Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trang 1

BO Y TE

TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI

MONG MINH HUYEN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

MYRICETIN TRONG CHE DAY VA MOT SO CHE PHAM CO CHUA

CHE DAY BANG PHUONG PHAP

sD

SAC KY LONG HIEU NANG CAO ^== — — —

Trang 2

MUC LUC

Trang

LOI CAM ON

MUC LUC

DANH MUC CAC CHU VIET TAT DANH MUC CAC BANG

DANH MUC CAC HINH

OE ecmmeuscacecenenmewannmancmucamnmnmnanammnmnnamauens 1 HHEDHEI.- TÙNG ADT svecscssnsssssscs essai 3

1.1 Tổng quan về cây ché day, myricetin va m6t so san pham chira

ChE GAY sinicssiccsorssiacsemmnneneenn inn anaes Reem 3 LD) “TỗdWHdanVÊElt CH- ỔY:(.eeooaioaaontagdtudddaiataeasbesane 3 1.1.2 Tổng quan về myricetin -2©-s<-s+ese-secse Š

LS (lai HÀ pees 8 1.1.4 Chế phẩm Thiên Bảo giảo cổ lam . -2 25-52: 10 1.1.5 Một số phương pháp định lượng myrieetin 11 1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng eao ———= , — 13

12.1 Một số nét sơ lược về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao i3

1.2.2 May sac ky long hiéu nang CA0 .s.cccesccsesesessesessesessseeeeesseneeenes 14

1.2.3 Một số thông số đặc trưng cho quá trình rửa rải ló 1.2.4 Một số ứng dụng của sắc ký .eeee TẾ” CHUONG 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

1T, ĐốI RRðHIE HghÌE Hi naoadaicdqidediotiGtdilSkaskoiadvtleceoosydagiln 20

Trang 3

Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9 DANH MUC CAC HINH Trang

Cây chè dây tươi và Mẫu lá chè dây khô . - 3 Ampelop của công ty Traphaco_ 34000040 0105410608 8 Viên nang Thiền Bảo giáo cỗ lam c csoeeeee 11

Sơ đồ khói của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

Phé hap thụ tử ngoại của Myrticetltn eeeneoeooosee 26

Pie Tels NHI sacgea giang a0 0 ung 06002 tagg 27 Sắc ký đồ khảo sát pic myricetin ở 2 bước sóng 254nm va

370ïimi sÙ đựng phá CONS FS ciccccoccdiaacGetioaosasalledbstsdioe 28

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic va

tiện” để MVIIEEDH sscesikceeiatgdiioapssdsebsdsoititoneostgxstos 554 30 Phé hap thụ 2D của myricetin chuẩn .- cccccccccecc 36

Sắc ký đồ mẫu chuẩn myricetin .- -. -<-5- «c7 cc<cs<s< 37

Sắc ký đồ định lượng Mỹyricetin trong lá chè dây 37

Sắc ký đồ định lượng myricetin trong mẫu viên ampelop 37 Sắc ký đồ định lượng myricetin trong mẫu viên Thiên Bảo

Trang 4

DAT VAN DE

Năm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được thiên nhiên ưu ái

ban tặng một thảm thực vật phong phú và đa dạng trong đó có nhiều được liệu đã

được nhân dân ta sử dụng để phòng và chữa bệnh Cho tới nay, đã có nhiều sách tập hợp các công trình nghiên cứu vẻ được liệu cũng như những kinh nghiệm phòng và

chữa bệnh trong nhân dân như: '*Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi [14]: '“Từ điển cây thuốc” của Võ Văn Chỉ [3]: “Cây thuốc và động vật làm

thuốc ở Việt Nam” của tập thê tắc giả ở Viện dược liệu [lô]

Từ lâu chè dây đã được nhiều người biết đến như vị thuốc chữa viêm loét dạ

dày, hành tá tràng hiệu quả mà không mây tốn kém Chè dây được gọi là Thau rả (theo dân tộc Tày) hay Khau rả (theo dân tộc Nùng) Đây là loại dây leo có vị ngọt,

dang, tinh mat, duge déng bào dân tộc miền núi sử dụng như một vị thuốc dân gian chữa các bệnh liên quan tới dạ dày như ợ hơi, ợ chua đau rát thượng vị Ngoài ra

chè đây còn có tác dụng an thân, chữa mắt ngủ

Trong hai mươi năm trở lại đây chè dây đã nhận được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước Tiêu biểu là các nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ và các cộng sự Qua các nghiên cứu này, các nhà khoa học đã xác định

được thành phần có hoạt tính sinh học chính trong chè dây có tác dụng phòng và

chữa bệnh là nhóm flavonoid với hai chất chính là myricetin và dihydromyricetin

[6], [23], [10] Đồng thời, chè dây cũng trở thành nguồn nguyên liệu được đưa vào

sản xuất thuốc đông được với sự ra đời của viên nang Ampelop do Phạm Thanh Kỳ

và nhóm cộng sự nghiên cứu [12] sau đó được chuyển giao cho công ty cổ phần

Traphaco

Sự phát triển của nhóm thuốc đông dược nói chung và các chế phẩm có chứa

chè dây nói riêng trên thị trường Việt Nam đã đặt ra yêu cầu cấp thiết về đảm bảo - chất lượng thuốc Qua các công trình nghiên cứu trước đó chúng tôi nhận thấy mặc

Trang 5

lần [6] Bên cạnh đó các đề tài trước đây chưa sử dụng chất chuẩn chính thức Hiện

nay dé tài khoa học công nghệ cấp nhà nước mã số KC.10.16/06-10 đã thiết lập

được chất chuẩn myricetin Mặt khác các sản phẩm Thiên Bảo Giảo Cổ Lam, va

Ampelop có công bố hàm lượng cao chè dây nhưng không định lượng và công bố hàm lượng myricetin trong sản phẩm Vì vậy để đảm bảo chất lượng thuốc đông dược có chứa chè dây trên thị trường chúng tôi quyết định nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu định lượng myricetin trong lá chè dây và một số sản phẩm có chứa chè dây băng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:

Khảo sát lựa chọn điều kiện và đánh giá phương pháp định lượng myricetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Myricetin trong lá chè

Trang 6

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Tổng quan về cây chè dây, myrieetin và một số sản phẩm chứa chè dây

