Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của đề tài là giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người bệnh tự kỷ Việt Nam.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉˉ NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ VÙNG MÃ HĨA (EXOME) Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420116 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI 2018 Cơng trình được hồn thành tại Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ VN Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ VN Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Huy Hồng Viện Nghiên cứu hệ gen 2. GS. TS. Phan Văn Chi Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức Họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Viện Công nghệ sinh học Website: http://luanvan.moet.gov.vn MỞ ĐẦU Tự kỷ (Autism Spectrum Disorders (ASD)) thuộc một nhóm các rối loạn phát triển, khơng đồng nhất về mặt di truyền. Tự kỷ được biểu hiện ra ngồi bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn giao tiếp ngơn ngữ và phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác. Điều đáng nói là hiện nay chưa có phương pháp chữa trị dứt điểm cho bệnh nhân tự kỷ. Các biện pháp được áp dụng hiện nay chỉ để giảm các rối loạn hành vi, các loại thuốc nhằm giảm sự hung hăng, lo âu, trầm cảm,…. Ước tính mới nhất cho thấy rằng ASD ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 68 trẻ em và tỷ lệ mắc bệnh bé trai chiếm ưu thế so với bé gái. Nguy cơ di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau. Trong những nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70 90%, trong khi tỉ lệ này những cặp song sinh khác trứng chỉ 030%. Yếu tố mơi trường cũng có sự tương tác với yếu tố di truyền và gây ra những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não. Giải trình tự tồn bộ vùng mã hóa (WES) đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm gần đây, đặc biệt trong việc xác định các gen bệnh di truyền theo Mendel. Hàng chục nghìn biến thể gen có thể được xác định trong mỗi exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, Đối với con người, trí tuệ là một tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ. Phương pháp này giúp xác định điều kiện di truyền cụ thể với những trường hợp còn nghi ngờ về mặt lâm sàng, cho thấy tầm quan trọng của các biến đổi di truyền trên gen trong hội chứng tự kỷ. Hiện nay, tại Việt Nam việc nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ còn khá mới, và đặc biệt chưa có nghiên cứu nào sử dụng kỹ thuật phân tử cao. Xuất phát từ thực tiễn đó, luận án “Nghiên cứu phát hiện các biến thể một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự tồn bộ vùng mã hóa (exome)” được thực hiện sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích được chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng điều trị bệnh hiệu quả, đúng hướng để nâng cao chất lượng cuộc sống Mục tiêu của đề tài: Giải trình tự và phân tích tồn bộ vùng mã hóa (exome) một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người bệnh tự kỷ Việt Nam Nội dung nghiên cứu: Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình. Giải trình tự tồn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở người Việt Nam Những đóng góp mới của luận án: Đưa ra số liệu các biến thể mới ở người bệnh tự kỷ Việt Nam Xác định 02 biến thể mới (p.L111P và p.R3048C) trên gen RYR3 ở 01 bệnh nhân. Xác định 02 biến thể mới (p.R801C và