Nghiên cứu định lượng các hoạt chất pyridoxin hydroclorid naphazolinnitrat chlorpheniramin maleat và phanthenol trong một số thuốc nhỏ mắt đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đồng thời, việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại với sự trợ giúp của máy móc thiết bị đã trở thành xu hướng chung của ngành phân tích các nước trên thế giới và trong khu vực nê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

C Q

NGHIÊN c ứu ĐỊNH LƯỢNG CÁC HOẠT CHẤT

PYRIDOXIN HYDROCLORID, NAPHAZOLIN NITRAT, CHLORPHENỊRAMỊN MALEAT VÀ PANTHENOL

TRONG MỘT SÔ THUỐC NHỎ MẮT ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ê /r ttụêtt inỊtiuíi : ~KiêHt m/lùêtu tltiổe phẩm rì à iĩòe eítíĩt hoe

LUẬN ÁN THỌC SV • • Dược • HỌC•

Jit ũ sô : 3.02.05

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS THÓI PHAN QUVNH NHƯ

TS TRỊNH VfiN iríu

HÀ NỘI - 2000

1.1 Tổng quan về các hoạt chất pyridoxin hydroclorid, 3

naphazolm nitrat, chlorpheniramin m aleat, panthenol

1.2.1 M ột số khái niệm cơ bản về phương pháp sắc ký lỏng 11

hiệu năng cao (HPLC)

1.2.1.2 Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng 151.2.1.3 Cách đánh giá píc (Diện tích và chiều cao) và các 19

phương pháp định lượng thường dùng trong HPLC1.2.2 M ột số chương trình HPLC định lượng 4 hoạt chất 20

pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniramin maleat, panthenol

1.2.2.1 Một số công thức nhỏ mắt trên thị trường có chứa 20

thành phần pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat, panthenol

1.2.2.2 Một số chương trình HPLC định lượng 4 hoạt chất 22

pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat, panthenol

Chương 2 : Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 31

ấ

chlorpheniram in maleat

2.3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký chương trình sắc ký 34

2: Định lượng panthenol

2.3.3 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng đồng thời 35

pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat,

chlorpheniram in maleat, panthenol trong thuốc nhỏ mắt

đa thành phần

2.3.4 Đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của phương pháp 36

định lượng đã nghiên cứu

3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp định 37

lượng 4 thành phần

3.1.1 Chương trình sắc ký 1: Định lượng đồng thời pyridoxin 38

hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat

3.1.2 Chương trình sắc ký 2: Định lượng đổng thời Panthenol 413.2 Xác đinh độ ổn định của hệ thống sắc ký 433.3 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp đinh lượng 44

3.5 Xác đinh độ đúng của phương pháp xây dựng 493.6 Xây dựng phương pháp đinh lượng pyridoxin hydroclorid, 52

naphazolin nitrat, chlorpheniramin maleat

3.7 Xây dựng phương pháp định lượng panthenol 533.8 Áp dụng phương pháp định lượng để định lượng một số 55

mẫu đang lưu hành

Phụ lục

T R A P H A C O C ông ty Dược phẩm và th iế t bị vật tư y tế -

Bộ G iao thông vận tải

X N D P T W 2 X í n g hiệp Dược p h ẩm T ru n g ương 2

U V -V IS T ử ngoại khả kiến

n g m cg : M ic ro sa m

ĐẬT VẤN ĐỂ

Trong những năm gần đây, các thuốc đa thành phần có tác dụng dược lý phối hợp được sản xuất, lun hành và sử dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở nước ta Thuốc nhỏ m ắt đa thành phần là m ột loại điển hình, ngày càng được

ưa dùng nên đã có nhiều biệt dược được sản xuâ't và lưu hành như : V-Rohto; Tobiorb; Rohto-kodom o soft.; Naphacollyre; Rohto-Antibacteri Thành phần của các thuốc nhỏ m ắt loại này thường có tối thiểu bốn hoạt chất trong số các chất sau : kháng sinh hoặc sulfamid diệt khuẩn, nấm, virut (chloramphenicol, gentamicin, natri sulfacetamid); kháng histam in (chorpheniramin); giảm nhãn

áp (neostigmin); co mạch ngoại vi, giảm sung huyết (naphazolin, tetra hydrozolin); dinh dưỡng giác mạc (pyridoxin, panthenol )

Gần đây một số nhà sản xuất trong nước cũng đã nghiên cứu bào chế thuốc nhỏ m ắt (APOL của TRAPHACO, VIRONDO của XNDPTW 2) với công thức chứa các thành phần sau : Panthenol, naphazolin nitrat, pyridoxin hydroclorid, chlorphenirram in maleat

Trong các chuyên luận của các dược điển hiện nay mới chỉ có đinh tính, định lượng riêng biệt từng thành phần trong các chế phẩm đơn thành phần bằng các phương pháp như phương pháp thể tích, phương pháp đo thế [19] [20] [21 ] [27] [28] [29][30] [31 ] [35] [38][40] [41 ] [42][43] [44], phương pháp đo quang hoặc tạo mầu rồi đo quang [22][30][35][36]40][42][44], phương pháp HPLC [36][38] hay phương pháp sắc ký khí [22] Việc định lượng các thành phần trong các chế phẩm đa thành phần bằng các phương pháp như trên đều

có nhược điểm tốn thời gian và công sức, dễ mắc sai số do phải chiết tách phức tạp hoặc pha loãng quá nhiều lần, trong m ột số trường hợp nhiều khi không tiến hành được do ảnh hưởng của tá dược