1.1.1 Tổng quan về cây chè dây

Tén khoa hoc: Ampelopsis cantoniensis ( Hook.et arn.) planch Ho nho Vitaceae

Cây chè dây ở dạng dây leo dai, xanh tốt, leo trên các bụi rậm hoặc trên các cây to

khác trong rừng Cây mọc hoang và cũng được người dân đem về trồng trong vườn

hoặc ở bờ rào Cây sống lâu năm, mùa đông lá vàng rụng dân, mùa xuân cây bắt đầu moe chi, lá xanh tốt nhất là vào mùa hè, cũng là mùa nhân dân địa phương thường

thu hoạch 1a, ra hoa thang 6, ra qua tháng 10 a) Đặc điểm hình thái|8| [21], [18]

Hình 1.1 Cây chè dây tươi và Mẫu lá chè dây khô

Cây thân leo sống lâu năm Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ Tua cuốn có 2- 3 nhánh đối diện với lá Hoa mọc thành cụm xim hai ngả, đối diện với lá Quả mọng, lúc non có màu xanh, khi chín có màu đó mận Quả thường có 2-3 hạt, hạt có vỏ cứng mặt ngoài màu nâu đen

Dược liệu là lá và ngọn phơi sây khô Lá có màu xanh thẫm, trên lá có những

chấm trắng dày đặc Thân cây và cành màu nâu đỏ

Trên thê giới, chè dây phân bô ở Lào, Trung Quốc, Indonexia, Án Độ,

Trang 7

Nghiên cứu của Phùng Gia Hợp cho thấy cao đặc chè dây có tác dụng điều trị vết bỏng nông: bỏng độ II và bỏng độ II khá tốt Vết bông tạo được màng thuốc,

lớp màng thuốc bám chắc vào bề mặt vết thương Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề mặt mềm và mịn Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ H là 9.2 ngày

bỏng độ HII là 1§.5 ngày [7]

Cơng dụng của cây chè dây|[3], [7], [21|

Chè dây có vị ngọt đắng, tính mát và có nhiêu công dụng:

Nhân dân vùng núi phía bắc dùng pha nước uống hàng ngày thay chè và để

tri dau da day

Nhân dân vùng Lạng Sơn dùng lá đắp vào chỗ bị viêm tấy có mủ ( áp xe vú)

Dùng lá tươi giã đắp vào các vết bỏng

Nhân dân ở Sapa dùng nước sắc hoặc nước hãm dạng chè uống hàng ngày với tác dụng thanh nhiệt, chữa mắt ngủ, kích thích tiêu hóa viêm đường ruột rất tốt

1.1.2 Tổng quan về Myricetin

a) Đặc điểm hóa lý

Myricetin 1a 1 flavonoid duge Perkin phan lap tit v6 cay Myrica nagi Thunb,

ho Dau rugu Myricaceae tir nam 1896, có công thức phân tir: C}sHj9Og

Trang 8

tetramethyl ether myricetin va 3°, 5- diacetyl myricctin), ding vinblastin lam 4éi

chứng Kết quả cho thấy 3°, 5- diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất

còn lai va myricetin không có tác dụng này [29]

Những nghiên cứu gần đây của một nhóm nhà khoa học Hàn Quốc chỉ ra

răng myricetin có hiệu lực bảo vệ mạnh theo cơ chế hoá học chống lại các căn bệnh

có liên quan đến yếu tô hoại tử khối u-œ (TNF- alpha) [28]

Theo Kumamoto T., Fujii M., Ho DX., myricetin co tac dung true tiép dén Janus kinase (JK1), ngan chan su bién ddi té bao & cdc té bao biéu mô của chuột

[30]

Nghiên cứu gần đây nhất của các nhà khoa học ở Mỹ Hàn Quốc và Trung

Quốc cho thấy myricetin co kha nang chong ung thu tiềm tang [27], [36]

Một số tác dụng khác

Myricetin có hoạt tính của vitamin PP[I] Hoạt tính này thể hiện ở tác dụng

làm bền vững mao mạch giảm tính giòn của thành mạch

- Theo kết quả nghiên cửu của nhóm Phạm Thanh Kỷ và cộng sự [H1] [21]

[22]:

Cao khô chè đây và myricetin có khả năng thải độc theo cơ chế trung hòa gốc tự do của tetraclorua carbon

Myricetin ức chế sự phát triển trên 11 chủng vi khuẩn, chủ yếu là các chủng staphyloeoceus aureus và một số vi khuẩn Bacillus

- Nghiên cứu sự vận chuyền tích cực ion Ca”” qua màng nguyên sinh chat

của tế bào gan chuột cho thấy myricetin ức chế sự vận chuyển ion Ca” ở nồng độ

I100LM Mức độ ức chế phụ thuộc vào nông độ [3ó]

- Theo Pablo Strobel và các cộng sự myricetin quercetin và catechin øallate

ức chế sự hấp thu ølucose vào trong tế bào tạo mỡ cô lập của chuột [33]

- Myricetin có tác dụng tăng tông hợp BMP- 2, tác dụng nảy có thể góp phần tạo nên hoạt tính gây chín và biệt hóa tế bào tạo xương, làm tăng khối lượng xương

Trang 9

- Cho đến nay, myricetin là flavonoid duy nhất đã được phát hiện có tác đụng

làm tăng thu giữ và giảm thải !od Tác dụng giảm phát tán và tăng thời gian lưu giữ

iod của myricetin có thể có ý nghĩa lâm sàng trong điều trị ung thư tuyến giáp bằng Iod phóng xạ [26] 1.1.3 Chế phẩm Ampelop của công ty cỗ phần dược phẩm Traphaco [4] Hinh 1.2 Ampelop của công ty Traphaco Thành phân: Cao chè dây (80% Flavonoid) 625mg Tá dược vđ l viên Tác dụng:

- Diệt trừ Helicobacter Pylori

- Chống viêm, giảm đau

- Giảm tiết acid

- Liền sẹo vết loét dạ dày - hành tá tràng

Chỉ định: Viêm loét dạ dày, hành tá tràng

Chống chỉ định: Mẫn cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc

Hiện nay trong tiêu chuẩn viên Ampelop chỉ định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang (tính theo quericetin) Phương pháp này có độ chính xác không cao và chỉ cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần, chưa xác định