p.W819C) trên gen RYR2 ở 01 bệnh nhân Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.A2224S; p.W13569C; p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) 06 bệnh nhân Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân. Cấu trúc của luận án: Luận án được trình bày trong 119 trang (khơng kể tài liệu tham khảo và phần phụ lục). Luận án được chia thành các phần: Mở đầu: 03 trang Chương 1. Tổng quan tài liệu: 29 trang Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 13 trang Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 43 trang Chương 4. Bàn luận: 22 trang Kết luận và Kiến nghị: 01 trang Các cơng trình cơng bố của tác giả: 01 trang Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh: 07 trang Luận án gồm 23 bảng, 37 hình, sử dụng 233 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh và một số trang Web. Phần phụ lục Danh sách 101 gen liên quan đến bệnh tự kỷ của hãng Illumina; Kết quả tạo thư viện DNA; Chất lượng dữ liệu của fastq của các mẫu; Thông tin hồ sơ DBC P và CARS của bệnh nhân NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU BỆNH TỰ KỶ Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ Tự Kỷ), bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của cuộc đời, tác động đến sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính như: tương tác xã hội, ngơn ngữ, hành vi. Tự kỷ là một rối loạn mãn tính, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển trí tuệ và hành vi cũng như khả năng học tập, sinh hoạt và khả năng thích ứng của trẻ sau này. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng khơng đồng nhất về mặt di truyền. Tự kỷ được biểu hiện ra ngồi bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngơn ngữ và phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Ngồi những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, có khoảng 31% bệnh nhân bị khuyết tật trí tuệ, 2025% có triệu chứng co giật. Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa, các phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác. Cơ sở di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến sự ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau 1.2. NHỮNG YẾU TỐ GÂY BỆNH Ở CẤP ĐỘ DI TRUYỀN HỌC 1.2.1. Các biến thể số lượng bản sao (CNVs) Nghiên cứu ban đầu (Jacquemont ML, Sanlaville D et al. 2006; Sebat J, Lakshmi B et al 2007; Christian SL, Brune CW et al 2008; Marshall CR, Noor A et al. 2008) cho thấy sự gia tăng tần số của CNVs trong quần thể người ASD so với đối chứng (trung bình 610 % so với 1 3%, tương ứng). Gần đây, nhiều bằng chứng cho rằng vị trí CNV và sự phù hợp chức năng của nó có thể đóng một vai trò quan trọng hơn số lượng và kích cỡ của CNV. Phân tích chức năng của những thể CNVs hiếm đã cho thấy sự tham gia của các locus trong phát triển khớp thần kinh, sợi trục và tế bào thần kinh vận động 1.2.2. Các gen “khớp thần kinh” neuroligins, SHANK và neurexins Một vài gen neurologin, SHANK neurexin mã hóa cho các protein quan trọng dẫn đến sự ổn định, trưởng thành và hình thành khớp thần kinh đã và đang được tìm thấy, đột biến trên các gen này gây ra các hành vi đặc trưng cho kiểu hình của bệnh tự kỷ (Craig AM and Kang Y 2007; Südhof TC 2008; Betancur C, Sakurai T et al. 2009). 