Trong m ột số công trình đăng trên các sách, tạp chí và thông báo kiểm nghiệm của Viện kiểm nghiệm có đề cập tới phân tích một số dạng thuốc đa thành phần có chứa m ột số thành phần như đã nêu Nhưng chúng tôi chưa thấy có tài liệu nào đề cập một phương pháp có thể định lượng bốn thành phần chính như trong thuốc nhỏ mat APOL và VIRONDO Cũng có một số công trình về phương pháp HPLC để định lượng các thành phần đã nêu, tuy

nhiên về m ặt này hay m ặt khác, việc áp dụng ở các phòng thí nghiệm của ta hãy còn trở ngại Do vậy, việc kiểm tra, quản lý, giám sát chất lượng các chế phẩm có các thành phần như trên gặp rất nhiều khó khăn Qua phân tích cấu trúc, tính chất hoá lý của các thành phần chúng tôi nhận thấy có khả năng phân tách chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đồng thời, việc áp dụng các phương pháp phân tích hiện đại với sự trợ giúp của máy móc thiết bị đã trở thành xu hướng chung của ngành phân tích các nước trên thế giới và trong khu vực nên chúng tôi chọn phương pháp HPLC là phương pháp thích hợp để phân tích trực tiếp các thành phần đã nêu ở trên.

X uất phát từ yêu cầu thực tiễn của công tác kiểm nghiệm phục vụ việc đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất trong nước và thuốc ngoại nhập đang lưu hành trên thị trường chúng tôi đã tiến hành đề tài : ‘Nghiên cứu định lượng

pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat, panthenol trong thuốc nhỏ mắt đa thành phần bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu n ăn g cao ” với mong muốn rằng phương pháp phân tích đinh lượng bốn thành phần đã nêu trong thuốc nhỏ mắt đa thành phần này sẽ trở thành tài liệu thường quy để có thể áp dụng định lưọng các thành phần trong các chế phẩm mà có chứa những thành phần nêu trên

Để giải quyết mục tiêu trên chúng tôi tiến hành các nội dung sau :

♦ Nghiên cứu, khảo sát, lựa chọn các điều kiên sắc ký thích hợp để đinh lượng trực tiếp pyridoxin, hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniramin

m aleat, panthenol

♦ Xác định độ ổn định của hê thống sắc ký

♦ Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp

♦ Xác định độ lặp lại của phương pháp

♦ Xác định độ đúng của phương pháp

♦ Xây dựng phương pháp đinh lượng pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat, panthenol trong thuốc nhỏ mắt đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

♦ Đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của phương pháp bằng cách áp dụng phương pháp vào định lượng một số mẫu đang lưu hành

Chương I

TỔNG QUAN

1.1 T Ổ N G QUAN VỂ CÁC HOẠ T C H Â T PY RID O X IN H Y D RO C LO R ID ,

N A PH A Z O L IN N ITRA T, CH LO RPH ENBRAM IN M ALEAT,

- Nóng chảy ở 205°c kèm phân huỷ

- Tan trong 5 phần nước

- Tan trong 100 phần ethanol (96%)

- Thực tế không tan trong cloroform và ether -Phổ tử ngoại [25]

+ Dung dịch 0,001% trong dung dịch acid hydrocloric 0,1M có cực đại

ở bước sóng từ 288nm đến 296nm với E(1 %, lcm ) từ 425 đến 445

ở 320nm đến 327nm vói E(1 % ,lcm ) từ 345 đến 365.

Phương pháp định lượng :

Tuỳ theo pyridoxin hydroclorid ở dạng nguyên liệu hoặc thành phẩm

m à người ta sử dụng các phương pháp định lượng cho thích hợp

- Đối với pyridoxin hydroclorid dạng nguyên liệu:

Dược điển Anh BP 1993 [23], Dược điển Châu Âu 1997 [29], Dược điển Nhật 1996[44], Dược điển Ấn Độ 1996 [32], Dược điển Trung Quốc 1997[42] định lượng bằng phương pháp chuẩn độ trong m ôi trường khan Hoà tan một lượng chế phẩm trong acid acetic khan và thêm m ột lượng nhất định dung dịch thuỷ ngân II acetat và chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,lN P hát hiện điểm kết thúc của phép định lượng có thể dùng phương pháp

đo thế hoặc dùng chỉ thị màu là tím tinh thể

- Để định lượng dung dịch tiêm pyridoxin hydroclorid , một số Dược điển [38],[44] đã dùng phương pháp đo quang phổ dựa trên phản ứng của pyridoxin với 2 ,6 - dicloroquinon clorimid trong isopropyl alcol tạo phẩm màu indophenol, sau đó đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 650nm

Phương pháp này được ứng dụng để định lượng pyridoxin trong dung dịch tiêm ,trong viên nén ,viên nang[38],[44] hoặc trong m ột số dạng thuốc

m ultivitamin

Ngoài ra người ta cũng áp dụng phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở 291nm trong môi trường acid hydrocloric 0,1M để đinh lượng pyridoxin trong thuốc tiêm và trong viên nén Phương pháp này thực hiện đơn giản, nhanh , nhưng chỉ áp dụng được cho các chế phẩm không chứa các chất phụ gia có hấp thụ quang làm ảnh hưởng tới định lượng pyridoxin [41] [32]

Trong Dược điển Mỹ 23[38] đã ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) với chương trình sau đây để định lượng pyridoxin hydroclorid ở dạng nguyên liệu cũng như trong các dạng bào chế khác:

♦ Pha động: Trộn 20ml acid acetic khan với l,2 g natri hexansulfonat và khoảng 1400ml nước trong bình định mức 2000m l.Điều chỉnh pH của dung dịch đến 3,0 bằng acid acetic hoặc natri hydroxyd IM Sau đó thêm 470ml methanol và thêm nước đến vạch , lắc đều và lọc