Trang 10

Một số nghiên cứu về tác dụng điều trị loét đạ dày tá tràng của chế phẩm

Ampelop được sản xuất từ chè đây

Bảng 1.2 Kết quả nghiên cứu vê tác dụng điều trị loét dạ dày tá trằng của chế pham Ampelop Vũ Nam [15] Nguyên Thị Tuyết Lan[ 13]

Tae Dựng Cao che | Alusi Ampelop Metronidazol day Amoxiciclin ( AMA)

Cat con dau trung binh 8.9 ngay 17,35

ngày

Bệnh nhân hét dau sau 2 tuan | 90.09% 61.11% | 95%

diéu tri

Liên sẹo 6 loét hanh ta trang | 79,55% 50% 92.5%

Sach Helicobacter pylori 42.5% 19.35% | 70%

Tác dụng giảm viêm dạ dày có Không Giảm rõ rệt

Tác dụng không mong muốn | Không có Không có

Kết quả nghiên cứu đưới sự chỉ đạo của Nguyễn Khánh Trạch theo dõi điều trị cho

63 bệnh nhân loét dạ dày — tá tràng băng AMPELOP — AMOXICICLIN - FLAGYL che thay[17]:

- Về mặt lâm sàng: thuốc Ampelop có tác dụng tốt trong việc cải thiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh loét đạ dày tá tràng Sau cả đợt điều trị số bệnh

nhân hết các triệu chứng lâm sàng đạt 98,41% chỉ còn I bệnh nhân không hết đau

(1.58%)

-Tỷ lệ liền sẹo ở mức độ tốt và khá: 85,71%

- Tác dụng diệt HP: 53.97% Bệnh nhân không còn HP 14.28% còn số lượng

ít bệnh nhân 31.75% bệnh nhân có lượng HP không thay đổi

Trang 11

——-———+———

10

- Nghiên cứu tác dụng không mong muôn của thuốc: trong tất cả 63 bệnh nhân nghiên cứu không có trường hợp nao có biểu hiện tác dụng không mong muôn

của thuốc

1.1.4 Một số nét sơ lược về viên Thiên Bảo giảo cỗ lam [5]

Thiên Bảo - Giảo Cổ Lam là tập hợp thành quả nhiều năm nghiên cứu

của Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã được chuyển giao cho Công ty Dược phẩm Đông Á

Giảo Cô Lam còn gọi là cây thất diệp đởm cây trường sinh, từ xa xưa đã

được sử dụng cho vua chúa dé tang cuong suc khoe, kéo dai tudi tho Thanh phan hóa học chính của Giao Cé Lam 1a flavonoid va saponin, hrong saponin trong Giao

Cổ Lam nhiều gấp 3 —- 4 lần nhân sâm nên cây còn được gọi là Ngũ Diệp Sâm

Nhiều nghiên cứu của y dược học hiện đại đã chứng minh Giảo Cô Lam là một vị

thảo được quý có tác dụng hạ mỡ máu giảm cholesterol xấu góp phần ngăn ngừa xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ôn huyết áp phòng ngừa các biến

chứng tim mạch

Chè Dây được người dân sử dụng nhiều với tác dụng giúp tiêu hóa tốt, để

ngủ Chè Dây là một loại dược liệu giàu flavonoid và tannin, con gọi là polyphenol

Đây là nhóm chất có tác dung sinh hoc cao, chéng lão hóa mạnh

Việc kết hợp hai loại thảo được này sẽ mang lại nhiều lợi ích chữa bệnh hơn

khi dùng riêng lẻ Hiện nay, trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm mang tên Giảo Cô Lam, nhưng Thiên Bảo Giảo Cô Lam với sự hòa quyện giữa 2 dược liệu quý này sẽ tạo ra một sản phẩm thực sự chất lượng giúp làm hạ mỡ máu én định

đường huyết và huyết áp giúp nâng cao sức khỏe và kéo đài tuổi thọ rất hữu ích cho các bệnh nhân bị tăng mỡ máu và có nguy cơ cao với bệnh tin mạch

Trang 12

11

Hình 1.3 Vién nang Thién Bảo giảo cổ lam

Thành phần chính:

- Cao khô Giảo cỗ lam (có chứa các Saponin triterpen, Flavonoid, Aminoacid,

Vitamin và các nguyên tô vi lượng v v): 300 mg

- Polyphenol Chè dây (có chứa Myricetin, Dihydro - Myricetin): 150 mg Tá dược vừa đủ [ viên

Công dụng:

- Giúp hạ cholesterol máu, điều hòa rồi loạn lipid máu

- Bảo vệ thành mạch, giúp ôn định huyết áp

- Chẳng lão hóa, giúp ăn ngủ tốt

Chỉ định: Chống lão hóa, giảm mỡ máu ôn định huyết áp

Trong tiêu chuẩn của viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam mặc dù có công bố hàm lượng polyphenol Chè Dây nhưng thực tế không định lượng và công bố hàm lượng myricetin

1.1.5 Một số phương pháp định lượng myricetin đã được sử dụng

Định lượng ƒlavonoid toan phần bằng phương pháp cân [16]: Cân 2g bột lá chè

dây đã xác định độ âm Dược liệu được chuyên vao binh Soxhlet, thém ether dau

Trang 13

12

căn Chuyển căn vào bình cầu lắp sinh hàn thêm cthanol 70° chiết đến hết flavonoid (10 phút) Cất thu hồi ethanol trong địch chiết thu được khoảng 30ml dịch chiết nước Để nguội thêm gelatin 3% đến không còn tủa trắng Lọc lấy dịch lắc

với ethyl acetate trong binh gan toi hét flavonoid Gộp dịch lọc bốc hơi đến căn

Sấy căn ở 100°C đến khối lượng không đổi thu được flavonoid khan

Luong flavonoid toàn phan được xác định theo công thức: y9 b°=———————x A(100 x X%) a a 100 Y%: ham lugng flavonoid trong 100g la

A_ : khối lượng bột lá chè dây (g)

a _ : khối lượng căn thu được (g) X% :độ âm của bột lá chè dây

Định lượng mịyricefin bằng sắc ky long hiéu nang cao HPLC

Bang 1.3 Cac chiang trinhh sac kj dinh lwong Myricetin bang HPLC Phing Thi Vinh [23] | Trân Hương Giang[6] | Vũ Hương Thủy [16] Cột Lichrosorb RP-18 RP- 18 RP - 18 250 x 4,6mm: 5um 100 x 2.1mm: 5um 150 x 4.6 mm: 5um Bước sóng | 376 nm 260 nm 260 nm Pha động Acetonitril Acetonitril H;PO, | Acetonitril H3PO, CH;COOH 2% (3:17) | 0,01M (30:70) 0,01M (30:70) Tôe độ đồng | 1.2 ml/phút 0.2 ml/phút Ì ml/phút tạ (phút) 3.21 phút &,7—9.1 phút

