Mục tiêu nghiên cứu của luận án là tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống chuyển gen tối ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VECTOR NHỊ THỂ MỚI ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN vào hồi….giờ….ngày… tháng… năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nấm sợi loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho ngƣời nhƣng chúng gây thiệt hại khơn lƣờng cho sản xuất nông nghiệp Nấm sợi Aspergillus niger đƣợc sử dụng rộng rãi sản xuất công nghiệp nhiều loại enzyme axit hữu cơ, nấm Penicillium chrysogenum lại loài tiếng sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh β-lactam đƣợc phát sản xuất quy mô công nghiệp Việc khai thác lồi nấm sợi sẵn có tự nhiên để sản xuất enzyme, axit hữu chất có hoạt tính sinh học có giới hạn Mặc dù nhiều chủng đột biến A niger P chrysogenum có khả sinh tổng hợp hàm lƣợng cao sản phẩm đƣợc tạo nhờ phƣơng pháp vật lý hóa học Tuy nhiên phƣơng pháp tạo thể đột biến ngẫu nhiên khó xác định đƣợc gen đích bị gây hỏng Do nghiên cứu cải tiến, nâng cấp lực cho chủng tự nhiên cách can thiệp trực tiếp, có định hƣớng vào hệ gen nấm việc làm cần thiết, mang tính ứng dụng cao Bên cạnh đó, đối sản xuất nơng nghiệp, vi nấm liên quan mật thiết đến suất trồng bảo quản sản phẩm sau thu hoạch Nấm Penicillium digitatum đƣợc coi tác nhân gây hỏng nghiêm trọng loại có múi giai đoạn sau thu hoạch Việc nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò gen gây bệnh P digitatum góp phần việc định hƣớng phát triển giải pháp “xanh” hiệu bảo quản nông sản sau thu hoạch Nghiên cứu hƣớng đến phát triển giải pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi khác Việc phối hợp tối ƣu hóa phƣơng pháp chuyển gen xây dựng đƣợc hệ thống vector nhị thể tảng để triển khai nghiên cứu chuyên sâu điều tra chức gen vi nấm Mục tiêu đề tài - Tạo đƣợc vector nhị thể thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum Penicillium digitatum - Điều tra đƣợc vai trị gen laeA ba lồi nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu thiết lập Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đây công trình nghiên cứu đƣợc thực cách có hệ thống Việt Nam giới phát triển vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền ba loài nấm sợi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đề tài chứng minh hiệu hệ vector tạo đƣợc cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu gen, xóa gen ba lồi nấm sợi khác Những đóng góp luận án * Đã tạo thành công vector nhị thể dùng cho biểu gen, xóa gen bổ trợ gen ba loài nấm sợi gồm A niger, P chrysogenum P digitatum * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao sử dụng vi khuẩn A tumefaciens ba loài nấm sợi nghiên cứu Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn dựa chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập nấm sợi A niger P chrysogenum Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh P chrysogenum P digitatum đƣợc tối ƣu hiệu chuyển gen đạt đƣơc cao từ 10 đến 20 lần so với nghiên cứu trƣớc * Đây cơng trình nghiên cứu chứng minh việc xóa, phục hồi biểu mức gen laeA đƣợc thực thành cơng ba lồi nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu phát vai trị hồn tồn gen laeA điều hịa biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất kiểm soát khả gây bệnh sau thu hoạch Bố cục luận án Bố cục luận án gồm 163 trang, bảng 43 hình Cụ thể: Mở đầu trang; Chƣơng Tổng quan tài liệu 35 trang; Chƣơng Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 19 trang; Chƣơng Kết thảo luận 70 trang; Kết luận kiến nghị trang; Danh