự kỷ gen SLC9A9, EHMT1, DPP6, DLGAP2, CREBBP, LAMC3, PIP5K1B, NIPBL, ANKRD11, AUTS2 Gần nhất, Varga báo cáo kết nghiên cứu sử dụng danh sách 101 gen nghiên cứu liên quan loạn chức tỷ thể bệnh tự kỷ Kết cho thấy, đột biến denovo gen CHD7 gây xóa mtDNA hội chứng CHARGE – bệnh nhân mang hội chứng có đến 30% người mắc bệnh tự kỷ Ngoài ra, biến thể gen DHCR7, FOXP2, RAI1 AUTS2, PDE10A, RELN phát bệnh nhân khác Tự kỷ biểu khiếm khuyết tương tác xã hội, khó khăn giao tiếp ngơn ngữ phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp lặp lại (Butler et al, 28 2015) Chính thế, gen quy định biểu quan tâm nghiên cứu nhiều Từ kết WES, áp dụng công cụ phân tích tương tác gen trường Đại học Precenton (Krishnan et al, 2016), gen phân tích biểu Từ đó, bệnh nhân, gen chung liên quan đến biểu đặc điểm điển hình bệnh nhân tìm thấy Trong đó, có đến bệnh nhân (T02, T06, T07, T08) mang biến thể gen SHANK2, bệnh nhân (T01, T03, T06) mang biến thể gen DPP6, bệnh nhân (T01, T02) mang biến thể tren gen CASK Theo nghiên cứu trước đây, biến thể gen CASK xác định từ nhóm ASD (Simons Simplex Collection) nghiên cứu Iossifov cộng (Iossifov et al, 2014) Gần đây, có thêm nhiều chứng, chứng minh nguyên nhân di truyền bệnh tự kỷ từ đột biến gen (Huang and YP, 2017; Stessman et al, 2017) Gen DPP6 mã hóa protein DPP - Dipeptidyl-peptidase 6, tiểu đơn vị kênh dẫn truyền ion K+ A Kv4 Ngồi vai trị làm tăng biểu bề mặt kênh dẫn truyền, DPP6 có vai trị quan trọng vận động bám dính tế bào, ảnh hưởng đến phát triển chức synap vùng đồi thị Vì vậy, gen DPP6 liên quan đến số rối loạn hệ thần kinh trung ương người gồm tự kỷ tâm thần phân liệt (Lin et al, 2013) Nhiều biến thể CNV phát gen DPP6 bệnh nhân tự kỷ (Marshall et al, 2008) Gen SHANK2 thuộc họ gen SHANK bao gồm thành viên (SHANK1, SHANK2 SHANK3) mã hóa cho protein giàn giáo cần thiết cho hình thành cấu trúc chức thích hợp khớp thần kinh Các protein SHANK bao gồm nhiều vùng (domain), protein xoắn hình khăn, sinh kì sau phân bào Chúng liên kết trực tiếp điểm thụ cảm hệ thống dẫn truyền thần kinh, kênh ion protein màng khác đến actin cytoskeleton G-protein Protein SHANK khơng có chức kiểm sốt tổ chức mật độ khớp thần kinh mà cịn có khả tạo phức hệ thụ thể khớp thần kinh, phân tử tín hiệu protein liên quan đến tế bào xương có cột sống (Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002) Đã có nhiều đột biến phát gen SHANK2 bệnh nhân tự kỷ thiểu 29 trí tuệ Một số nghiên cứu xác định đột biến gặp gen SHANK2 người tự kỷ khuyết tật trí tuệ (Berkel et al, 2010; Pinto et al, 2010; Leblond et al, 2012; Sanders et al, 2012) Một nghiên cứu chức phân tích ba đột biến tìm thấy trước bệnh nhân ASD (L1008_P1009dup, T1127M R462X) Các đột biến gây nên bất thường tổng hợp định vị protein, ảnh hưởng đến hình thái tế bào thần kinh, số lượng gai, phân nhánh thần kinh chí dẫn truyền synap hành vi nhận thức chuột số Đặc biệt, đột biến R462X chứng minh gây kiểu hình tự kỷ nặng (Berkel et al, 2012) Có thể thấy rằng, biến thể phát 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam, 60 gen công bố liên quan đến bệnh tự kỷ hoàn toàn phù hợp với biểu lâm sàng 07 bệnh nhân 4.3 CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CÓ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Dẫn truyền tín hiệu thần kinh tất khía cạnh phát triển não Để hiểu rõ rối loạn ASD, nhà khoa học tìm kiếm gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh Một số gen mã hóa kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn truyền tín hiệu tế bào thần kinh Các biến thể gen liên quan đến kênh ion ảnh hưởng đến tồn tại, khác biệt, di cư, phát triển tự nhiên, hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh Tế bào thần kinh mã hóa thơng tin thơng qua tín hiệu có nguồn gốc từ kênh ion Khi tế bào thần kinh nhận tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thông qua khớp thần kinh, tùy thuộc vào loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu tế bào thần kinh trở thành tích cực hay tiêu cực Các đột biến gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến kênh ion canxi (Ca 2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường kích thích não Những biến đổi gen liên quan đến kênh ion có khả ảnh hưởng đến vơ số chức não (Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002) Kênh ion chí cung cấp liên kết di truyền môi trường yếu tố mơi trường thủy ngân tín hiệu tăng canxi Vai trị rộng lớn kênh ion giúp giải thích bệnh nhân ASD thường kèm theo biến chứng thần ... tích tồn vùng mã hóa (exome) số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Xác định biến thể di truyền gen liên quan đến bệnh tự kỷ số người bệnh tự kỷ Việt Nam Nội dung nghiên cứu: Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ Thu... luận sau: Giải trình tự tồn vùng gen mã hóa bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Toàn vùng mã hóa bệnh nhân tự kỷ Việt Nam giải trình tự với độ xác cao, điểm chất lượng đọc Q30 mẫu 95% Sô liệu biến thể thu... kỷ Việt Nam KẾT LUẬN Bằng việc áp dụng phương pháp giải trình tự gen hệ việc giải tồn vùng mã hóa exome bệnh nhân tự kỷ Việt Nam để tìm kiếm biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ, rút số