Đề tải cấp nhà nước KC.10.16/06- 10 [20] xây dựng điều kiện sắc ký định lượng

myricetin như sau:

Cot RP — 18 (150 x 4.6mm ; Sum)

Pha dong KH>PQ, 0,025 M, pH = 3 : Acetonitril ( 70 : 30)

Trang 14

Thời gian lưu 4.5 phút

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao [2]

1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký va sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký được phát minh vào năm 1906 khi nhà thực vật học

người Nga Mikhail tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật (Chlorophyl và

Xanthophyl) trong ether dầu hỏa lên một cột nhồi bởi bột mịn calci carbonat, ông

nhận thấy các sắc tô bị hấp phụ trên đầu cột Khi cho dung môi nguyên chất (ether dầu hỏa) lên cột, các sắc tố đi chuyền trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng tách thành những vùng hay những vòng màu chồng xếp lên nhau hình thành sắc ký đồ

Trong may thap ky tiép theo nghién ctru về lý thuyết và ứng dụng của sắc ký

đã phát triển rất mạnh mẽ Hiện nay các kỹ thuật sắc ký luôn có vai trò quan trọng trong nghiên cứu lý thuyết cũng như ứng dụng của khoa học và công nghệ

Cuối những năm 1960 và trong thập kỷ 70 sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và phát triển tạo thêm một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký

Nguyên lý tách của sắc ký: Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động

Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua

pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được có định trong một

cột hay trên bẻ mặt chất rắn Các chất tan là thành phân của mẫu sẽ đi chuyển qua

cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh pha động và chất tan Nhờ tôe độ đi chuyển khác nhau, các thành phần eủa mẫu sẽ tách riêng biệt thành dai, lam co so cho phân tích định tính và định lượng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích

thước 4 — 10 um Pha động được đây qua cột bằng một bơm có áp suất cao với tốc

Trang 15

Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi được chứa trong các bình

khác nhau Tỷ lệ các thành phân thay đôi trong quá trình sắc ký theo chương trình

đã định

b) Hệ thống bơm

Hệ bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đây pha động từ bình dung môi qua

hệ thống sắc ký

Bom HPLC can dap ứng các yêu cầu:

Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

Dam bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0.01-Š.0 mL/phút

Không bị ăn mòn bởi dung môi

c) Hệ tiêm mẫu

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thăng vào pha động cao áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa

mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0.05 - 20uL

đ) Cột và pha tink

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo băng thép không gi, thông thường có chiều dài 10 — 30 cm đường kính trong từ 4-10 mm hạt chất nạp co 5—10 um

Pha tĩnh thường là silica gel hoặc silica gel có bao một lớp mỏng hữu cơ

hoặc liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động

và trong mẫu phân tích làm giảm tuẻi thọ của cột sắc ký

Cột có thể được làm nóng đê đạt hiệu quả phân tách tốt hơn (nhưng hiếm khi

tiến hành ở nhiệt độ trên 60°C vì có thể làm suy giảm hiệu lực cột hoặc làm pha

động bay hơi)

e) Detector

Trang 16

16

- Độ nhạy cao có thê phát hiện chất cần phân tích ở khối lượng hoặc nông

độ thấp

- Vận hành ôn định sử dụng dễ dàng

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng đetector hấp thụ UV: điode array detector — DAD Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh đetector đo ở bước sóng có

định hoặc thay đổi Quang phổ và sắc ký đồ có thể được hiền thị trên màn hình nhờ phan mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Mặt khác hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ bước sóng và thời gian

1.2.3 Một số thông số đặc trưng cho quá trình rửa rải - Hệ số phân bố K Ẹ K=— C M

Ø „ là nòng độ mol của chat tan trong pha tĩnh

c, là nồng độ mol của chất tan trong pha động

Trị số K càng lớn sự đi chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất

trong hôn hợp có hằng số K khác nhau nhiều thì khả năng tách dién ra dé dang hon

- Thời gian lưu tạ là thời gian cần thiết để một chất di chuyên từ nơi tiêm mẫu qua

cột sắc ký tới đầu dò và cho pic trên sắc ký đồ

tụ: thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ

tạ: càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng

nhỏ

Thời gian lưu tương đối t`ạ được tính theo công thức

Up= tr - tu

- Hệ số dung lượng k° là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô tả tốc

Trang 17

17

Qs Qy 1a lugng chat tan phan bé trong pha tinh va pha dong Vs Vy 1a thé tich pha tĩnh và pha động

— ee

k* không những phụ thuộc vào bản chất các pha bản chất chất tan, nhiệt độ mà còn

phụ thuộc vào đặc điểm cột

- Hệ số chọn lọc ơ: đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

HN: A R.A

Theo quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy œ luôn lớn hơn 1

Đê tách riêng hai chất cần có ơ > 1 thường dùng ơ trong khoảng 1.05 dén 2.0 a càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau Nếu ơ quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo

đài

- Hiệu lực cột

Pic trên sắc ký đồ có dạng tương tự như đường cong phân bố chuẩn Gaussian

thu được khi ta vẽ đường cong phụ thuộc giữa kết quả các thí nghiệm lặp lại và tần

số xuất hiện của các kết quả đó

Dạng pic sắc ký lý tưởng là dạng đối xứng như phân bố Gaussian Nhưng

trong thực tẾ pIc thường bị giãn ra và gần như đối xứng.Sự giãn pic là kết quả di chuyên nhanh chậm khác nhau của các phân tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký Các pIc ra muộn bao giờ cũng tù hơn Cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ

cho các pic nhọn (ít bị giãn)

Trang 18

18

W 1/2 1a chiéu rong ctia pic đo ở nửa chiêu cao cua pic

Nhu vậy, khi cột co higu lye cao (H nho N Ion) thi W nho (d6 gian pic nho) a eee

N gan bang Nmax:

N_ = 4000 5 d

Iaax

"

D, la đường kính hạt pha tinh (um)

- Độ phân giải: là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký

2|(t;), -(t,),]

g = “Hale : W,+W, hay | `“ 7 4 e@ JI+E,)