mục cơng trình trang; Tài liệu tham khảo 30 trang CHƢƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM A niger, P chrysogenum VÀ P digitatum Aspergillus niger loài phổ biến khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus A niger vi nấm mơ hình quan trọng số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu trình sinh tổng hợp protein, enzyme, chế phân tử chế liên quan tới việc kiểm sốt đặc điểm hình thái nấm P digitatum nấm gây bệnh thực vật thuộc loài Penicillium đƣợc giải mã toàn hệ gen Nhiều nghiên cứu chế gây bệnh nấm P digitatum mức độ phân tử cho thấy số gen đóng vai trò quy định độc lực nấm P digitatum Tuy nhiên nay, việc điều tra vai trò gen quy định độc lực gây bệnh nấm P digitatum tiếp tục đƣợc thực Nấm P chrysogenum đƣợc nghiên cứu từ lâu, nhiên tới năm 2008 hệ gen loài nấm đƣợc giải trình tự tồn Ứng dụng bật nấm mốc P chrysogenum khả sinh kháng sinh penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, đặc biệt sau đƣợc xử lý đột biến 1.2 PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A tumefaciens (ATMT) Để thực nghiên cứu cải biến di truyền nấm sợi phƣơng pháp chuyển gen cơng cụ thiếu Hiện nay, số phƣơng pháp chuyển gen đƣợc sử dụng phổ biến nấm sợi chuyển gen qua tế bào trần (protoplast) chuyển gen trung gian qua vi khuẩn A.tumefaciens Với phƣơng pháp chuyển gen thông qua tế bào trần, đoạn DNA vector mang gen mong muốn đƣợc chuyển trực tiếp vào tế bào Tuy nhiên, trình chuẩn bị tế bào trần nhƣ bƣớc chuyển gen phức tạp, tốn nhiều cơng sức, chi phí cao khơng ổn định, địi hỏi ngƣời thực phải có nhiều kinh nghiệm, áp dụng rộng rãi phịng thí nghiệm vừa nhỏ Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens kể từ công bố đến đƣợc áp dụng thành cơng nhiều lồi nấm khác nhau, thực phƣơng pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu đạt đƣợc cao 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI LaeA (loss of aflR-expression A) protein có vai trị đa nấm sợi nói chung LaeA đƣợc xem nhƣ protein điều hịa quan trọng tƣơng tác với nhiều protein khác, có phức hệ velvet tiếng Xét khía cạnh protein, LaeA sở hữu vùng chuyển nhóm methyl tham gia vào việc điều hịa q trình trao đổi chất phát triển nấm Trong cấu trúc protein, vùng cấu trúc phụ thuộc S-adenosylmethione (SAM) có hoạt tính chuyển nhóm methyl tƣơng đồng với enzyme chuyển nhóm methyl cho axit amin arginin Các nghiên cứu gần LaeA protein velvet gồm VeA, VelB, VelC VosA hoạt động nhƣ protein điều hòa chủ chốt trình phát triển trao đổi chất bậc hai nấm thơng qua việc hình thành phức hệ nhƣ LaeA/VeA/VelB, VeA/VelB, VelB/VosA, VelB/VelB, VelC/VosA, VelC/VeA Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng nghiên cứu gồm: DH5α, Escherichia coli Penicillium digitatum Agrobacterium PdVN1, tumefaciens Penicillium digitatum AGL1, N11, Penicillium chrysogenum VTCC-F1170, Penicillium chrysogenum VTCC-F1172, Aspergillus niger N402, Aspergillus niger CBS 113.46 Staphylococcus aureus ATCC25923 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phân lập, định danh chủng nấm mốc gây hỏng cam 2.2.2 Thu bào tử hệ sợi nấm 2.2.3 Đánh giá khả mẫn cảm kháng sinh 2.2.4 Tách chiết DNA 2.2.5 Tạo vector nhị thể dùng cho chuyển gen 2.2.6 Tối ƣu quy trình chuyển gen nấm A niger, P digitatum P chrysogenum thông qua vi khuẩn A tumefaciens 2.2.7 Xóa phục hồi gen laeA nấm sợi nghiên cứu 2.2.8 Sàng lọc xác nhận thể chuyển gen 2.2.9 Điều tra vai trò gen laeA loài nấm sợi nghiên cứu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng pháp ATMT marker gen kháng kháng sinh Đây nghiên cứu tỷ lệ dƣơng tính giả chuyển