10 1.2.3. Các gen định hình chất nhiễm sắc (MECP2) Gen MECP2 rất cần thiết cho sự phát triển và đảm bảo thực hiện đúng chức năng của não. Mất MeCP2 trì hỗn sự hồn thiện của tế bào nơron thần kinh và khớp nối thần kinh. Các đột biến mất chức năng MECP2 là ngun nhân của hội chứng Rett (Chahrour M and HY 2007). Tuy nhiên, đột biến mới của MECP2 đơi khi có thể dẫn đến các kiểu hình như: chậm phát triển, tâm thần nhẹ và các biến thể Rett bằng lời nói, phụ thuộc vào sự biến đổi cụ thể (Lam CW, Yeung WL et al. 2000). Đột biến MECP2 cũng được tìm thấy ở các bé gái mắc chứng tự kỷ khơng điển hình 1.2.4. Các gen điều khiển sự phát triển và hình thái (HOXA1, PTEN, EIF4E) Nhiều bệnh nhân hội chứng tự kỷ thường có biểu hiện hình thái mặt như có các dị tật nhỏ hoặc lớn, đầu nhỏ hoặc to. Những đứa trẻ với biểu hiện tự kỷ thường có hình thái khn mặt nhỏ (Tripi G, Roux S et al. 2008) và tỷ lệ phát triển đầu/cơ thể khơng bình thường (Sacco R, Militerni R et al. 2007; Chawarska K, Campbell D et al. 2011). Kho ảng 20% trẻ tự kỷ có đầu to (Sacco R, Militerni R et al. 2007), với sự phát triển đầu vượt trội trong những năm đầu khi mới sinh ra (Courchesne E, Pierce K et al. 2007). Ngược lại một nhóm nhỏ các bệnh nhân mắc chứng tự kỷ ngun phát có cơ thể nhỏ và đầu nhỏ (Sacco R, Militerni R et al 2007). Một số gen quan trọng trong nhóm này như HOXA1, PTEN, EIF4E đều được tìm thấy những bệnh nhân tự kỷ có sự bất thường về hình thái 1.2.5. Các gen liên quan tới Ca2+ Một nghiên cứu gần đây cho thấy trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca2+trong q trình phát triển thần kinh (Krey J and R. 2007). Ngồi ra, một số nghiên cứu di truyền đã xác định được gen liên quan đến bệnh tự kỷ mã hóa protein hoặc trực tiếp gián tiếp kiểm soát Ca2+nội bào quy định cytosolic Ca2+quá độ. Các phân tử này bao gồm các kênh ion, các thụ thể và các protein truyền tín hiệu điều khiển Ca2+liên quan tới sự phát triển thần kinh trung ương CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 Hình 3.11. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện các biến thể trên gen MUC16 ở các bệnh nhân tự kỷ 3.2.4. SNP rs7725785 trên gen HTR4 rs7725785 được phát hiện trong 4/7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Tuy con số này còn nhỏ, chưa có ý nghĩa thống kê, nhưng kết quả này cũng góp phần làm sáng tỏ hơn nữa vai trò của rs7725785 trong di truyền bệnh tự kỷ nói chung và bệnh tự kỷ ở Việt Nam nói riêng 26 Hình 3.12. Biến thể c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08, T09 3.3. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CĨ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Hình 3. 13. Các họ kênh ion và các gen liên quan Gần đây, phương pháp giải trình tự genome, exome đã được áp dụng nhiều trong nghiên cứu sự liên kết đa hình của các biến thể trên các gen nhạy cảm với ASD và liên quan đến các kênh canxi, natri và kali. Từ kết quả WES, chúng tơi thống kê được các biến thể trên các gen phụ trách các kênh vẩn chuyển ion Ca2+, Na+, K+ (hình 3.13). Có thể thấy rằng, các gen chứa biến thể thuộc nhóm gen tham gia vận chuyển ion Ca2+ nhiều nhất. Từ đó cho thấy, vai trò quan trọng của kênh vận chuyển ion Ca2+ đối với bệnh tự kỷ CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CĨ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Dẫn truyền tín hiệu thần kinh hầu như là tất cả các khía cạnh của sự phát triển não bộ. Để hiểu rõ hơn về các rối loạn ASD, các nhà khoa học đang tìm kiếm các gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh. Một số các gen mã hóa các kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh. Các biến thể trong các gen liên quan đến 27 các kênh ion