Rs =0.75 : Hai pic không tách tốt còn xen phủ nhau nhiều Rs = 1,0 : Hai pic tach khá tốt còn xen phủ nhau 4% Re= 1,5 : Hai pic tach hoan toàn, chỉ xen phủ nhau 0.3%

Như vậy đề tăng độ phân giải R, ta có thể:

Tăng N băng cách dùng cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của pic eññg tăng th) hóặe éđg loại pha tink cé kich thước hạt nhỏ hơn, cũng có thể giảm tốc độ dòng pha động

Tang k’, bang cach thay đổi thành phần pha động Giá trị k`p nên giao động

trong khoảng 1-5

Tăng ơ bằng cách thay đổi cột tức là thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động kể cả thay đổi pH Cũng có thể tăng nhiệt độ cột

1.2.4 Một số ứng dụng của sắc ký

- Định tính và thử độ tinh khiết

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng với điều kiện sắc ký

(pha động pha tĩnh ) là những thông tin định tính giúp ta khăng định sự có mặt của chất cần phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phân việc định tính bằng quang

phô thường gặp khó khăn Cho nên sắc ký thường được dùng để tách các thành phân trước khi phân tích bằng quang phổ Tuy nhiên định tính bằng sắc ký không

Trang 19

19

định đúng két quả âm tính- tức là xác định một chất không có mặt trong hễn hợp Vì

vậy sắc ký thường được dùng đề kiểm tra tạp chất trong mẫu phân tích Trên sắc ký

đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu khi chạy sắc ký

trong cùng điều kiện) - Định lượng

Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi đề định lượng một chất trong hỗn hợp vì

chất đó được tách khỏi các chất khác và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo

chiều cao hay diện tích pic Với pic hẹp phương pháp đo chiều cao cho kết quả tốt hơn phương pháp đo diện tích Khi pic tù hay lệch phương phương pháp đo diện tích cho kết quả tốt hơn

Có nhiều phương pháp đề định lượng một chất trong mẫu phân tích:

- Phương pháp chuẩn ngoại một điểm - Phương pháp dùng đường chuân

- Phương pháp nội chuẩn - Phương pháp thêm chuẩn

Trang 20

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng nghiên cứu

- Lá chè dây thu hái ở Sapa khoảng tháng § — 9 năm 2009 Lá được phơi khô và xay thành bột Hàm lượng nước trong bột lá chè dây được xác định băng phương

pháp Xác định mát khối lượng đo làm khô (DĐVN TỊI, Phụ lục 5.16)

- Mẫu viên Ampelop của công ty cô phần dược phâm Traphaco

Số lô: 03

Ngày sản xuất: trước 15 tháng 05 năm 2009

-Mẫu viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam do công ty cô phần Dược Liệu TW

Mediplantex sản xuất, công ty dược phẩm Đông Á phân phối

Số lô: 251209

Ngày sản xuất: Trước ngày 06 tháng 9 năm 2009

2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Hóa chất ~ thuốc thử

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong DĐVN III hoặc đạt tiêu chuẩn tỉnh khiết sắc ký bao gồm:

- Chất chuẩn Mgricetin đối chiếu hóa học (chất chuẩn làm việc của Viện Kiểm

Nghiệm thuốc T.U')

Số lô: KC.10.16 - 04.07

Hàm lượng chuẩn: 99,69%

- Dung môi tinh khiết HPLC: Methanol Acetonitril, nước cắt

- Hoa chat: Kali dihydrophotphat, acid Phosphoric

- Thuốc thử: Các thuốc thử được pha theo tiêu chuân DĐVN II 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200 Cột sắc ký: Purospher” Star RP-18 ( 250 x 4.6 mm : Š um) Máy lắc siêu âm: Elmasonia

Trang 21

Thiết bị lọc hút chân không

Bình nón; bình định mức: pipet và các dụng cụ khác:

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chuẩn bi mau[3]

- Ap dụng phương pháp ngâm lạnh hoặc ngâm nóng với methanol để chiết

myricetin trong lá chè đây và các chế phẩm có chứa chè dây

- _ Áp dụng phương pháp chiết rắn lỏng đựa vào tính tan của myricetin để tách riêng myricetin ra khỏi hỗn hợp chất rắn

Phương pháp định lượng bằng HPLC

Tối ưu hóa chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng myricetin

trên cơ sở các nghiên cứu định tính và định lượng flavonoid trong chè dây trước đây Myricetin dễ tan trong methanol, dựa theo câu trúc hóa học và đặc tính của myricetin, chúng tôi dự kiến sử dụng chương trình sắc ký pha đảo với cột RP 18 ít phân cực Để xây dựng phương pháp HPLC định lượng myricetin, chúng tôi dự kiến tiến hành khảo sát các bước sau:

- Khao sat pha dong

- Khảo sát bước sóng phát hiện để chọn chương trình sắc ký thích hợp cho

phép tách được các tạp chất khác ra khỏi myricetin

Chúng tôi dự kiến áp dụng điều kiện sắc ký như sau:

- Cot RP 18: 250 x 4.6 mm: 5um

- Toe d6 dong: | ml/phiit

- Detector: Diod array quét phé tir 190 dén 400nm dé chon bước sóng cho độ

hap thụ cực đại

- Thétich tiém: 20 ul

- Pha mau: Pha trong methanol

- Pha dong:

+ Pha dong 1: Dung dich acid Phosphoric 0,01M — acetomitril (7:3)

+ Pha động 2: Dung dịch KH;PO¿ 0.025M pH 3.0 — Acetonitril (7:3)

Trang 22

N to

Thắm định phương pháp Các tiêu chuẩn cân xác định:

- Xác định độ ôn định của hệ thống sắc ký ; - Khoảng tuyến tính (yêu cầu r > 0.999):

Độ lặp lại (yêu cầu RSD < 2.0%) :

Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

Xác định giới hạn định lượng (LOQ)

Độ đúng (yêu cầu > 97.0%) 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Tiên hành chạy SK với các điêu kiện như trên, ghi lại sắc ký đơ

- §o sánh thời gian lưu của pic chính trên phố đô của mẫu chuẩn va mẫu thử

- Tính toán kết quả theo công thức:

Xi A Sk m,.100 St «100

Trong dé:

X : Hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử (%)