gen vào A niger với marker chọn lọc gen kháng kháng sinh Đồng thời, nhận thấy nồng độ kháng sinh hygromycin dùng chuyển gen cao Nhƣ vậy, việc chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng marker chọn lọc gen kháng hygromycin tỏ không hiệu với chủng A niger 3.1.2 Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm P chrysogenum P digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh Hình 3.6 Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P chrysogenum P digitatum Chúng thiết lập thành cơng quy trình chuyển gen hiệu cao cho chủng P digitatum PdVN1 chủng P chrysogenum VTCC-F1172 (Hình 3.6) Với quy trình này, P digitatum PdVN1, hiệu suất chuyển gen đạt 1240 ± 165 thể chuyển gen, cao 20 lần so với công bố trƣớc chủng Pd01 Với P chrysogenum VTCC-F1172, hiệu suất chuyển gen đạt 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử, cao gấp 10 lần so với công bố trƣớc chủng DS17690 Tính tới thời điểm tại, đƣợc coi quy trình chuyển gen hiệu loài nấm P digitatum P chrysogenum Đồng thời, báo cáo việc biểu thành cơng gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed P digitatum huỳnh quang xanh GFP nấm P chrysogenum phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đặc biệt nghiên cứu này, chứng minh gen kháng phleomycin marker hiệu cho chuyển gen biểu gen nấm P chrysogenum P digitatum 3.2 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A niger VÀ P chrysogenum Lần việc xóa gen pyrG tạo thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thực thành cơng hai lồi nấm A niger P chrysogenum phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens Nghiên cứu xây dựng đƣợc hệ thống chuyển gen với hiệu cao dựa gen trợ dƣỡng pyrG sinh tổng hợp uridine/uracil (marker trợ dƣỡng pyrG) hai lồi nấm A niger P chrysogenum Các thơng số tối ƣu cho hệ thống chuyển gen nồng độ bào tử cho chuyển gen 106 bào tử/ml, đồng nuôi cấy 22°C môi trƣờng cảm ứng (induction medium, IM) bổ sung 0,02% uridine 0,02 % uracil, IM giai đoạn cảm ứng bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy 60 Đây nghiên cứu thiết lập thành công hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil mà không cần sử dụng đến gen kháng kháng sinh hai loài nấm Đây bƣớc tiến vƣợt trội hệ thống chuyển gen thiết lập đƣợc đƣợc sử dụng cho nghiên cứu tái tổ hợp mang tính ứng dụng tƣơng lai Hình 3.23 Sự sinh trƣởng hình thành bào tử chủng A niger nguồn cacbon khác Trên mơi trƣờng có galactose, lactose, tinh bột xylan, chủng xóa gen laeA hình thành bào tử Đặc biệt bào tử chủng xóa gen nguồn cacbon lactose giảm tới 93,75% nguồn cacbon xylan giảm 70,55% so với chủng tự nhiên * Gen laeA ảnh hưởng đến khả sinh trưởng nguồn nitơ Hình 3.24 Sự sinh trƣởng hình thành bào tử chủng A niger nguồn nitơ nitrat ammonium Đây lần mối liên quan gen laeA với nguồn nitơ đƣợc nghiên cứu nấm A niger Chúng phát điểm chƣa đƣợc công bố trƣớc vai trị gen laeA biệt hóa hình thái hình thành bào tử nấm A niger nguồn nitơ ammonium * Gen laeA ảnh hưởng đến khả phân giải cellulose A.niger Hình 3.25 Khả sinh enzyme cellulase chủng A niger Việc xóa gen laeA làm khả sinh tổng hợp enzyme cellulase A niger Đây phát chƣa đƣợc cơng bố vai trị gen laeA điều hịa kiểm sốt khả sinh enzyme cellulase A niger * Gen laeA ảnh hưởng tới khả gây hỏng A niger Sau 10 ngày, thơng qua xác định đƣờng kính vết lây nhiễm nhận thấy khả gây hỏng táo chủng xóa gen laeA giảm so với chủng tự nhiên chủng phục hồi trung bình khoảng 44,25% (Hình 3.26A) Tƣơng tự, chủng xóa gen laeA giảm khả gây hỏng nho khoảng 53,33% (Hình 3.26B) Điều chứng tỏ gen laeA đóng vai trị định