♦ Dung dịch chuẩn nội: Hoà tan acid p-hydroxybenzoic trong pha động để thu được dung dịch có chứa 5mg acid p-hydroxybenzoic trong lm l dung dịch chuẩn nội

♦ Dung dịch thử và chuẩn: Được chuẩn bị sao cho mỗi dung dịch có chứa khoảng 0,05mg pyridoxin hydroclorid và 0,05mg acid p-hydroxybenzoic trong lm l pha động

♦ Tiến hành sắc ký theo chương trình:

Cột sắc ký; Lichrosorb RP 8 ( 25cm X 4,6m m ,10 ịiin)

Tốc độ dòng: l,5m l/ phút

Detector : UV- 280nm

Tính c h ấ t :

- Bột kết tinh trắng hoặc gần trắng, không màu hoặc gần như không màu

- Tan được trong nước, tan trong ethanol 96%

- Tan không đáng kể trong cloroform, không tan trong ether

- Dạng naphazolin hydroclorid tan tự do trong nước, ethanol 96%

thực tế không tan trong ether.'

- Phổ tử ngoại [25]:Trong dung dịch acid sẽ hấp thụ cực đại ở các đỉnh

271, 281, 288, 291nm Ở 281nm có E (l% ,lc m ) là 321

Phưong pháp định lượng :

- Nguyên liệu dạng nitrat hoặc dạng hydroclorid ở các Dược điển đều dùng phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan: C hế phẩm được hoà tan trong acid acetic khan thêm một lượng nhất định thuỷ ngân acetat và chuẩn

độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M Phát hiện điểm kết thúc của phép định lượng có thể dùng phương pháp đo thế hoặc dùng chỉ thị mầu là tím tinh thể hoặc m ethyl rosanilin [21][28][36][40][43] Hoặc chuẩn độ đo kiềm đối với dạng naphazolin hydroclorid : Hoà tan m ột lượng chính xác chế phẩm trong m ột thể tích chính xác dung dịch acid hydrocloric 0,01 M, thêm ethanol 96% Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1M Xác định điểm kết thúc chuẩn độ bằng phương pháp đo thế [2 1].

- Đối với các dung dịch nhỏ mắt, nhỏ mũi chỉ chứa naphazolin hydrochlorid, một số Dược điển [36] [40] đã tiến hành định lượng bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở bước sóng 280nm, dung môi là nước hoặc methanol

- Trong Dược điển Mỹ 23 [36] đã dùng phương pháp sắc ký lỏng để định lượng dung dịch nhỏ mũi naphazolin hydroclorid đon thành phần với chương trình sắc ký sau:

♦ Pha động : Hoà tan 1,1 g natri 1 -heptanesulfonat trong 400 ml nước Thêm 250 ml acetonitril và 10 ml acid acetic băng, thêm nước vừa đủ 1000

ml, lắc đều, lọc, đuổi khí pH dung dịch pha động khoảng 3,5

♦ Dung dịch chuẩn, thử : pha trong dung môi nước sao cho nồng độ naphazolin hydroclorid chứa trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử khoảng

- Tan tự do trong nước, tan trong cloroform, trong ethanol 96%;

tan không đáng kể trong ether

- Phổ tử ngoại:Trong môi trường acid, đỉnh hấp thụ cực đại là265nm; E( 1 %, 1 cm)là 302 [25] ỷ f )

Phương pháp định lượng : :

- Đối với dạng nguyên liệu hầu hết các Dược điển đều dùng phương pháp chuẩn độ acid -base trong môi trường khan : Hoà tan một lượng chế

phẩm trong acid acetic khan, có hoặc không có mặt dung dịch thuỷ ngân

acetat, chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1M Phát hiện điểm kết thúc

của phép định lượng có thể dùng phương pháp đo thế hoặc dùng chỉ thị mầu là methyl rosanilin clorid hoặc tím tinh thể [19][35][30][42].

- Đối với một số dạng như dung dịch tiêm, dung dịch uống (Siro), viên nén và bột [22][42][30] [35], người ta sử dụng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại ờ 265nm trong môi trường acid sulfuric (dung dịch 1/350 hoặc 0,25M ) hoặc acid hydrocloric (dung dịch 1/100)

- Cũng có thể sử dụng phương pháp chiết cặp ion rồi đo quang phổ khả kiến để định lượng chlorpheniramin maleat trong các hỗn hợp: Dựa trên nguyên tắc tạo cặp ion với methyl da cam (heliantin) ở pH=4,6 và chiết bằng chloroform rồi xác định mật độ quang ở 422nm.[9]

- Đối với dung dịch uống (Elixir) đơn thành phần chlorpheniramin

m aleat , Dược điển Mỹ 23 [22] dùng phương pháp sắc ký khí để đinh lượng chlorpheniramin maleat

- Để định lượng chlorpheniramin maleat trong dạng viên nang giải phóng chậm , ƯSP 23 [35] đã áp dụng phương pháp sắc ký lỏng với chương trình sắc ký như sau:

♦ Pha động : hoà tan 2,0g natri perclorat trong 350 ml nước, thêm 650ml methanol và 2,0 ml triethylamin Lắc kỹ Lọc Đuổi khí

♦ Dung dịch chuẩn và th ử : Pha dung dịch chuẩn và thử trong acid hydrocloric loãng (1%) sao cho nồng độ chlorpheniramin maleat khoảng 0,12mg/ml

♦ Điều kiện tiến hành :

Detetor :ƯV - 261nm

C ộ t: C18, 3,9mm X 15cm,10|im (cột L l)Tốc độ dòng : lm l/phút

Hoặc có thể sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (5^m ) với pha động gồm: [6]

Acid phosphoric 19,6g

M ethanol 10% vừa đủ 1000ml

- Chất lỏng sánh không màu hoặc vàng nhẹ hoặc bột kết tinh.

