Nghiên cứu định lượng phyllanthin trong diệp hạ châu và các sản phẩm có chứa diệp hạ châu

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Diệp hạ châu ngọt Phyllanthus urinaria L 4 Hình 1.2: Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn 4 Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-

 -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU

ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN

TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC

SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-

 -

NGUYỄN THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU

ĐỊNH LƯỢNG PHYLLANTHIN

TRONG DIỆP HẠ CHÂU VÀ CÁC

SẢN PHẨM CÓ CHỨA DIỆP HẠ CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Việt Hùng

HÀ NỘI- 2011

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với TS Trần Việt Hùng, người thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn chỉnh luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và tập thể cán bộ Khoa Vật lý đo lường, Khoa Dược lý và Khoa Kiểm nghiệm Đông dược – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện về thời gian cũng như trang thiết bị cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn Đó là những sự giúp đỡ quý báu không thể thiếu trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn cao học

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô, các cán bộ phòng đào tạo sau đại học và các Bộ môn, phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường và hoàn thành luận văn cao học này

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN

: : : : :

:

:

: : : : : :

Acetonitril Acid Deoxyribo Nucleic Aspartate Transaminase Alanine Transaminase Công ty cổ phần

Công ty cổ phần dược Diode Array Detector (Detector mảng diod) Dược điển Việt Nam Diệp hạ châu

Dược liệu Hạn dùng Human immunodeficiency virus (Virus suy giảm miễn dịch ở người) High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

Lethal Dose 50 (Liều lượng chất độc gây chết cho một nửa (50%) số cá thể dùng trong nghiên cứu.)

Limit of detection (Giới hạn phát hiện) Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) Methanol

Ngày sản xuất Purity Analysis (Tinh khiết phân tích) Photo Diode Array

: :

Diện tích píc trung bình Streptozotocin

Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

Tetrahydrofuran Trách nhiệm hữu hạn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch chuẩn 29 Bảng 3.1: Cách pha chính xác các dung dịch chuẩn 34 Bảng 3.2: Kết quả xác định tính đặc hiệu 45 Bảng 3.3: Kết quả xác định giới hạn phát hiện 46 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 48 Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lặp lại của hệ thống 49 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu thử

dược liệu Diệp hạ châu

49

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên viên nang

Hamega (mẫu H1)

49

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu thử

Diệp hạ châu viên bao đường

50

Bảng 3.9: Kết quả xác định độ đúng (dược liệu) 50 Bảng 3.10: Kết quả xác định độ đúng (Diệp hạ châu viên bao đường) 51 Bảng 3.11: Kết quả xác định độ đúng (viên nang Hamega) 51 Bảng 3.12: Kết quả định lượng phyllanthin trên dược liệu Diệp hạ châu

đắng (Phyllanthus amarus Schum et thonn)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Diệp hạ châu ngọt (Phyllanthus urinaria L) 4

Hình 1.2: Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) 4 Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất hóa học có trong cây DHC 7 Hình 3.1: Phổ 3D của dung dịch chuẩn phyllanthin 0,02 mg/ml 39 Hình 3.2: Kết quả chồng píc của dung dịch chuẩn phyllanthin

Trang

Hình 3.15: Sắc ký đồ dung dịch phyllanthin chuẩn 2,65 µg/ml 59 Hình 3.16: Sắc ký đồ của dung dịch thử Bình can ACP 60 Hình 3.17: Sắc ký đồ dung dịch phyllanthin chuẩn 1,325 µg/ml 60 Hình 3.18: Sắc ký đồ của dung dịch thử Livsin-94 lô 670810 (mẫu L2) 61 Hình 3.19: Sắc ký đồ của dung dịch thử Livbilnic lô 01 (mẫu LIV1) 62

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, trong nền Y học thế giới nói chung, xu hướng quay lại sử dụng các các sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật để phòng và trị bệnh đang trở lên thịnh hành Hướng tân dược hóa thuốc đông dược đã và đang phát triển mạnh ở nhiều nước có nền công nghiệp dược phẩm tiên tiến như

Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ và Trung Quốc…

Việt Nam là một trong những nước có nguồn thực vật rất phong phú và đa dạng Đặc biệt, hiện nay xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược trong điều trị các bệnh mãn tính, thời gian sử dụng thuốc kéo dài như bệnh tim mạch, tiểu đường, và đặc biệt là bệnh viêm gan … ngày càng trở lên phổ biến

Trên thế giới hiện có khoảng 2 tỉ người mắc viêm gan B, trong đó có khoảng

350 triệu người chuyển sang giai đoạn mạn tính, nó gây ra khoảng 500.000 đến 1,2 triệu ca tử vong mỗi năm Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cao (từ 10-20%) Để điều trị viêm gan B, bên cạnh việc sử dụng các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược và công nghệ sinh học thì các thuốc có nguồn gốc

từ cây cỏ cũng rất được quan tâm Nhiều loài cây đã được nghiên cứu và áp dụng

trong điều trị viêm gan B, trong đó có các cây thuộc chi Phyllanthus như:

Phyllanthus urinaria L (Diệp hạ châu ngọt hay Chó đẻ răng cưa) và Phyllanthus

amarus Schum et Thonn (Diệp hạ châu đắng hay Chó đẻ đắng)

Các cây mang tên "Diệp hạ châu" thuộc chi Phyllanthus rất phổ biến ở Việt

Nam với số lượng phong phú Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm

sử dụng lâu đời trong dân gian, các cây "Diệp hạ châu" ngày càng được dùng nhiều trong công nghiệp Dược Các nghiên cứu cho thấy phyllanthin và hypophyllanthin có mặt như những thành phần chính của cây [17],[43],[59],[67] Phyllanthin trong Diệp hạ châu có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan Phyllanthin cũng nhanh chóng làm giảm men gan

do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B Vì vậy Diệp hạ châu có

tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc gan do uống bia, rượu, … Trên thị trường trong nước xuất hiện rất nhiều dòng sản phẩm có nguồn gốc từ cây Diệp hạ châu Các sản phẩm này hết sức đa dạng về cả hình thức và chất lượng, chúng được bào chế chủ yếu dưới dạng trà tan, viên nang cứng, viên nén bao phim, viên bao đường như: Diệp hạ châu, Bình can ACP, Bobina, Hamega,… Thực tế cho thấy việc kiểm tra, kiểm soát các chế phẩm này đòi hỏi phải được thực hiện chặt chẽ hơn, đặc biệt là việc kiểm tra chất lượng vì đó là yếu tố chính quyết định hiệu quả điều trị của thuốc Tuy nhiên, tiêu chuẩn cơ sở của đa số các sản phẩm này mới chỉ được đánh giá trên các tiêu chí về hình thức, đồng đều khối lượng, độ rã, định tính dược liệu,…mà hầu như chưa có tiêu chuẩn về định tính, định lượng hoạt chất chính Trong đó, định lượng các thành phần, đặc biệt là phyllanthin có thể là một tiêu chí giúp cho việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, thành phẩm hay giúp cho việc nghiên cứu dược động học của thuốc nhằm nâng cao chất lượng của các sản phẩm lưu hành

Để góp phần vào công tác kiểm tra, giám sát chất lượng của các chế phẩm có

nguồn gốc từ dược liệu, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu định lượng

phyllanthin trong Diệp hạ châu và các sản phẩm có chứa Diệp hạ châu" với

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU

1.1.1 Đặc điểm thực vật [3],[4],[5],[20],[26],[27],[28],[31],[70]

Cho đến nay, người ta đã phát hiện chi Phyllanthus L (Euphorbiaceae) có 700

loài Ở Việt Nam có 44 loài, trong đó các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là

Phyllanthus urinaria L (Chó đẻ răng cưa hay Diệp hạ châu ngọt) và Phyllanthus

amarus Schum et Thonn (Chó đẻ đắng hay Diệp hạ châu đắng)

Diệp hạ châu là tên chung của 2 loài cây thuộc chi Phyllanthus L

(Euphorbiaceae)

1.1.1.1 Diệp hạ châu ngọt (Chó đẻ răng cưa)

Tên khoa học: Phyllanthus urinaria L

Tên đồng nghĩa: Phyllanthus cantoniensis Hornem

Tên khác: Chó đẻ răng cưa, chó đẻ thân đỏ, diệp hòe thái, diệp hạ châu ngọt, lão nha châu, cam kiềm, rút đất, khao ham (Tày) [5],[31]