việc gây hỏng sau thu hoạch nấm A niger Phát chƣa đƣợc công bố trƣớc Hình 3.26 Khả gây hỏng sau thu hoạch chủng A niger (A) Gây hỏng táo (B) Gây hỏng nho 3.3.2 Nghiên cứu vai trò gen laeA P chrysogenum Đây lần gen laeA đƣợc xóa bỏ khỏi hệ gen P chrysogenum sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đồng thời, chủng phục hồi gen laeA đƣợc tạo thành công, giúp phát số điểm vai trị gen laeA lồi nấm sợi mà chƣa đƣợc cơng bố trƣớc Hình 3.30 Xác nhận chủng xóa gen laeA PCR (A) Sơ đồ trao đổi chéo vị trí cặp mồi dùng để kiểm tra (B) Sự sinh trƣởng chủng nấm môi trƣờng PDA CD sau ngày (C) Kết PCR kiểm tra M: kb DNA marker, (-) Đối chứng âm sử dụng nƣớc cất vô trùng * Gen laeA ảnh hưởng tới khả sinh kháng sinh penicillin Việc phát ảnh hƣởng nguồn nitơ đến q trình khơi phục kiểu hình khả sinh kháng sinh penicillin kháng vi khuẩn S aureus chủng P chrysogenum xóa gen laeA chƣa đƣợc nhắc đến, kết góp phần bổ sung thêm hiểu biết vai trò điều hòa gen laeA P chrysogenum Hình 3.32 Sự sinh trƣởng sinh kháng sinh penicillin chủng P chrysogenum nguồn nitơ nitrat ammonium * Gen laeA ảnh hưởng tới khả hình thành bào tử nấm P chrysogenum Sau ngày ni cấy, nguồn nitơ nitrat, chủng xóa laeA hình thành bào tử, nhiên lƣợng bào tử hình thành 45,6% so với chủng tự nhiên Trên môi trƣờng với nguồn nitơ ammonium, lƣợng bào tử chủng xóa gen laeA tăng lên nhiều Cụ thể lƣợng bào tử hình thành 87,3% so với chủng tự nhiên (Hình 3.33B) Nhƣ vậy, nguồn nitơ ammonium thúc đẩy trình phục phồi khả hình thành bào tử cho chủng P chrysogenum xóa laeA Đây nghiên cứu vai trò nguồn nitơ ảnh hƣởng tới hoạt động kiểm soát gen laeA tới khả hình thành bào tử nấm P chrysogenum Hình 3.33 Sự hình thành bào tử chủng P chrysogenum nguồn nitơ nitrat ammonium * Gen laeA ảnh hưởng tới khả sinh enzyme α-amylase nấm P chrysogenum Với nguồn nitơ nitrat, khả sinh enzyme α-amylase chủng P chrysogenum xóa laeA giảm so với chủng tự nhiên chủng phục hồi Trong đó, mơi trƣờng sử dụng nguồn nitơ ammonium, khả sinh enzyme α-amylase chủng xóa laeA đƣợc phục hồi tƣơng đƣơng so với chủng tự nhiên chủng phục hồi Nhƣ vậy, nguồn nitơ ảnh hƣởng tới hoạt động gen laeA P chrysogenum điều hịa q trình sinh enzyme ngoại bào αamylase Hình 3.34 Khả sinh enzyme α-amylase chủng P chrysogenum nguồn nitơ nitrat ammonium 3.3.3 Nghiên cứu vai trò gen laeA P digitatum Hiện nay, có báo cáo vai trị số gen hệ gen nấm P digitatum nhƣ: PdMpkB, PdSNF1, PdSlt2,… Tuy nhiên, vai trò gen laeA chƣa đƣợc đề cập nấm P digitatum Trong nghiên cứu này, lần giới gen laeA nấm P digitatum đƣợc xóa thành cơng, việc điều tra đặc điểm chủng xóa gen laeA giúp làm sáng tỏ vai trò gen vi nấm P digitatum Đồng thời, nghiên cứu này, tiến tạo thành công chủng phục hồi chủng biểu mức gen laeA Các chủng phục hồi biểu mức gen laeA nấm P digitatum giúp cho việc điều tra vai trò gen laeA đƣợc đầy đủ xác Hình 3.39 Xác nhận xóa phục hồi gen laeA P digitatum (A) Sơ đồ xóa phục hồi; (B) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeAP5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-ORF-R NAT-F/NAT-R; (C) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeA-P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORFF/PdlaeA-ORF-R PgpdA-F/HPH-R * Gen laeA ảnh hưởng tới khả sử dụng nguồn cacbon nấm P digitatum Hình 3.40 Gen laeA ảnh hƣởng tới khả sử dụng nguồn cacbon nấm P digitatum (A) Sự sinh trƣởng chủng nấm nguồn cacbon sau ngày (B) Đƣờng kính sinh trƣởng chủng nấm nguồn cacbon sau ngày Kết thu đƣợc cho thấy, tất nguồn cacbon nghiên cứu, chủng P digitatum xóa gen laeA sinh trƣởng so với chủng tự nhiên