- Tan trong nước, tan tự do trong ethanol (96%), tan không đáng kểtrong ether

- Phổ tử ngoại: Panthenol không có sự hấp thụ đáng kể ở 230 - 260nm,

mà hấp thụ ở vùng bước sóng ngắn 198-205nm[25]

Phương pháp định lượng :

- M ột số Dược điển đã định lượng panthenol ở dạng nguyên liệu bằngphương pháp định lượng trong môi trường khan [20] [27]:

Cân chính xác khoảng 0,4g panthenol và chính xác 50ml acid percloric

0 ,IM, đun hổi lưu tránh ẩm trong 5 giờ Thêm 50ml 1,4- dioxan,thêm 0,2ml chỉ thị mầu là dung dịch naphtolbenzein Chuẩn độ bằng kali hydrophtalat Cũng có thể dùng chỉ thị tím tinh thể [37],

Dược điển Ấn độ 1996 định lượng nguyên liệu panthenol bằng phương pháp xác định hàm lượng nitơ toàn phần Nguyên tắc và tiến hành cũng giống Dược điển Việt Nam 2-tập 3: Xác định hàm lượng amoniac trong amonisulfat thu được khi vô cơ hoá hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bằng acid sulfuric [31].

1 2 M Ộ T SỐ C H Ư Ơ N G T R ÌN H SẮC KÝ L Ỏ N G H IỆ U NĂNG CAO (H P L C ) ĐÃ ĐƯ ỢC Á P DỤNG Đ Ể Đ ỊN H LƯ Ợ N G C Á C H O Ạ T C H Ấ T

T R O N G T H U Ố C ĐA T H À N H PH Ầ N

1.2.1- Một sô khái niệm cơ bản về HPLC [30][34] :

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) còn được gọi là sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiện đại Đây là một phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha: pha tĩnh (cột hiệu năng cao) là chất rắn (hạt xốp, bột mịn) hay một chất lỏng được giữ trên 1 chất rắn, pha động là chất lỏng(dung môi rửa giải) Hai pha này luôn tiếp xúc nhau nhưng không hoà lẫn vào nhau Sự tách sẽ đạt được bởi sự phân bố, hấp phụ hoặc các quá trình trao đổi ion tuỳ thuộc vào cột và kiểu sắc ký áp dụng

Khi dung dịch chứa hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và kiểu sắc ký áp dụng, pha động (dung môi) được đưa qua cột dưới áp lực của bơm cao áp Tuỳ vào ái lực của các chất đối với hai pha mà chúng sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau dẫn đến sự phân tách Sau khi tách, các chất lần lượt được đưa ra khỏi cột đến detector Tuỳ theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp (detector tử ngoại, detector độ dẫn ) Detector hay được sử dụng nhất là ƯV-Detector Máy ghi hoặc máy tính ghi lại các tín hiệu dưới dạng pic trên sắc ký đổ

1.2.1.1 M ộ t sô đại lượng đặc trưng :[1][2][4][24] [45]

H ình 1 : Các thông số thời gian mô tả trên sắc ký đồ

tQ : thời gian c h ế t: là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách

(* m )

tR : thời gian lưu : thời gian cần thiết kể từ khi chất được bơm vào cột cho

đến khi đạt đừợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hệ thống tách

t'R : thời gian lưu thực = tR -10

V0 ; VR ; V'R : là thể tích chết của cột, thể tích lưu, thể tích hiệu chỉnh

nếu trục hoành của sắc đồ là đơn vị đo thể tích

W B : chiều rộng pic ở đáy pic

W 1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh

Bảng 1 : Một số đại lượng đặc trưng trong phương pháp HPLC

Các đại lượng Công thức Thông tin tóm tắt về các đại lượng

- Là một hằng số đối với 1 cấu tử

đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

- k' của 1 chất thay đổi theo nồng

^R2 ■ *o

*R1 ■ to

- Để tách riêng 2 chất cần có oc >1 (từ 1-2) oc 1Ớ11 quá, thời gian phân tích sẽ kéo dài

- 1 số ảnh hưởng tới oc : pha động,

pH pha động, T° cột, pha tĩnh, chất xúc tác hoá học thêm vào pha động

• Độ nhớt của pha động (tỷ lệ nghịch)

• Nhiệt độ

• k> 2 ảnh hưởng ít (tỷ lệ thuận nếu k < 2)

• Sự doãng pic (sự mở rộng dải)

• Lượng chất lớn (mg) và thể tích lớn (102ịi1) sẽ làm giảm N

- Độ phân giải phụ thuộc vào :

a (thay thành phần pha động hoặc pha tĩnh) - có ảnh hưcmg mạnh;

N (độ dài cột, độ nhớt của pha động, cỡ hạt nhồi cột, tốc độ thẳng của dung môi (Ư)-ảnh hưởng ít;K’ (thay đổi thành phần pha động) thường phụ thuộc vào K’2

1.2.1.2 Phân loại các kỹ thuật HPLC và ứng dụng[l][46]

- Dựa trên bản chất hiện tượng sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel) mà người ta chia phương pháp HPLC làm

4 loại kỹ thuật HPLC Việc lựa chọn kỹ thuật sắc ký nào trước hết phải căn cứ vào các tính chất của các chất trong hỗn hợp cần tách : Khối lượng phân tử, tính chất tan,độ phân cực ( pKa hợp chất ion hay không ion), độ hấp thụ tử ngoại,khả kiến

♦ Sắc ký phân bô hiệu năng cao :

Dựa vào bản chất của pha tĩnh là chất lỏng được gắn kết với chất mang như thế nào mà ta có 2 loại sau :

- Nếu pha tĩnh được bao trên bề mặt hấp phụ của các hạt chất mang (support) thì được gọi là : sắc ký lỏng - lỏng (L L C ) Cột thường mất dần hiệu lực do pha tĩnh thường bị dung môi (pha động) hoà tan và mất dần (cột chảy máu) Vì vậy, kỹ thuật này ngày nay ít được dùng

- Nếu pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel)

để tạo nên hợp chất cơ siloxan thì được gọi là : sác ký pha liên k ết (BPC -

Bonded phase chrom atography).