Tên nước ngoài: prak phle (Campuchia), herbe du chagrin, petit tamarin rouge, surette (Pháp) [27]

Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Mô tả cây

Diệp hạ châu là một loại cây cỏ mọc hàng năm, cao chừng 30 cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành, thường có màu đỏ Lá mọc so le, phiến lá thuôn, dài 5-15 mm, rộng 2-5 mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên nhưng như hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới màu lơ xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn Hoa mọc ở kẽ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính,hoa đực, hoa cái cùng gốc, ở đầu cành, cái ở dưới Hoa không cuống hoặc có cuống rất ngắn

Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, có khía mờ và có gai

Đường kính quả có thể đạt tới 2

Tên khoa học: Phyllanthus amarus Schum et Thonn

Tên khác: Chó đẻ đắng, chó đẻ thân xanh

Họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Mô tả cây

Diệp hạ châu là cây thảo, ít phân

cành, cao 10-40 cm, màu lục Lá

mọc so le, xếp hai dãy đều trên cành

trông như một lá kép lông chim, gốc

tròn, đầu tù hơi nhọn, hai mặt nhẵn,

mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới

mông mốc

Hoa đơn tính, mọc ở kẽ lá, không có

cánh hoa, màu lục nhạt; hoa đực có

cuống ngắn, xếp ở dưới hoa cái, hoa

cái có cuống dài

Hình 1.2: Diệp hạ châu đắng

(Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)

Quả nang, hình cầu, nhẵn, hơi dẹt, chia thành 3 mảnh vỏ, mỗi mảnh có 2 van chứa 2 hạt Hạt hình tam giác, đường kính 1 mm, có cạnh dọc và vằn ngang Mùa hoa: tháng 4-6, mùa quả: 7-9

1.1.2 Phân bố

Ở Việt Nam, cây Diệp hạ châu mọc hoang ở khắp nơi trừ vùng núi cao lạnh, thường thấy cây mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước: Thái Nguyên, Bắc Ninh, Nghệ An, Hà Giang

Diệp hạ châu là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng khi còn nhỏ hoặc mọc xen lẫn với các cây khác Trong tự nhiên, cây thường mọc trên đất ẩm ở ven đồi, trên nương rẫy, bãi hoang hay ven đường đi và quanh làng bản, ở cả miền núi lẫn trung du và đồng bằng

Để chủ động về nguồn nguyên liệu làm thuốc, ngay từ năm 2000, Trung tâm Bảo tồn và phát triển Dược liệu Miền Trung đã nghiên cứu và hướng dẫn bà con nông dân tỉnh Phú Yên trồng cây thuốc này trên đất pha cát và đất bạc màu gò đồi ở vùng ven biển, góp phần mang lại một nguồn thu đáng kể cho bà con nông dân ở đây [10]

Trên thế giới, cây có ở khắp các nước vùng nhiệt đới châu Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Philippin, Thái Lan, Campuchia, Lào, Nam Trung Quốc Ngoài ra, còn thấy có ở: Cu Ba, Nigeria, Guam, Peru và một số nước Nam

Mỹ khác

1.1.3 Thu hái và chế biến

Người ta dùng toàn cây thu hái về làm thuốc Mùa thu hái quanh năm nhưng tốt

nhất là vào mùa hạ Thường dùng cây tươi, cũng có khi phơi hoặc đem sấy khô

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được phơi 2-3 nắng hoặc đem sấy có

thể rũ lấy lá khô Dược liệu khô là lá vẫn còn màu xanh và không lẫn tạp chất

Về đóng gói [10], có thể dùng máy ép, ép từ 30-50 kg/khối, đóng trong bao nilon, phủ bao tải bên ngoài để xuất khẩu hoặc cung cấp cho nhà máy dược

phẩm Cũng có thể đóng gói dạng nhỏ, 250 g trong túi rút chân không để cung cấp cho các cơ sở sử dụng bán lẻ Ngoài ra, còn có thể đóng dạng bột chiết xuất dạng túi 1 kg và đặt trong bao nhôm để cung cấp nguồn nguyên liệu chế tạo thuốc cho các nhà máy dược phẩm