chủng phục hồi Đặc biệt mơi trƣờng với nguồn cacbon pectin chủng xóa gen laeA sinh trƣởng rõ ràng Đây đặc điểm quan trọng liên quan tới khả gây hỏng chủng nấm P digitatum xóa gen laeA Bởi pectin thành phần quan trọng vỏ có múi * Gen laeA ảnh hưởng tới khả sinh axit hữu nấm P digitatum Hình 3.41 pH dịch ni cấy chủng nấm Kết nghiên cứu cho thấy, pH dịch ni cấy chủng xóa laeA cao (pH trung bình 5,15) pH chủng tự nhiên trung bình 4,02, chứng tỏ việc xóa gen laeA làm giảm khả sinh axit hữu nấm P digitatum Hơn nữa, chủng mức gen laeA, pH dịch ni đạt trung bình 3,61, điều đồng nghĩa với việc biểu mức gen laeA lƣợng axit hữu sinh nhiều làm giảm pH mơi trƣờng (Hình 3.41) Kết làm sáng tỏ phần vai trị kiểm sốt khả sinh axit hữu gen laeA nấm sợi nấm P digitatum Vai trò chƣa đƣợc công bố trƣớc nấm P digitatum Việc giảm khả axit hữu hóa mơi trƣờng liên quan trực tiếp tới độc lực gây hỏng có múi nấm P digitatum * Gen laeA quy định khả gây bệnh hình thành bào tử nấm P digitatum Hình 3.42 Gen laeA kiểm sốt khả gây hỏng cam hình thành bào tử nấm P digitatum (A) Các chủng nấm P digitatum môi trƣờng PDA PDA bổ sung 1,5M D-sorbitol; (B) Nồng độ bào tử chủng nấm P digitatum môi trƣờng PDA PDA bổ sung 1,5M D-sorbitol; (C) Sự gây bệnh chủng nấm Với tác nhân gây ảnh hƣởng lên thành tế bào nấm Dsorbitol, dẫn tới giảm hình thành bào tử chủng nấm P digitatum xóa gen laeA Đây điểm vai trò gen laeA nấm P digitatum chƣa đƣợc cơng bố trƣớc Khả gây hỏng có múi sau thu hoạch đặc tính quan trọng nấm P digitatum Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi tập trung nghiên cứu vai trị gen laeA liên quan tới kiểm soát độc lực gây bệnh nấm P digitatum Kết nghiên cứu cho thấy việc xóa gen laeA làm hồn toàn khả gây hỏng cam nấm P digitatum Hình 3.43 Khả gây hỏng cam chủng mức gen laeA so với chủng xóa chủng tự nhiên Để khẳng định xác việc gen laeA kiểm soát khả gây hỏng cam hay gen laeA gen độc gây hỏng cam nấm P digitatum, tiến hành lây nhiễm chủng biểu mức cam so sánh với chủng tự nhiên chủng xóa Chúng tơi nhận thấy chủng biểu mức gen laeA gây hỏng cam nhanh so với chủng tự nhiên (Hình 3.43) Nhƣ cho thấy gen laeA gen quan trọng kiểm soát khả gây hỏng cam nấm P digitatum Đây phát giới vai trò gen laeA việc gây hỏng KẾT LUẬN Đã tạo thành công vector nhị thể dùng cho cải biến di truyền ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum - Tạo thành công vector nhị thể mang cấu trúc biểu gen huỳnh quang (DsRed GFP) với marker chọn lọc gen trợ dƣỡng pyrG (pEX2A), gen kháng kháng sinh hygromycin (pPK2Red), gen kháng kháng sinh nourseothricin (pGreen3), gen kháng kháng sinh phleomycin (pPK2-Red2) - Tạo thành cơng vector xóa gen sinh tổng hợp uridine/uracil (gen pyrG) nấm sợi A niger (pKO2AnpyrG) P chrysogenum (pKO2ΔPcpyrG) - Tạo thành cơng vector nhị thể dùng cho xóa gen, phục hồi biểu mức gen laeA ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum Trong đó, vector dùng cho xóa gen laeA (gồm: pKO2ΔAnlaeA, pEΔAnlaeA, pKO2ΔPdlaeA, pKO2ΔPclaeA) vector dùng cho phục hồi biểu mức gen laeA (gồm: pG-AnlaeA, pGB-AnlaeA, pPK2-PclaeA, pEX2BPclaeA, pG-PdlaeA) Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao thông qua vi khuẩn A tumefaciens ba loài nấm sợi nghiên cứu - Đây cơng trình xây dựng thành công hệ thống chuyển gen hiệu cao sử dụng marker trợ dƣỡng pyrG nấm sợi công nghiệp A niger P chrysogenum với hiệu chuyển gen tƣơng ứng đạt 2212 ± 336 1750 ± 281 thể chuyển gen/106 bào tử - Đã xây dựng đƣợc hệ thống chuyển gen hiệu cao nấm sợi P chrysogenum nấm gây hỏng có múi P digitatum sử dụng marker gen kháng kháng sinh Hiệu