Sắc ký p h a th u ậ n (truyền thống) : pha tĩnh phân cực hơn pha động.Sắc ký p h a đảo (sắc ký pha ngược) : pha tĩnh lại ít phân cực hơn pha

động

Ngày nay sắc ký pha đảo (reversed phase chrom atography) được dùng rất rộng rãi vì nó cho kết quả tách tốt với rất nhiều đối tượng tách

♦ Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (sắc ký lỏng - rắn : LSC)

- Là kỹ thuật phát triển sóm nhất và được dùng phổ biến, thành công để tách các hỗn hợp trong đó các chất có tính chất gần tương tự nhau, đọng thời chúng phải thuộc loại không phân cực hoặc phân cực yếu, trung bình

Trong kỹ thuật này chất tan bị giữ lại trên bề m ặt pha tĩnh (tức là chất hấp phụ : silicagel, nhôm oxit, ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ - pha động)

Các chất càng phân cực càng bị lưu giữ mạnh và ra chậm khi rửa giải Các dung môi có thông số sức dung môi 8° tăng dần thì khả năng đẩy các chất

ra khỏi pha tĩnh (sức rửa giải) tăng dần

♦ Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao :

- Pha tĩnh : các nhựa trao đổi ion (ionit) dưới dạng bột mịn, đó là những hợp chất cao phân tử có chứa những nhóm chưa có khả năng trao đổi

- Các ionit (cationit, anionit) không tan trong nước, khi tiếp xúc với dung dịch hỗn hợp ion thì xảy ra sự trao đổi (diễn ra cân bằng trao đổi ion)

- Quá trình rửa giải cũng chính là quá trình hồi nguyên (tái sinh) ionit

♦ Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel (sắc ký rây phân tử)

Là kỹ thuật mới phát triển và được ứng dụng chủ yếu cho các chất có phân tử lượng lớn (M W >2000) và các chất này là loại hợp chất không có khả năng phân ly thành ion Như vậy việc tách các phân tử lổn như các protein rất thích hợp với kỹ thuật sắc ký này Hoặc có thể sử dụng tách các đường trong nước quả,

Trong kỹ thuật này chất nhồi là những hạt xốp của silicagel hay polime

có kích thước nhỏ (khoảng 10 Ịim).Pha tĩnh là dung môi nằm trong các lỗ xốp của hạt, pha động là dung môi chảy giữa các hạt

Khi phân tử chất tan có phân tử lượng lớn (cỡ lớn, cỡ trung bình của các

lỗ xốp) thì sẽ không bị lưu giữ và di chuyển theo dung môi (tức là bị loại) Các phân tử nhỏ hơn có thể khuếch tán, vào lỗ xốp Các phân tử rất nhỏ so với lỗ xốp sẽ đi sâu vào lỗ này, và ra chậm Khi rửa giải các phân tử sẽ lần lượt ra theo cỡ từ lớn đến nhỏ

Có 2 loại : - sắc ký lọc trên gel (các gel ưa nước được dùng với pha động là dung dịch nước)

- Sắc ký thẩm thấu trên gel (các gel kỵ nước được dùng với pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực hoặc ít phãn cực)

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu, chúng tôi ứng dụng :Kỹ thuật cặp

ion trong sắc ký pha đảo

-Sắc ký lỏng pha đảo (RPC - Reversed phase chromatography) [4] [34]:

- Pha động phân cực : Nước và các hỗn hợp dung môi trộn lẫn theo các tỷ

Các dung môi hay được sử dụng (sức rửa giải tăng dần) : nước, methanol, acetonitril, isopropanol, dioxan, tetrahydrofuran, hỗn hợp của các chất trên

Nói chung dung môi cho hệ pha đảo thường dùng là: nước cất, methanol, acetonitril một số acid hay bazơ hữu cơ tan tốt trong nước, một vài amin hay aminoacid

- Thứ tự rửa giải : các chất phân cực ra trước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau

- Úng dụng : Định tính, định lượng các chất trung tính, acid và base yếu, các chất khác

- Đối với các chất ở dạng ion, người ta hay chuyển chúng về dạng phân

tử để quá trình rửa giải diễn ra không quá nhanh (tăng thời gian lưu) bằng cách làm thay đổi pH (để phương trình phân ly diễn ra theo chiều ngược lại) hay sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion

Kỹ thuật sắc ký cặp ion có nguồn gốc từ phương pháp chiết cặp ion mà

cơ chế là khi cho một ion trái dấu (ion tạo cặp) vào trong pha nước có chứa các ion, các ion chất tan sẽ tạo với ion trái dấu thành một cặp ion không mang điện và các cặp ion này sẽ chuyển từ pha động phân cực sang pha tĩnh ít phân cực (đối với các base hĩru cơ - cation hay sử dụng các muối alkylsulfonat làm chất tạo cặp)

lê

A+ + B' => (A+ B ) Pha động (phãn cực)

(A+ B ) Pha tĩnh (ít phân cực)

1.2.1.3.Cách đánh giá pic( diện tích, chiều cao) và các phương pháp định lượng thường dùng trong HPLC [10] [33] [4]

♦ Đánh giá pic:

- Diện tích pic của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó

Để đánh giá diện tích píc, hiện nay người ta dùng tích phân k ế hoặc dùng máy tính đã cài đặt sẩn chương trình