β-Chất β-sitosterol cũng được phân lập từ dịch chiết n-hexan của loài Phyllanthus

niruri L ở tỉnh Bắc Ninh của nước ta [22]

- Các acid hữu cơ như: Acid succinic, acid ferulic, acid dotriancontanic, acid hecxacosanoic, acid amariinic [24],[27],[36],[47],[63],[67]

- Các tanin: Acid elagic; acid 3, 3’, 4-tri-0-methylelagic; acid galic

- Các flavonoid: Kaempferol, quercetin, rutin

- Một số đại diện của lignan:[13],[17],[21],[42]

Phyllanthin C24H34O6; hypophyllanthin C24H30O7 (r-1-(3,4-dimethoxyphenyl) -6- methoxy-t-2,c-3-bimethaxymethyl-7,8-methylene dioxy-1,2,3,4 tetra hydro naphthallene); niranthin C24H32O7 ((+)3,4,3′,4′,9,9′-hexamethoxy-8:8′-butyrolignan); nirtetralin C24H30O7 và phylteralin C24H34O6 [5],[33]

Từ loài Phyllanthus urinaria L đã phân lập được 4 lignan mới là

5-demethoxyniranthin (C23H30O6), urinatetralin (C22H24O6), dextrobursehernin (C21H22O6), urinaligran (C22H24O7), cùng với 9 lignan đã biết là: phyllanthin, niranthin, phyltetralin, hypophyllanthin, nitetralin, lintetralin, isolintetralin, heliobuphthalminlactone và virgatusin [37]

Niranthin

Hình 1.3: Công thức cấu tạo một số chất hóa học có trong cây Diệp hạ châu

- Từ dịch chiết aceton của loài Phyllanthus urinaria L các nhà khoa học của Đài

Loan đã tách được các hợp chất sau [5],[38],[54],[60],[67]: Phyllanthin, phyltetralin, trimetyl-3,4-dehydrochebulate, metylgallat, rhamnocitrin, methyl brevifolin carboxylat, β-sitosterol-3-O-β-d-glucopyranosid, quercitrin và rutin

Trong đó cấu trúc của các hợp chất trimetyl-3,4-dehydrochebulate và methyl brevifolin carboxylat đã được xác minh bằng phương pháp phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ Ngoài ra còn có geraniin; 1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose; 4-O-brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranose; methyl brevifolincarboxylate

- Cây Phyllanthus amarus Schum et Thonn., lá chứa một chất đắng là

phyllanthin; không có quinin hoặc một alcaloid khác [48] Lá khô chứa những chất đắng hypophyllanthin (0,05%) và phyllanthin (0,5%) có độc với cá và ếch Trong cây có niranthin, nirtetralin và phylteralin Ngoài ra, còn có lignan, flavonoid, hợp chất phenolic, alcaloid kiểu securinin như: Niruroidin, isobubialin, epibuealin, quercetin, quercitrin, isoquercitrin, astragalin, rutin; các acid hữu cơ như: Acid oleanolic, acid ursolic, acid ascorbic, acid geraniinic B, acid amariinic và repandusinic A [27],[41]

- Tác dụng hạ huyết áp và tác dụng trên hệ thống tim mạch [44],[57]

- Tác dụng kháng HIV: Dịch chiết nước và cồn của Phyllanthus amarus có khả

năng ức chế đến 50% sự tái tạo HIV-1 ở tế bào Hela CD4(+) [46],[50]

- Tác dụng điều trị ung thư: Nhiều nghiên cứu trên động vật bị ung thư gan đã thấy dịch chiết Diệp hạ châu đắng có tác dụng giảm sự cố của các khối u, ức chế hoạt động chuyển hóa của các chất gây ung thư (carcinogen) cũng như ức chế hoạt động điều hòa của tế bào ung thư và tác dụng nên sự sửa chữa DNA [53],[55]

- Tác dụng kháng khuẩn [5]

Cây Diệp hạ châu có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ

xanh, trực khuẩn E Coli, Shigella dysenteriae, S Flexneri, S Shigae, Moraxella

và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [27]