chuyển gen tƣơng ứng đạt 1240 ± 165 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử Phát điểm vai trò gen laeA ba loài nấm sợi nghiên cứu - Đây cơng trình thực thành cơng việc xóa, phục hồi biểu mức gen laeA ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens - Phát vai trị gen laeA liên quan tới biệt hóa tế bào, trao đổi chất kiểm soát khả gây bệnh sau thu hoạch ba loài nấm sợi nghiên cứu KIẾN NGHỊ Đánh giá định lƣợng thay đổi axit hữu dịch ni cấy chủng đột biến xóa gen laeA so với chủng tự nhiên hai loài A niger P digitatum Đánh giá ảnh hƣởng gen laeA tới mức độ biểu số gen liên quan tới khả sinh axit hữu cơ, enzyme, …ở ba loài nấm sợi real-time PCR DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ Vũ Xuân Tạo, Trần Văn Tuấn (2017), “Xác định đặc điểm sinh học bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi Penicillium chrysogenum có nguồn gốc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 33 (2S), 140-145 Van Tuan Tran, Thi Binh Xuan Loc Do, Thi Khuyen Nguyen, Xuan Tao Vu, Bich Ngoc Dao, Hoai Ha Nguyen (2017), “A simple, efficient and universal method for the extraction of genomic DNA from bacteria, yeasts, molds and microalgae suitable for PCR-based applications”, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering 59 (4), 66-74 Tao Xuan Vu, Tho Tien Ngo, Linh Thi Dam Mai, Tri-Thuc Bui, Diep Hong Le, Ha Thi Viet Bui, Huy Quang Nguyen, Binh Xuan Ngo, VanTuan Tran (2018), “A highly efficient Agrobacterium tumefaciensmediated transformation system for the postharvest pathogen Penicillium digitatum using DsRed and GFP to visualize citrus host colonization”, Journal of Microbiological Methods 144, 134-144 Vũ Xuân Tạo, Đỗ Thị Bình Xuân Lộc, Nguyễn Thị Khuyến, Trần Văn Tuấn (2018), “Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen hiệu suất cao dùng cho cải biến di truyền nấm sợi Aspergillus Penicillium”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị nhà khoa học trẻ toàn quốc lĩnh vực khoa học tự nhiên công nghệ lần thứ IV * Bản thảo nộp hoàn thiện Tao Xuan Vu, Ha Hong Vu, Giang Thu Nguyen, Hanh-Dung Thai, Hien Thu Vu, Hien Thanh Pham, Linh Thi Dam Mai, Huyen Thi Thanh Tran, Duc-Ngoc Pham, Diep Hong Le, Huy Quang Nguyen, Van-Tuan Tran (2019) “A newly developed Agrobacterium-mediated transformation system for Penicillium chrysogenum revealed that LaeA controls fungal development and secondary metabolism in a nitrogen source-dependent manner” Scientific Reports, under review Loc Thi Binh Xuan Do#, Tao Xuan Vu#, Hanh-Dung Thai, Thu Ha Pham, Hang Thu Le, Phuong Thi Tran, Van-Tuan Tran (2019) “Development of a novel and highly efficient Agrobacterium-mediated platform for engineering of the industrial fungus Aspergillus niger” Scientific Reports (Manuscript will be submitted soon, #equally contributed) *Trình tự gen đăng ký GenBank Vu,T.X., Ngo,T.T., Poloubinski,M., Pham,N.D., Bui,T.T., Mai,L.T.,Tran,H.T., Le,D.H., Bui,H.T., Nguyen,H.Q., Ngo,B.X and Tran,V.-T,2017 Penicillium digitatum strain PdVN1 (GenBank: MF527231) ... laeA loài nấm sợi nghiên cứu Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 3.1.1 Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A niger sử dụng phƣơng... hỏng cam nấm P digitatum Đây phát giới vai trò gen laeA việc gây hỏng KẾT LUẬN Đã tạo thành công vector nhị thể dùng cho cải biến di truyền ba loài nấm sợi A niger, P chrysogenum P digitatum... vector nhị thể ứng dụng cải biến di truyền ba loài nấm sợi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Đề tài chứng minh hiệu hệ vector tạo đƣợc cách áp dụng trực tiếp