Việc xác định diện tích pic sẽ gặp khó khăn khi cường độ pic quá lớn, píc bị doãng, không đối xứng hoặc khi đường nền bị nhiễu, pic bị biến dạng, xuất hiện pic lạ do hiệu ứng hoá học hay detector bị nhiễu [26]

-Chiều cao pic( khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ

lệ với diện tích pic khi pic cân đối Nó cũng có thể được dùng để đánh giá sắc phổ M ột điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao pic là các chỉ số k' hằng định Với các pic có đường nền bị nhiễu việc xác đinh chiều cao pic sẽ

dễ dàng hơn xác định diện tích pic

♦ Phương pháp ngoại chuẩn:

Là phương pháp dựa trên cơ sở so sánh pic( diện tích pic, chiều cao pic) của mẫu thử và mẫu chuẩn được phân tích trong cùng điều kiện Kết quả của chất chưa biết được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ (Với yêu cầu nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử gần tương đương nhau)hoặc suy ra từ đường chuẩn( với yêu cầu nồng độ mẫu thử phải nằm trong vùng nồng độ nghiên cứu và phải định kỳ kiểm tra, xác định lại đường chuẩn)

♦ Phương pháp nội chuẩn:

Là phương pháp mà nồng độ chất thử được xác định gián tiếp so với chất chuẩn bằng cách cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi (chất chuẩn nội) mà trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử Nó được tách hoàn toàn với các chất khác và có nồng độ gần bằng nồng độ chất phân tích và có

cấu trúc hoá học tương ứng.Phương pháp này cho phép giảm sai số và đạt độ lặp lại cao

♦ Phương pháp thêm chuẩn :

Được sử dụng chủ yếu khi có vấn đề ảnh hưởng của chất phụ Dung dịch mẫu thử được thêm m ột lượng xác định chất chuẩn.Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện phân tích Phương pháp thêm chuẩn có thể thực hiện một lần , hai lần hay nhiều lần Trong trường hợp đơn giản nhất với thêm một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn pic Nếu thêm nhiều lần chất chuẩn, nồng độ mẫu được tính toán bằng phương pháp phân tích hồi qui.Phương pháp thêm chuẩn có độ chính xác cao và loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng như chất phụ, sự thay đổi nhiệt độ, áp suất Nó thường được sử dụng để xác định độ đúng của phép định lượng

♦ Phương pháp phần trăm diện tích pỉc (hoặc % chiều cao pic):

Là phương pháp tính toán hàm lượng chất chưa biết dựa trên diện tích pic(hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng số toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong phương pháp HPLC, cách tính này chỉ đúng khi sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau Nếu không như nhau, mỗi chất cần

♦ Thuốc nhỏ m ắt V-ROHTO

( sản phẩm của ROHTO PHARMACEUTICAL C O , LTD DJAPAN )

cấu trúc hoá học tương ứng.Phương pháp này cho phép giảm sai số và đạt độ lặp lại cao

♦ Phươiig pháp thêm chuẩn :

Được sử dụng chủ yếu khi có vấn đề ảnh hưởng của chất phụ Dung dịch mẫu thử được thêm m ột lượng xác định chất chuẩn.Các pic thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được đo trong cùng một điều kiện phân tích Phương phấp thêm chuẩn có thể thực hiện một lần , hai lần hay nhiều lần Trong trường hợp đơn giản nhất với thêm một lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu được tính bằng sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của độ lớn pic Nếu thêm nhiều lần chất chuẩn, nồng độ mẫu được tính toán bằng phương pháp phân tích hồi qui.Phương pháp thêm chuẩn có độ chính xác cao và loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng như chất phụ, sự thay đổi nhiệt độ, áp suất Nó thường được sử dụng để xác định độ đúng của phép định lượng

♦ Phưong pháp phần trăm diện tích pỉc (hoặc % chiều cao pic):

Là phương pháp tính toán hàm lượng chất chưa biết dựa trên diện tích pic(hoặc chiều cao pic) của nó tính theo phần trăm trên tổng số toàn bộ pic có trong sắc ký đồ Trong phương pháp HPLC, cách tính này chỉ đúng khi sự đáp ứng của detector trên các chất là như nhau Nếu không như nhau, mỗi chất cần

♦ Thuốc nhỏ mắt V-ROHTO

( sản phẩm của ROHTO PHARMACEUTICAL C O , LTD DJAPAN )

(50mg d - a Tocopherol acetat)Neosigmin methylsulat

kali asparaginat

♦ Thuốc nhỏ mát ROHTO KODOMO soft

( Sản phẩm của ROHTO PHARMACEUTICAL c o ,LTD-JAPAN và của

ROHTO- MENTHOLATUM(VIỆT NAM) co ,LTD )Công thức :

Chlorpheniramin m aleat 0,01%

Amino ethyl sulfonic acid 1,00%

8 - Amino caproic acid 1,00%

♦ Thuốc nhỏ mắt ROHTO ANTIBACTERIA

(Sản phẩm của ROHTO- MENTHOLATUM(VIỆT NAM) c o ,LTD )

♦ Thuốc nhỏ m ắt NAPHACO LLYRE

( Sản phẩm của CÔNG TY Dược PHAM n a m h à ) Công thức :

Từ trước đến nay,đối với những thuốc đa thành phần nói chung, thuốc nhỏ mắt đa thành phần nói riêng thường định lượng các hoạt chất bằng cách tách chiết từng thành phần rôì mới dùng các phương pháp hoá học hay phương pháp quang phổ ƯV-VIS (phương pháp quang phổ cổ điển) Cách này đòi hỏi có quá trình tách chiết từng chất rất khó khăn, tốn công sức, độ chính

xác không cao, các thành phần sẽ gây ảnh hưởng lẫn nhau trong quá trình định lượng, thời gian phân tích dài.