- Tác dụng bảo vệ tế bào gan, điều trị viêm gan và chống virus viêm gan B

1.1.6 Công dụng và liều dùng

Y học dân tộc của nhiều nước đã sử dụng rộng rãi các loài cây thuộc chi

Phyllanthus (Euphorbiaceae) để chữa bệnh Trong đó, được dùng làm thuốc

nhiều hơn cả là các loài: Phyllanthus urinaria L và Phyllanthus amarus Schum

et Thonm [22]

Diệp hạ châu là cây thuốc có vị ngọt, hơi đắng, tính lạnh, mát, có tác dụng sát khuẩn, tiêu viêm, giải độc, thông huyết, lợi tiểu

Nhân dân rất hay dùng cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L) làm thuốc

chữa viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, chữa sốt, đau mắt, rắn cắn Trong y học dân gian Ấn Độ, người ta dùng nước ép lá cây Chó đẻ răng cưa

(Phyllanthus urinaria L) cho vào sữa dừa dùng cho trẻ em để giúp trẻ ăn ngon

miệng Ở Đông Nam Á, cây Chó đẻ răng cưa có tác dụng như Diệp hạ châu đắng, nhưng Diệp hạ châu đắng thường được ưa dùng hơn

Một số bài thuốc dùng cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L) [5],[19],[27]:

- Nhân dân thường dùng toàn cây thu hái về làm thuốc, thường dùng tươi, cũng

có khi phơi khô, ngày uống 20-40 g cây tươi hoặc sao khô, sắc đặc, uống thay nước

- Chữa nhọt độc sưng đau: Cây Chó đẻ răng cưa 1 nắm với 1 ít muối giã nhỏ, chế nước chín vào, vắt lấy nước cốt uống, bã đắp vào chỗ đau (bách gia trân tàng)

- Chữa bị thương ứa máu: Lá cành cây Chó đẻ răng cưa và mần tưới mỗi thứ một nắm giã nhỏ, chế đồng tiện (nước tiểu trẻ em trai) vào, vắt lấy nước uống, bã đắp Hoặc hòa thêm bột đại hoàng 8-12 g thì càng tốt (hoạt nhân toát yếu)

- Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Dùng cây Diệp hạ châu sao khô 20 g, cam thảo đất sao khô 20 g Sắc nước uống hàng ngày

- Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi, rửa sạch, giã nát, đắp vết thương, vết đứt chảy máu hoặc nghiền nát, thêm nước và ít muối, gạn lấy nước uống, bã đắp chữa đinh râu, nhọt độc, sưng đau

- Chữa lở loét thối thịt không liền miệng: Lá cây Chó đẻ răng cưa, lá thồm lồm bằng nhau, đinh hương 1 nụ, giã nhỏ đắp (bách gia trân tàng)

- Chữa bệnh chàm mãn tính: Cây Chó đẻ răng cưa, vò, xát nhiều lần, làm liên tục hàng ngày sẽ khỏi

- Chữa sốt rét (triệt ngược thang): Cây Chó đẻ răng cưa 8 g , thảo quả, dây hà thủ

ô, lá mãng cầu ta tươi, thường sơn, dây gắm, mỗi vị 10 g; đinh lang (hạt cau), ô mai, dây cóc, mỗi vị 4 g Sắc với 600 ml nước còn 200 ml chia uống 2 lần trước khi lên cơn sốt rét theo giờ Nếu không hết cơn, thêm sài hồ 10 g

- Khi bị rắn cắn, lấy ngay cây Diệp hạ châu tươi nhai, nuốt lấy nước, dùng bã đắp lên vết rắn cắn

- Theo kinh nghiệm của Hội Y học Dân tộc Đà Nẵng, dùng khoảng 20 g (cả cây Diệp hạ châu) băm nhỏ trộn với 100 g gan lợn, đem nấu nhiều lần, thu lấy nước đặc, uống trong ngày để chữa viêm gan