có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại, sự khác biệt, di cư, phát triển tự nhiên, và sự hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh. Tế bào thần kinh mã hóa thơng tin thơng qua các tín hiệu có nguồn gốc từ các kênh ion. Khi một tế bào thần kinh nhận được tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thơng qua các khớp thần kinh, tùy thuộc vào các loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh sẽ trở thành tích cực hay tiêu cực. Các đột biến trong các gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến các kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường kích thích não bộ. Những biến đổi trong các gen liên quan đến kênh ion có khả năng ảnh hưởng đến vơ số các chức năng não bộ ( Naisbitt S, Kim E et al . 1999 ; Boeckers TM, Bockmann J et al . 2002 ). Kênh ion thậm chí có thể cung cấp một liên kết giữa di truyền và mơi trường bởi vì các yếu tố mơi trường như thủy ngân là tín hiệu tăng canxi. Vai trò rộng lớn của các kênh ion có thể giúp giải thích tại sao các bệnh nhân ASD thường kèm theo biến chứng thần kinh khác như vấn đề giấc ngủ và bệnh động kinh 4.2 CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN BỆNH ĐẶC TRƯNG CỦA ASD Bộ kit TruSight Autism của hãng Illumina được nghiên cứu và phát triển để phát hiện các biến thể trên 101 gen đã được chứng minh có liên quan đến bệnh tự kỷ. Trong khn khổ luận án này, danh sách 101 được sử dụng để sàng lọc các biến thể từ kết quả giải trình tồn bộ vùng mã hóa Bảng 4.1. Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ 07 bệnh nhân Bện h TT Gen nhâ n CA SK AN KR D11 ATR X T01 T02 x x T03 T06 T07 T08 T09 x x x x x 28 10 11 12 13 14 15 AU TS2 AV PR 1A CA CN A1 C CA CN A1 D CA CN A1E CA CN A1F CA CN A1 G CA CN A1 H CA CN A1I CD KL5 CH D7 CN TN x x x x 1 x x x x x 1 x x x x 29 AP5 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 DL GA P2 DO CK DP P6 EH MT FO XP1 GA BR B3 GRI N2 B HO XA1 KAT NA L2 KC NJ1 KC NM A1 KC NQ x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 30 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 KD M5 C KIR RE L3 KL HL3 ME D12 ME T NE GR NIP BL NR XN OP HN PD E10 A PT CH D1 PT EN RB FO X1 RE LN x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 31 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 SC N1 A SC N2 A SC N3 A SC N5 A SC N8 A SH AN K2 SH AN K3 SL C6 A4 SM C1 A SM G6 SPA ST 53 ST7 54 TC F4 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 32 55 56 57 58 59 60 TR PM TS C1 TS C2 UB E3A VP S13 B ZE B2 x x x x x x x x x Tổng 11 14 12 13 14 12 17 Điểm DBC-P 27/1 42,5 29/1 42,5 29/ 17 41, 29/1 40,5 25/1 42,5 29/1 40,5 29/1 44 Điểm CARS Trong 07 bệnh nhân tự kỷ có đến 60 gen 101 gen liên quan đến bệnh ASD mang biến thể Trong bệnh nhân, bệnh nhân T09 có nhiều gen mang liên quan đến bệnh tự kỷ biến thể Đây bệnh nhân có điểm CBC-P cao đạt 29/17 điểm CARS cao đạt 44 điểm Bộ kit này đã được Bock I và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu của họ để chứng minh giải thiết về sự tự phát của bệnh ASD (Bock et al, 2016). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Bock I, các biến thể gen liên quan đến bệnh cũng được sàng lọc dựa trên các cơng cụ tin sinh. Theo báo cáo, nhóm nghiên cứu đã sàng lọc được 10 biến thể có khả năng liên quan đến bệnh tự kỷ trên các gen SLC9A9, EHMT1, DPP6, DLGAP2, CREBBP, LAMC3, PIP5K1B, NIPBL, ANKRD11, AUTS2 Gần đây nhất, Varga cũng báo cáo một kết quả nghiên cứu sử dụng danh sách 101 gen này trong nghiên cứu về sự liên quan giữa rồi loạn chức năng tỷ thể và bệnh tự kỷ. Kết quả cho thấy, một đột biến denovo trên gen CHD7 gây ra sự xóa mtDNA và hội chứng CHARGE – bệnh nhân mang hội chứng 33 này có đến 30% người mắc bệnh tự kỷ. Ngồi ra, các biến thể trên các gen DHCR7, FOXP2, RAI1 AUTS2, PDE10A, RELN cũng được phát hiện ở các bệnh nhân khác Tự kỷ biểu khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngơn ngữ và phi ngơn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại (Butler et al, 2015). Chính vì thế, các gen quy định những biểu hiện này đã được quan tâm và nghiên cứu nhiều. Từ kết quả WES, áp dụng cơng cụ phân tích sự tương tác giữa các gen của trường Đại học Precenton (Krishnan et al, 2016), các gen đã được phân tích trong từng biểu hiện. Từ đó, mỗi bệnh nhân, các gen chung liên quan đến sự biểu hiện các đặc điểm điển hình của từng bệnh nhân được tìm thấy. Trong đó, có đến 4 bệnh nhân (T02, T06, T07, T08) mang biến thể trên gen SHANK2, 3 bệnh nhân (T01, T03, T06) mang biến thể trên gen DPP6, 2 bệnh nhân (T01, T02) mang biến thể tren gen CASK Theo các nghiên cứu trước đây, một biến thể trên gen CASK được xác định từ một nhóm ASD (Simons Simplex Collection) trong nghiên cứu của Iossifov và cộng sự (Iossifov et al, 2014). Gần đây, đã có thêm nhiều bằng chứng, chứng minh nguyên nhân di truyền của bệnh tự kỷ từ các đột biến trên gen này (Huang and YP, 2017; Stessman et al, 2017). Gen DPP6 mã hóa protein DPP Dipeptidylpeptidase 6, là một tiểu đơn vị của kênh dẫn truyền ion K+ tp A Kv4. Ngồi vai trò làm tăng biểu hiện trên bề mặt kênh dẫn truyền, DPP6 còn có vai trò quan trọng trong sự vận động và bám dính của tế bào, ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của synap vùng đồi thị. Vì vậy, gen DPP6 liên quan đến một số rối loạn hệ thần kinh trung ương ở người gồm tự kỷ và tâm thần phân liệt (Lin et al, 2013). Nhiều biến thể CNV đã được phát hiện trên gen DPP6 ở bệnh nhân tự kỷ (Marshall et al, 2008) Gen SHANK2 thuộc họ gen SHANK bao gồm thành viên (SHANK1, SHANK2 SHANK3) mã hóa cho các protein giàn giáo cần thiết cho sự hình thành cấu trúc và chức năng thích hợp của các khớp thần kinh. Các protein SHANK đều bao gồm nhiều vùng (domain), là những protein xoắn hình khăn, được sinh ra tại kì sau phân bào. Chúng liên kết trực tiếp điểm thụ cảm hệ thống dẫn truyền thần kinh, các kênh ion protein màng khác đến actin cytoskeleton Gprotein Protein SHANK khơng những có chức năng kiểm sốt tổ chức mật độ 34 khớp thần kinh mà còn có khả năng tạo phức hệ thụ thể khớp thần kinh, phân tử tín hiệu và protein liên quan đến tế bào xương có trong cột sống (Naisbitt et al, 1999; Boeckers et al, 2002). Đã có rất nhiều đột biến được phát hiện trên gen SHANK2 những bệnh nhân tự kỷ và thiểu năng trí tuệ. Một số nghiên cứu đã xác định những đột biến hiếm gặp trong gen SHANK2 những người tự kỷ và khuyết tật trí tuệ (Berkel et al, 2010; Pinto et al, 2010; Leblond et al, 2012; Sanders et al, 2012). Một nghiên cứu chức năng đã phân tích ba đột biến được tìm thấy trước đây những bệnh nhân ASD (L1008_P1009dup, T1127M và R462X). Các đột biến gây nên sự bất thường trong sự tổng hợp và định vị của protein, ảnh hưởng đến hình thái của tế bào thần kinh, số lượng đi gai, phân nhánh thần kinh thậm chí là sự dẫn truyền của synap và hành vi nhận thức chuột số. Đặc biệt, đột biến R462X đã được chứng minh gây ra kiểu hình tự kỷ nặng nhất (Berkel et al, 2012) Có thể thấy rằng, các