Từ những năm 1980, người ta sử dụng phương pháp quang phổ đạo hàm vào việc định lượng đồng thời các chất trong hỗn hợp thuốc nhiều thành phần

mà không cần phải tách chiết chúng Tuy nhiên muốn thực hiện được phương pháp này đòi hỏi phải có máy quang phổ với những chức năng đặc biệt như có khả năng lấy được đạo hàm, thực hiện được các phép tính về phổ nhưng hiện nay, ở Việt Nam những máy như vậy rất ít Mặt khác, phương pháp thường chỉ định lượng những hỗn hợp từ 3 thành phần trở xuống Do vậy trên thực tế phương pháp này mới chỉ có ý nghĩa về m ặt nghiên cứu khoa học

Đó cũng là những khó khăn lớn nhất của việc định lượng thuốc đa thành phần hiện nay ở Việt Nam

Ngày nay, trên thế giới người ta thường sử dụng phương pháp HPLC để định lượng hỗn hợp đa thành phần, chính vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC do có những ưu điểm sau[l][2]:

- Cho phép có thể tách, kết hợp định tính, định lượng các hoạt chất trong cùng 1 chế phẩm mà không đòi hỏi tách, chiết riêng từng chất trước khi định lượng

- Lượng mẫu dùng phân tích nhỏ

- Phạm vi lựa chọn cơ chế tách và kỹ thuật điều kiện tiến hành rất linhđộng

- Thời gian phân tích ngắn

- Độ chính xác cao và dễ thao tác, ít gây sai số do động tác người làm phân tích

Đặc biệt ở những thuốc nhỏ mắt thường là dung dịch khá tinh khiết, ít tá dược, và chất phụ gia, thì sử dụng phương pháp HPLC là rất hợp lý, hiệu quả cao

Để định lượng các hoạt chất trong thuốc đa thành phần, người ta đã dùng một số chương trình sắc ký như sau.

Ạ Định lượng naphazolin hydrocỉorid, chlorpheniramin maỉeat và neostigmin methylsulfat, dikali glycyrrhzinat trong thuốc nhỏ mắt V- ROHTO [7].

* Dung dịch natri 1 - heptansulfonat:

Hoà tan 1,02 g natri 1 - heptansulfonat trong 1000ml nước cất

* Chỉnh pH pha động =2,60 bằng acid phosphoric

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác các chất chuẩn pha trong dung môi nước sao cho chứa khoảng 0,03mg/ml naphazolin nitrat và 0,lm g/m l chlorpheniramin maleat, 0,05mg/ml neostigmin m ethylsulfat, lm g/m l dikali glycyrrhinat, 2mg/ml polysorbat 80, 0,lm g/m l benzalkonium clorid

- Dung dịch thử: Dùng V-ROHTO làm dung dịch thử

-Tốc độ dòng: điều chỉnh vận tốc dòng sao cho thời gian lưu của neostigm in methylsulfat bằng khoảng 5 phút

- Detector: ƯV-220 nm

- Thể tích tiêm: 20 Ịil

4 Định lượng pyridoxin hydroclorid, panthenol trong thuốc nhỏ mắt

* Chỉnh pH pha động = 2,8 bằng acid orthophosphoric

- Dung dịch chuẩn: pha trong dung môi nước sao cho nồng độ của pyridoxin khoảng 0,1 mg/ml , panthenol khoảng 0,2m g /m l

- Dung dịch thử : dung dịch V-ROHTO pha loãng 5 lần bằng nước cất

- Tốc độ dòng : 1,2 ml/phút để thời gian lưu của panthenol (chất ra sau) khoảng 26 phút

- Pha động : dung dịch hỗn hợp : l,08g natri 1- octansulfonat trong 20ml acid acetic loãng(lphần 8)và thêm 750ml nước Lấy 700ml dung dịch này, thêm 300ml acetonitril.

- Dung dịch chuẩn nội: Hoà tan lg chất chuẩn nội ethylaminobenzoat trong 1000ml pha động Lấy 8 ml dung dịch này thêm vừa đủ 1000 ml pha động Dùng dung dịch này làm dung dịch chuẩn nội

- Dung dịch chuẩn : Cân chính xác khoảng 100 mg chất chuẩn pha trong dung dịch chuẩn nội vừa đủ 40 ml

- Dung dịch thử: hút chính xác 2,0ml chế phẩm thêm dung dịch chuẩn nội vừa đủ 1 Oml

- Tốc độ dòng : chỉnh sao cho thời gian lưu của Chlorpheniramin

maleat khoảng 14 phút

- Detector : ƯV - 260nm

4 Định lưọng pyridoxin hydroclorid trong hỗn hợp các dạng bào ch ế có các chất khác

- Trong ‘’ Senterlic capsules” chứa [15]:

Phenazone, Vitamin B l, Vitamin B6

Các tác giả đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo có tạo cặp ion

C ộ t: Micro Bondapak (20cm X 5mm) ,10 Jim

Nhiệt độ cột: ổn nhiệt ở 30°c

Pha động : Acetonitril trong dung dịch chứa :

0,32g natri -1-octane sulfonat 2ml triethylamin

1 0ml acid acetic băng nước vừa đủ 1 lítTốc độ dòng : l,4m l/phút

Dung môi pha mãu là methanol

Thể tích tiêm : 20 |_il

4Định lượng chlorpheniramin maleat hổn hợp các dạng bào chê có các chất khác :

- Chlorpheniramin maleat trong viên nén đinh lượng bằng HPLC [11]

C ộ t: Bondapack C18 (lOcm X 8mm ), 10|imPha động : 0,05M ammonium acetat trong acetonitril (60%).Thêm acid acetic băng để chỉnh pH pha động = 3,5