S,, Sc : Lần lượt là diện tích pic của chất cần xác định tương ứng trên SKĐ

Mi ® VÀ ` 7 - a

cua mau thu va cua mau chuan

k, k, : Lan lượt là hệ sô pha loãng của mâu thử và của mâu chuân m, m, : Lân lượt là khôi lượng của mâu thử và của mâu chuân (g)

C; : Hàm lượng của mẫu chuẩn (%4):

Trang 23

23 D6 léch chuan: IS(x,-_xÏ ies \ ay } n—1 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = Š`x100 x

Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nông độ chất phân tích:

Y=ax+b

+ Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel

Trang 24

CHUONG 3 THUC NGHIEM VA KET QUA 3.1 Chuan bi mẫu phân tích

3.1.1 Mau chuan

Chuan bi day dung dich chuan myricetin :

Pha dung dịch gốc (DD 6): cân chính xác khoảng 25mg Myricetin vào bình định mức 100 ml, thêm MEOH 70% vừa đủ Lắc cho myricetin tan hoàn toàn, ta

được dung dịch sốc Sử dụng dung dịch sốc đề pha loãng thành các dung dich

chuẩn có nông độ thấp hơn Sử dụng MEOH 70% đề pha loãng Cách pha như trong bang 3.1 Bang 3.1 Pha dãy đung dịch chuẩn myricetin Dung dịch số 1 2 3 4 5 6 Nông độ (ug/ ml) 5 2a 25 50 100 250 Binh dinh mire (ml) 50 20 20 25 25 100 Luong DD gốc (ml) ] l 2 5 10 3.1.2 Mẫu lá chè dây

Cân chính xác khoảng 1g bột lá chè dây đã được xác định độ ẩm vào bình

nón I00ml có nút mài Thêm chính xác 100ml MEOH 70%, Đậy nút Cân chính xác

khối lượng của bình nón Đun hài lưu đưới sinh hàn (rong 3ô phúi, myriceiin được

hòa tan vào dung môi cùng với một số tạp chất khác

Để nguội cân và bổ sung MEOH 70% về lượng cân ban đầu lọc qua giấy lọc thu

được dịch chiết myricetin trong lá chè dây Lọc địch chiết qua mang loc 0,45um được dung dịch thu

3.1.3 Mẫu viên Ampelop

Xác định khối lượng trung bình của thuốc chứa trong viên nang,

Trang 25

|-) tn”

trong mỗi viên nang là hiệu giữa khối lượng nang thuốc và vỏ nang Làm như vậy

với 20 viên bất kỳ Tính khôi lượng thuốc trung bình trong nang thuốc

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0.1g bột viên đã nghiền mịn cho vào bình định mức 50ml Thêm 30ml MEOH 70%, lắc siêu âm trong 15 phút Thêm MEOH 70% vừa đủ 50ml Lọc qua giấy lọc thường ta được dịch chiết A Hút chính xác 5ml dịch chiết 1 vào bình định mức 25ml Thêm MEOH 70% vừa đủ Lọc qua màng lọc

0.45um ta được dung dịch thử

3.1.4 Mẫu viên Thiên Bảo giảo cổ lam

Xác định khối lượng trung bình của thuốc trong viên nang thiên bảo giảo cổ lam tương tự như viên Ampelop

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0.Ig bột viền đã nghiền mịn vào bình định mức 25ml Thêm 15ml MEOH 70% lắc siều âm trong 15 phút Thêm

MEOH 70% vừa đủ 25ml Lọc qua giấy lọc thường ta được dịch chiết B Hút chính xác 5ml dịch chiết B vào binh định mức 20ml Thêm MEOH 70% vừa đủ Lọc qua

mang loc 0,45 ul ta được dung dịch thử

3.2 Tối ưu hóa phương pháp HPLC định lượng myricetin

3.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định lượng myricetin trong lá chè dây

và một số chế phẩm chứa chè dây a) Khảo sát pha động

So sánh 2 pha động được sử dụng trong các nghiên cứu trước :

Pha động 2: Acetonitril : KH;PO¿ 0.025M(530:70): pH = 3 [23]

Tiêm dung dịch chuẩn nồng độ 0.05mg/ml tiến hành chạy sắc ký lần lượt

Trang 26

Bang 3.2 Kết quả khảo sát lựa chọn pha động Diện tích Chiêu | Tisô Thời gian : pic cao pic bat Nhan xét lưu (phút) b

(mAU.s) (mAU) đôi

Pic kéo đuôi, diện tích Pha dong 1 5,76 176.36 56,87 2.33 5 bé, không ôn định Pic cân đôi, diện tích Pha động 2 7.09 2499 54 115.76 1.43 + ' lớn ôn định

Kết luận: Qua bảng 3.2 chúng tôi nhận thấy pha động 2 cho pic cân đối, diện tích

lớn và ồn định hơn pha động l1 Vì vậy chúng tôi lựa chọn pha động 2 để tiếp tục

khảo sát chọn bước sóng b) Khảo sát chọn bước sóng

Để khảo sát chọn bước sóng thích hợp phát hiện myricetin chúng tôi tiến hành quét phổ tử ngoại của dung dịch myricetin với nồng độ 0.0025 mg/ml dung môi pha mẫu trong dải sóng từ 190 đến 400 nm, cốc đo đày 1 cm, mẫu trăng là dung

môi pha mẫu

Kết quả ghi ở hình 1 cho thấy myricetin cho phổ hấp thụ tử ngoại có cực đại

hấp thụ ở bước sóng 209 nm, 254 nm và 376 nm

Mât5aa fiì& : <Untitieds

Trang 27

27

Để khẳng định thêm, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thử trên máy HPLC

Agilent 1200 kết nỗi với Detector Diod array có phần mềm xử lý phố để chon

bước sóng tôi ưu cho việc phát hiện myrieetin Qua khảo sát chúng tôi nhận thây ở

bước sóng 376 nm, pic myricetin được phát hiện rõ, độ phân giải của pie cao, pIc nhọn vả đôi xứng, đường nên thăng không bị nhiễu

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát chọn bước sóng phải hiện Bước sóng (nm) | Diện tích pic Chiêu cao pic Nhận xét (mAU.s) (mAU) 254 2158.96 99.54 Pic chính điện tích nhỏ không ồn định