biến thể mới được phát hiện 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam, trên 60 gen đã được cơng bố liên quan đến bệnh tự kỷ hồn tồn phù hợp với các biểu hiện lâm sàng của 07 bệnh nhân 4.3. CÁC GEN NHẠY CẢM VỚI ASD CĨ LIÊN QUAN ĐẾN KÊNH ION Dẫn truyền tín hiệu thần kinh hầu như là tất cả các khía cạnh của sự phát triển não bộ. Để hiểu rõ hơn về các rối loạn ASD, các nhà khoa học đang tìm kiếm các gen bệnh tự kỷ liên kết điều tiết hoạt động thần kinh. Một số các gen mã hóa các kênh ion mà kích hoạt chuỗi dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh. Các biến thể trong các gen liên quan đến các kênh ion có thể ảnh hưởng đến sự tồn tại, sự khác biệt, di cư, phát triển tự nhiên, và sự hình thành khớp thần kinh tế bào thần kinh. Tế bào thần kinh mã hóa thơng tin thơng qua các tín hiệu có nguồn gốc từ các kênh ion. Khi một tế bào thần kinh nhận được tín hiệu từ tế bào thần kinh khác thơng qua các khớp thần kinh, tùy thuộc vào các loại kênh ion dẫn truyền tín hiệu của tế bào thần kinh sẽ trở thành tích cực hay tiêu cực. Các đột biến trong các gen nhạy cảm với ASD có liên qua đến các kênh ion canxi (Ca2+), natri (Na+), kali (K+) thường tăng cường kích thích não bộ. Những biến đổi trong các gen liên quan đến kênh ion có khả năng ảnh hưởng đến vơ số chức não ( Naisbitt et al , 1999 ; Boeckers et al , 2002 ). Kênh ion thậm chí có thể cung cấp một liên kết giữa di truyền và mơi trường bởi vì các yếu tố mơi trường như thủy ngân 35 là tín hiệu tăng canxi. Vai trò rộng lớn của các kênh ion có thể giúp giải thích tại sao các bệnh nhân ASD thường kèm theo biến chứng thần kinh khác như vấn đề giấc ngủ và bệnh động kinh Kết quả giải trình tự tồn bộ gen vùng mã hóa từ 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam cho thấy, các bệnh nhân này cũng mang những biến thể trên các kênh vận chuyển ion quan trọng. Đây chính là những yếu tố góp phần biểu hiện bệnh ở người bệnh tự kỷ Việt Nam 4.4. BIẾN THỂ TRÊN GEN RYR2 VÀ RYR3 RYR2 RYR3 đều thuộc họ thụ thể ryanodine là một trong nhóm kênh canxi hoạt động theo chất dẫn chuyền quan trọng nhất. Các thụ thể Ryanodine (RyRs) tạo thành một lớp các kênh canxi nội bào có ở các mơ động như cơ và nơron (Santulli G and AR. 2015) (Hình 2). RYRs hoạt động ở vùng mạng lưới nội chất màng, có nhiệm vụ điều chỉnh Ca2+ nội bào. Có ba đồng vị chính của thụ thể ryanodine, được tìm thấy trong các mơ khác nhau và tham gia vào các con đường tín hiệu khác nhau liên quan đến sự phóng thích canxi từ các cơ quan nội bào Jihane Soueid và cộng sự đã tìm những biến thể trùng lặp trên gen RYR2 ở bệnh nhân tự kỷ Lebanese cho thấy sự liên quan đáng kể của gen này đến bệnh tự kỷ (Jihane Soueid, Silva Kourtian et al. 2016). Trong nghiên cứu về mức độ ảnh hưởng chức năng của RYR3, chuột bị loại bỏ gen RYR3 cho thấy sự suy giảm và rối loạn trong hoạt động, chúng cũng cho biểu hiện mức độ tăng động thái quá. Những kết quả này chỉ ra rằng RYR3 có một vai trò quan trọng hoạt động vận động hoạt động (Naoki Matsuo, Koichi Tanda et al. 2009). Với việc tìm ra những biến thể mới trên gen RYR2 và RYR3 ở bệnh nhân tự kỷ Việt Nam, kết quả của nghiên cứu này góp phần khẳng định thêm mối liên quan của họ gen RYRs đối với ngun nhân gây bệnh ASD 4.5. BIẾN THỂ TRÊN GEN MUC16 Protein MUC16 mucin biểu hiện trên đường niêm mạc ruột và hạch bạch huyết thường nằm gần lớp niêm mạc. Mucin là một đại phân tử Oglycosyl hố xun màng, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành hàng rào bảo vệ lớp niêm mạc. Các cytokine kích hoạt q trình gây viêm như TNFα dẫn đến giảm biểu hiện của gene bài tiết như MUC16, trong khi đó MUC16 lại có vai trò bảo vệ lớp niêm mạc của tế bào chống lại các tác nhân gây viêm ruột. Triệu chứng viêm các lớp niêm mạc của đường dạ dày – ruột đã được chứng minh có liên hệ gián 36 tiếp với các bệnh nhân tự kỷ. Đặc biệt, trong nghiên cứu của Gerald J Mizejewski và cộng cự năm 2015, MUC16 nằm trong 15 chỉ thị phân tử, thuộc nhóm thứ 3 dùng để đánh giá bệnh tự kỷ (Mizejewski GJ, Lindau Shepard B et al. 2013). Những dẫn chứng này hồn tồn phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tơi. 6/7 bệnh nhân tự kỷ mang biến thể dị hợp trên gen MUC16, các bệnh nhân này khi được kiểm tra lại lâm sàng đều cho thấy những biểu hiện bất thường về tiêu hóa. Có thể nói rằng, các biến thể trên gen này tuy khơng phải là ngun nhân chính gây bệnh tự kỷ, nhưng nó là yếu tố làm tăng mức độ biểu hiện bệnh ở người bệnh tự kỷ 4.6. ĐA HÌNH rs7725785 TRÊN GEN HTR4 Đa hình rs7725785 là một trong 18 biến thể đã được chứng minh có mối liên quan đến bệnh ASD (Hu VW, Addington A et al 2011) rs7725785 được đánh giá là có liên quan đến biểu hiện suy giảm ngơn ngữ người bệnh ASD. Đặc biệt, rs7725785 còn được thống kê biểu hiện ở cả ba mức độ bệnh (nghiêm trọng trung bình – nhẹ). Biến thể di truyền trên gen HTR4 cũng có liên quan đến bệnh tâm thần phân liệt (Suzuki T, Iwata N et al. 2003; Kato T, Kuratomi G et al. 2005), r ối lo ạn lưỡng cực và rối loạn tăng động / thiếu tập trung (Li J, Wang Y et al 2007), tiếp tục gợi ý một số chồng chéo chức năng giữa các rối loạn thần kinh này. Gần đây, một sự dịch chuyển de novo trên nhiễm sắc thể 5 gần HTR4 đã được xác định trong một bé trai tự kỷ (Vincent JB, Noor A et al. 2009), tăng thêm bằng chứng về mối liên quan của gen này đến bệnh ASD. Gen HTR4 tham gia vào nhiều quá trình sinh học trong cơ thể điều hòa sinh học thần kinh, tăng cường tiềm năng điện dài hạn (long term synaptic potentiation ), khả năng học tập và trí nhớ, cũng như giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh (dopamine, acetylcholine), các hormon peptide (AVP, OXT, PRL, VIP) và các hợp chất steroid (cortisol, corticosterone). Vì vậy, bất kỳ sự thay đổi nào trong cấu trúc hoặc chức năng của gen này có thể dẫn đến những hậu quả trên phạm vi rộng đối với các q trình được biết là bị ảnh hưởng bởi ASD Đa hình rs7725785 (c.507+53G>T) chưa được nghiên cứu cụ thể Việt Nam. Theo thống kê của ngân hàng dbSNP, trong khoảng 1000 người Việt Nam, tỷ lệ allen G là 0.702, allen T là 0.298. Đối với một số nước lân cận như Trung Quốc, Nhật Bản, cũng có tỷ lệ allen G cao hơn hẳn allen T, tương ướng 0.7688(G)/0.2312(T) Trung Quốc và 37 0.671(G)/0.30289(T) ở Nhật Bản. Trong nghiên cứu của chúng tơi, chỉ có 7 bệnh nhân, nhưng chúng tơi cũng phát hiện được đa hình trên 4 bệnh nhân tự kỷ. Vì lượng mẫu ít, nên tỷ lệ này chưa có ý nghĩa về thơng kê. Tuy nhiên, kết quả này cũng góp phần bổ sung số liệu gen liên quan đến ASD và mở ra các hướng nghiên cứu sâu hơn về đa hình này người bệnh tự kỷ Việt Nam KẾT LUẬN Bằng việc áp dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới trong việc giải tồn bộ vùng mã hóa exome 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam để tìm kiếm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ, chúng tơi đã rút ra một số kết luận sau: 1. Giải trình tự tồn bộ vùng gen mã hóa của 