Dung dịch chuẩn nội : 100 mg propyl paraben trong 100ml

methanolDung môi pha mẫu: là dung dịch chuẩn nội và acetonitril

theo tỷ lệ 1:34

D etector : UV-265nm Tốc độ dòng: l ,8ml/phútKhoảng tuyến tính của chlorpheniramin maleat là 0,5-20 mcg/ml Các tác giả cũng nhận thấy phương pháp này có sai số tương đối nhỏ (0,4-2,2%), độ đúng cao (Tỷ lệ tìm lại lượng chất thêm vào mẫu đạt từ 98,25% -100,2% ), nhanh, đơn giản

- Định lượng chlorpheniramin maleat phối hợp với paracetamol, DL- methylephedrin hydroclorid, cafein trong “ Relecold capsules” [12]

Các tác giả sử dụng phương pháp HPLC để định lượng đồng thời các chất

C ộ t: C18 (15cm X 3,9mm ),5ụ.m

Pha động : Acetonitril-H3P 04 (dung dịch 0,1 %) - triethylamine

tỷ lệ ( 8 0 : 9 1 9 : 1)Dung môi pha mẫu là nước cất Tốc độ dòng: lm l/phút

Detector : u v - 220nm Khoảng tuyến tính của:

Chlorpheniramin maleat là 0,05-0,3 mcg Paracetamol là 4-24 mcg

D L-methylephedrin HC1 là 0,ỉó-0,96m cg Cafein là 0,6-3,6 meg

- Định lượng chlorpheniram in maleat (6) trong dung dịch uống phối họp với muối kali của guaiacol sulfonic acid (1), paracetamol (2), DL - methylephedrin (3), cafein (4), dextromethoiphan hydrobromid (5):

Định lượng đồng thời các chất bằng HPLC với các điều kiện sau[13]:

C ộ t : Zorbax ODS (25cm X 4,6mm ) X 10|Lim Dung môi động : Methanol - KH2 P 04 50mM - H3 P 04

Tỷ lệ (500 : 1500 : 1)Detector : ƯV - 214nm

Pha động và detector trên sử dụng đối với các chất (1) đến (4)

Còn với dextromethorphan(5) và chlorpheniramin m aleat(6) thì

pha động là : Methanol - nước - H3 P 04 - natri lauryl sulfat

(tỷ lệ là 800 : 200 : 5 : 2)Detector : u v - 260nm

Khoảng tuyến tính các chất như sau:

Muối kali của guaiacol sulfonic acid là: 1-10 mcgParacetamol là: 5-50 mcg

DL - methylephedrin là: 0,25-2,5 mcgCafein là : 0,5-5 mcg

Dextrom ethorphan là: 0,25-2,5 mcgChlorpheniramin maleat: 0,05-0,5 mcg

C ộ t: Bondapak C18 (30cm X 3,9mm ),

Pha động : Hỗn hợp 0,5% triethylamin và H3PO4 - acetonitril -

methanol với tỷ lệ nhất định theo chương trình dung môi

Dung môi pha mẫu là nước

Thể tích tiêm là 1 OjLil

Detector : u v - 260nm vói chất(2)

ƯV - 264nm với chất( 1) và (3)Khoảng tuyến tính của các chất như sau:

Chlorpheniramin maleat (1) là: 0,04-0,2g/l

Pseudoephedrin hydroclorid (2) là: 0,5-2,5g/l

D extrom ethophan hydrobromid (3) là: 0 ,2 -lg /l

Tỷ lệ tìm lại hoạt chất từ 99,3%-100,1 %

Sai số tương đối từ 1,16%-1,58%

Ạ Định lượng naphazolin trong các dạng bào chê có các chất khác :

- Naphazolin và antozolin[17][18] :

Các tác giả dùng HPLC:

C ộ t: Supelcosil LC-8 hoặc W aters - Bodapak C18

Pha động : Acetonitril - H20 - triethylamin

Tỷ lệ (160 : 239 : 1)Hoặc hỗn hợp methanol 30% chứa natri citrat dihydrat, acid acetic

Chưong 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 ĐÔÌ TƯỢNG NGHIÊN c ứ u :

2.1.1 Thuốc nhỏ mắt APOL:

Công thức:

Panthenol Naphazolin nitrat Pyridoxin hydroclorid Chlorpheniramin maleat Nơi sản xuất: Công ty dược TRAPHACO

Số kiểm soát: 031098

2.1.2 Thuốc nhỏ mắt VIRONDO:

Công thức:

Panthenol Naphazolin nitrat Pyridoxin hydroclorid Chlorpheniramin maleat Nơi sản xuất: XNDPTƯ 2

0,1%

0,025%

0,1%0,01%

0,1%

0,025%

0,1%

0,01%

Thuốc nhỏ mắt ROHTO- K O DO M O soft

(Lot 9001-EXP-2000.02 SDK VN 2956-97)

Thuốc nhỏ mắt ROHTO- KO DO M O soft

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng các thành phần: Pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniram in maleat, panthenol trong các chế phẩm này

2.2 HOÁ CHẤT VÀ DỤNG c ụ :

2.2.1 Hoá chất - thuốc thử

- Các nguyên liệu pyridoxin hydroclorid, naphazolin nitrat, chlorpheniramin m aleat, panthenol đạt tiêu chuẩn dược dụng được sử dụng làm chất đối chiếu hoá học

- M ethanol - tinh khiết sắc ký

- Acid acetic băng — PA

- Acid phosphoric 98% - PA

- Diethylamin - PA

- Natri heptansulfonat

- Acetonitril - tinh khiết sắc ký

- Nước cất tinh khiết sắc ký (lọc qua màng lọc 0,45|j.m)