376 2497.86 115,13 Dién tich pic chinh 6n định, pic nhọn, cân đối

Trang 28

28 DAD & Sige G76, 4 Rett TANIMYRICS TINDOOODS.D) 4 2 4 i † i ụ 1" s _—* 47a

Hình 3.3 Sắc ký đô khảo sát pic mmyricetin ở 2 bước sóng 254nm và 375nm Chúng tôi quyết định lựa chọn bước sóng 375nm để định lượng myricetin c) Kết luận

Với kết quả thu được chúng tôi đề xuất sử dụng điêu kiện sắc ký để định lượng

Trang 29

ze

3.2.2 Tham định phương pháp phân tích

a) Khảo sát độ ôn định của hệ thống sắc ký

Pha một dung dịch chuẩn có chứa khoảng 0.05 mg myricetin Tiêm nhắc lại

5 lần dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ ồn định của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic( mAU.s) 7,48 2496,68 2 7,42 2487,76 3 7,42 2547,46 4 7.41 2479,58 5 7,42 2498,78 Số liệu thông kê E- =J43 s=2502,27 n=5 S=0,0285 S= 26,51 RSD=0,38% el here

Nhận xét: Kết quả được trình bày ở bảng cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của thời

gian lưu và diện tích pic của myricetin đều <2% Như vậy hệ thống sắc ký và điều

kiện sắc ký đã lựa chọn là phù hợp đảm bảo sự ổn định cho việc phân tích định

lượng myricetin

b) Xác định khoảng tuyến tính

Pha một dãy dung dịch chuẩn myricetin có nồng độ từ 5utg/ml đến 250g/mI

Tiến hành sắc ký theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn Kết quả khảo sát khoảng

Trang 30

30 Bảng 3.5 Kết quả khảo sét khoảng tuyến tính Dung dịch số 1 2 3 4 5 6 Néng dé (ug/ml) 5 12.5 25 50 100 250 Diện tích pic 178.95 | 556.51 | 1098.08 | 2498.20 | 5124,22 | 12963,33 (mAU.s)

Ket qua Phuong trinh hoi quy: Y= 52,35x - 124,26

Hệ số tương quan tuyến tính: r = 0,99995 Diện tích pic (mAU.s) —œ— Biên tích pic (mÂU.s) Diên tich pic (mAU) Hình 3.4 Đô thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nông độ Myricetin

Nhận xé:: Từ kết quả thu được cho thấy, trong một khoảng nồng độ khảo sát khá rộng (từ 5 đến 250 Iug/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ Myricetin thể hiện qua hệ số tương quan r = 0,99995

Trang 31

31

©) Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

Pha dung dịch chuẩn myricetin có nòng độ khoảng 10 uig/ml, sau đó giảm dan

nồng độ bang cách pha loãng gấp đôi và phân tích theo các điêu kiện sắc ký đã lựa

chọn Giới hạn phát hiện (LOD) tìm được là 0.5 ug/ml (bang 3.6) va gidi han định lượng (LOQ) là 1,65 pg/ml Bảng 3.6 Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) Nong dé (ug/ml) 25 1.0 0.5 0.25 Dién tich pic (mAU.s) | 78,99 | 31,01 14.15 | Khong dap ung d) Xác định độ lặp của phương pháp

Độ lặp của phương pháp được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối của 5 mẫu thử được phân tích riêng biệt

Bảng 3.7 Kết quả khảo sải độ lặp lại của phương pháp với mẫu lá chè dây

'STT| Luong | Théigian | Diệntíchpic| Hàmlượng | Tính thống kê

Trang 32

t2) hb Bảng3 8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương phápvới mẫu viêm Ampelop

STT| Lượng | Thời gian | Diện tích pic | Hàm lượng Tính thông kê

cân (g) | lưu(phút) (mAU.s) myricetin (mg/vién) ] 0,1001 7.40 3605.17 119.5 2 0.1003 7Al 3576,10 118.3 C = 118.0 mg/ viên 3 0.1016 1.42 3570,39 116,6 n=> 4 0.1017 7,43 3619.88 118.1 RSD = 0,92% 5 0.1021 7.41 3612,58 117.4 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại eđủa phương pháp đổi với mẫu viên

Thiên Bảo Giảa Cô Lam

STT| Lượng | Thời gian | Diệntíchpic | Hàm lượng Tính thông kê

cân (ø) | lưu(phút) (mAU.s) myricetin (mg/viên) ] 0.1004 7.43 3395.600 ) 2 | 0.1005 7.41 3485.15 36.4 C=36.5 mg/viên 3 0.1014 7.42 3526,03 36,5 "=5 4 0.1016 741 3552.34 36,7 RSD = 1,96% 5| 01023 142 3654.7/8 310

Kết luận: Qua kết quả nghiên cứu khảo sát độ lặp lại của phương pháp được thể

hiện ở bảng trên cho thấy phương pháp sử dụng có độ lệch chuẩn tương đôi <2%

đôi với cả ba mâu: mâu lá chè dây, mâu viên Ampelop và với mâu viên Thiên Bảo

Giảo Cổ Lam Như vậy độ lặp lại của phương pháp có thẻ chấp nhận được đề định lượng myrcetIn tro ng ca ba mau ^= ~#> Ve

lam (yêu cầu RSD<2%)

Trang 33

33

e) Xác định độ đúng

Sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định độ đúng: Thêm một lượng

chính xác chất chuẩn Myricetin vào trong mẫu thử Tiến hành định lượng dung dịch

này băng phương pháp đã chọn

Sử dụng dung dịch chuẩn số 4 (0.05 mg/mJ): Hút chính xác 2ml dung dịch

chuẩn vào bình định mức 5ml Thêm dung dịch thử vừa đủ Lắc đều Định lượng

dung địch này theo điều kiện sắc ký đã nêu ở trên

Kết quả khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm :

Trang 34

34

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng của piưương pháp đối với mẫu viên Thiên Bảo

Giáo Cô Lam BìnhÐM_ 5mi số 1 2 3 Thêm vào (mg) 0,1 0,1 0,1 Lượng thu hôi (mg) 0.0978 0.0986 0.0997 % Thu hôi 97,3% 97,9% 99,4% Trung bình X=98,2% n=3 RSD = 1,02%

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có độ đúng cao với khả

năng thu hồi là 98,7% đối với mẫu lá chè dây, 98.4% đối với mẫu viên nang

Ampelop va 98.20% với mẫu viên thiên bảo giảo cỗ lam —› năm trong giới hạn cho

phép trong thâm định độ đúng của phương pháp >97%

g) Bàn luận

Hiện nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp khá

pho bién, duoc ứng dụng nhiều để định tính và định lượng các chat Phuong phap

này phân tích các chất dựa vào thời gian lưu và pic của chất nghiên cứu trên sắc ký đồ so với mẫu chuẩn