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Tồn bộ vùng mã hóa của 7 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam đã được giải trình tự với độ chính xác cao, điểm chất lượng đọc Q30 ở các mẫu đều trên 95%. Sơ liệu các biến thể thu được rất lớn, lên đến trên 123.386 biến thể (Mẫu T09), các mẫu còn lại đều thu được trên 118.500 biến thể 2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người bệnh tự kỷ Việt Nam Số liệu biến thể trên các gen thuộc 101 gen có liên quan đến tự kỷ (Gene Tests và ApolloGen) 07 bệnh nhân được đưa ra đầy đủ và chính xác Ngồi ra, các biến thể trên các gen cũng được xác định Trong đó, bệnh nhân T06, trên gen RYR3 phát hiện được 2 biến thể thay thế mới p.L111P và p.R3048C. Trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 phát hiện và 2 biến thể thay thế mới p.Arg801Cys, p.Tyr819Cys. 6 biến thể (p.A2224S; p.W13569C; p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) trên gen MUC16 được phát hiện 06 bệnh nhân T02, T03, T06, T07, T08, T09. Đặc biệt, đa hình rs7725785 (c.507+53G>T) trên gen HTR4 được tìm thấy ở bệnh nhân T01, T07, T08 và T09, Các bước phân tích và phát hiện biến thể di truyền ở người bệnh tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự tồn bộ vùng mã hóa bước đầu được xây dựng. Kết quả này đã hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng trong điều trị cụ thể từng bệnh nhân KIẾN NGHỊ 38 Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự exome trên số lượng lớn người bệnh tự kỷ để tìm ra các biến thể di truyền trên các gen có lên quan đến bệnh mang tính đặc trưng cho người Việt Nam. DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Thu Hien Nguyen, Thi Thanh Ngan Nguyen, Bac Viet Le, Ngoc Minh Thanh, Thi Kim Lien Nguyen, Van Hai Nong & Huy Hoang Nguyen (2016) Wholeexome sequencing identifies two novel missense mutations (p.L111P and p.R3048C) of RYR3 in a Vietnamese patient with autism spectrum disorders Genes & Genomics, v.39, no.3, 2017 March, p.301(6) (ISSN: 19769571). DOI 10.1007/s13528016 04952 Nguyễn Thu Hiền, Nông Văn Hải, Nguyễn Huy Hoàng (2015). Giải trình tự gen hệ trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4): 989 998 Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Ngọc Lan, Nguyễn Văn Tụng, Thành Ngọc Minh, Phan Văn Chi, Nguyễn Huy Hồng (2017). Ứng dụng cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ mới và các phần mềm tin sinh học trong việc đánh giá sơ biến thể di truyền người bệnh tự kỷ Việt Nam. Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 433439 Nguyễn Thu Hiền, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, 39 Nguyễn Văn Tụng, Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Thanh Ngân, Nguyễn Ngọc Lan (2018). Phát hiện đa hình rs7725785 trên gen HTR4 ở người bệnh tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự tồn bộ vùng gen mã hóa. Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018: 659664 ... thực tiễn đó, luận án Nghiên cứu phát hiện các biến thể một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự tồn bộ vùng mã hóa (exome) được thực hiện sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích được... một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người bệnh tự kỷ Việt Nam 7 Nội dung nghiên cứu: Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ... Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình. Giải trình tự tồn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở người Việt Nam