Sau khi tiến hành thâm định phương pháp phân tích định lượng myricetin,

chúng tôi thu được kết quả như sau: Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với detector

UV ở bước sóng 37ố nm, chương trình sắc ký đăng dòng,có sự tương quan tuyến

tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic với r = 0,99995; có độ chính xác cao với

độ đúng > 97%và độ lặp lại < 2% Chúng tôi đề xuất có thể sử dụng phương pháp

phân tích HPLC đã được thâm định nêu trên để tiễn hành phân tích myricetin trong

Trang 35

3.3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng định lượng myricetin trong lá chè dây, trong viên nang Ampelop va viên thiên bảo giảo cỗ lam

Bang 3.13 Kết quả định lượng myricetin trong mẫu lá chè dây Hàm lượng

Trang 36

Bảng 3.15 Kêt quả định lượng mụrieetin trong mâu viên Thiên Bảo Giảo Cô Lam ; Hàm lượng

Trang 37

| DAD tM, Sige375.4 Ratrolt (TANI YRICETINOOOONS Cy RAU | „m- 4 we ` "` “- m- | Fein 2 4 ; 6 8 t0 Hình 3.6 Sắc ký đô mẫu chuẩn myrieetin mT igre CTR PICT ROOD} / MAY n te m0 3 90- " 00: “- r pei pt a pg T—— Ta ng

Trang 38

38 DAD( A Sige376,4 Refeot (TAMMYRIC ETINOOUODT 0) ips mAU 5 160- Ẫ wo 100 - © te “a a 02 `— ý Y 40 0 ¿ 4 8 8 0 si

Hình 3.9 Sắc ký đô định lượng myrieetin trong mẫu viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam

Nhận xét: Tại thời gian lưu của myrieetin chuẩn trên các mẫu thử đều xuất hiện pic Qua việc so sánh phổ 2D của các pic trên mẫu thử với phố 2D của myricetin chuân, chúng tôi kết luận pic xuất hiện tại thời gian 7.4 phút trên SKĐ các mẫu thử

là pic của myricetin Trên sắc ký đồ của các mẫu thử chúng tôi nhận thây pic

myricetin tách hoàn toàn với các thành phân khác mẫu thử Áp dụng phương pháp

này định lượng myricetin trong mẫu thử cho kết quả hàm lượng myricetin trong

mẫu lá chè dây là 0.3% mẫu viên Ampelop là 117,6 mg/viên, mẫu viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam là 36,8 mg/viên, với độ lệch chuẩn tương đối nằm trong giới hạn cho

phép Như vậy phương pháp này có thê áp dụng rộng rãi để định lượng myricetin

Trang 39

=

KET LUAN VA DE XUAT

Qua quá trình nghiêm cứu chúng tôi đã đạt được một số kết quả sau:

1 Tối ưu hóa chương trình sắc ký định lượng myrieetin bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao Đây là phương pháp định lượng cho độ chính xác cao giới hạn phân tích rộng, thời gian phân tích nhanh chóng Phương pháp nảy ngày càng được sử

dụng phô biến để định tính và định lượng các chất Sau quá trình nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi đã lựa chọn điều kiện sắc ký như sau - Cét RP 18: 250 x 4,6 mm; 5um Bước sóng phát hiện: 376 nm Pha động: Dung dịch KH›;PO¿ 0.025M pH 3.0- Acetonitril (7:3) - _ Tốc độ đòng: 1 ml/phút - _ Thời gian phân tích: 10 phút - _ Thể tích tiêm: 20 LH

- Pha mau: Pha trong methanol 70%

2 Qua khảo sát thực nghiệm cho thấy phương pháp nghiên cứu độ ôn định

cao, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu là 0,38% và diện tích pic là 1.06 %,

có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ trong một khoảng

nồng độ khảo sát khá rộng (từ 5 đến 250 jig/ml) vai hệ số tương quan r=0.99995,

Hệ thong sắc ký đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại và độ đúng với cả ba mẫu (Bảng 3.16) Giới hạn phát hiện (LOD) tìm được 0.5 ug/ml và giới hạn định lượng (LOG) 1a 1.65 ug/ml

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ đúng của ba mẫu

Viên Thiên Bảo

Lá chè dây Viên Ampelop 3

Giáo Cô Lam Độ lặp lại (RSD <2%) 0.95 0.92 1.96 Độ đúng (>97.0%) 98.7 98.4 98.2

3 Áp dụng chương trình sắc ký trên đề định lượng myricetin trong chè

đây và một số chế phẩm có chứa chè dây Kết quả cho thấy chương trình sắc ký đã

Trang 40

nghiên cứu phù hợp để định lượng myricetin trong ba mẫu này Qua đề tài này

chúng tôi nhận thấy rằng các thành phản khác trong chè dây và chế phâm thuốc

không ảnh hưởng đến kết quả định lượng của myricetin Do đó có thể áp dụng rộng

rãi chương trình sắc ký trên để định lượng myricetin trong chè dây và hai chế phâm

Ampelop và Thiên Bảo giảo cô lam

Bảng 3.17 Kết quả định lượng myricetin

Viên Thiên Bảo

Lá chè dây Viên Ampelop : :

Giảo Cô Lam Hàm lượng 0.3008% 117.6 mg/vien 36.8 mg/Viên RSD 0,06% 0.36% 1.05%

Do điều kiện thời gian không cho phép và trong phạm vi đẻ tài tốt nghiệp chúng tôi mới chỉ tiến hành định lượng myricetin trong viên nang Ampelop của công ty cỗ phân dược phẩm Traphaco và viên nang Thiên Bảo giảo cô lam của công ty dược phẩm Đông A

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi xin đề nghị: - Tiếp tục nghiên cứu định lương myricetin trong lá chè dây ở các thời điểm

khác nhau để lựa chọn thời điểm thu hái lá chè dây nhằm đưa nguồn nguyên liệu

với chất lượng cao, hàm lượng đảm bảo vào sản xuất, đảm bảo chất lượng của

thuốc

- Tiếp tục nghiên cứu áp dụng phương pháp HPLC đã được tối ru hóa cho