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) được dùng trong y

học cổ truyền Thái Lan làm thuốc trị bệnh vàng da Ở Ấn Độ, Diệp hạ châu đắng dùng để sát khuẩn, lợi tiểu, chữa vàng da, lỵ, phù, đái tháo đường Ở Peru, nhân dân sắc nước phần trên mặt đất uống làm thuốc lợi tiểu, trị sỏi mật, sỏi thận Ở một số nước Nam Mỹ, Diệp hạ châu đắng dùng trị sốt rét, sỏi niệu, sỏi bàng quang, các bệnh về đường tiết niệu nói chung Ở Haiti, người dân sắc lá làm

nước uống trị sốt Từ đảo Hải nam đến Inđônesia, nhân dân dùng Diệp hạ châu

để sắc nước uống chữa bệnh về thận và gan, trị bệnh hoa liễu, đau bụng, long đờm cho trẻ em, hạ sốt, điều kinh và trị tiêu chảy…Ở Papua Niugine, nước hãm toàn cây để trị đau đầu, hoặc đau nửa đầu Ở Tanzania, cao nước phần trên mặt đất của Diệp hạ châu dùng trị đái tháo đường không phụ thuộc insulin Ở Tây

Ấn, Diệp hạ châu đắng dùng trị giun ở trẻ em, ở bờ biển Ngà người dân dùng nước sắc lá uống trong trường hợp khó sinh, trị vàng da, nôn, đau họng…[27]

Một số bài thuốc dùng cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et

Thonn) [19]:

- Chữa viêm gan do virus: Diệp hạ châu đắng sao khô 20 g, sắc nước 3 lần Trộn chung các nước sắc Thêm 50 g đường, đun sôi cho tan đường Chia làm 4 lần uống trong ngày Khi kết quả xét nghiệm HbsAg(-) thì ngừng thuốc

- Chữa xơ gan cổ chướng thể nặng: Diệp hạ châu đắng sao khô 100 g sắc nước 3 lần Trộn chung nước sắc, thêm 150 g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), dùng trong 30-40 ngày Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ)

Ngoài ra, cây Phyllanthus niruri L cùng họ còn được dùng làm thuốc thông tiểu

tiện hoặc làm thuốc thông sữa

Kiêng kỵ: Phụ nữ có thai không nên dùng

- Công thức cấu tạo

- Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (+) 3,3' - 4,4' - 9,9' hexamethoxy lignan

- Tên gọi khác: Tetra-O-methylsecoisolariciresinol; (2R, 3R)-1,4-bis (3,4 – dimethoxy phenyl)-2,3-bis (methoxy methyl) butane

1.2.2 Tác dụng sinh học của phyllanthin

- Phyllanthin, một lignan từng được phân lập từ các loài Phyllanthus, có tác dụng

bảo vệ gan và chống virus [43],[59]

- Phyllanthin đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào bằng CCl4 và D-GalN/TNF [7],[16],[22]

- Các nghiên cứu cho thấy phyllanthin trong Diệp hạ châu có tác dụng làm gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan Phyllanthin cũng nhanh chóng làm giảm men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B Vì vậy Diệp hạ châu có tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm mỡ, xơ gan, giải độc gan do uống bia, rượu, …

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ CÂY DIỆP HẠ CHÂU VÀ PHYLLANTHIN TRONG CÂY DIỆP HẠ CHÂU

1.3.1 Ở nước ngoài

Đã có nhiều nghiên cứu của nước ngoài về mặt hóa học cũng như tác dụng chữa

bệnh gan của các loài Phyllanthus:

- Tác dụng chống virus: Trên các bệnh nhân mang virus viêm gan B, Phyllanthus

amarus đã làm giảm các kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B [62] Dịch chiết nước của cây có khả năng ức chế men tổng hợp DNA nội sinh của virus viêm gan B và gắn vào bề mặt kháng nguyên của virus trong ống nghiệm [65] Ở mức

độ tế bào, dịch chiết nước của Phyllanthus amarus có tác dụng ức chế HBsAg trong 48 h trên các tế bào ung thư gan ở nồng độ 1 mg/ml [40]

- Tác dụng chống độc gan: Bột Phyllanthus amarus có khả năng khôi phục lại

bình thường các mức cholesterol, triglyceride và phospholipids ở các con chuột

bị gây ngộ độc gan bằng rượu Các thông số men gan như AST, ALT cũng trở lại bình thường Nghiên cứu trên chuột bị gây độc bằng CCl4 cũng cho kết quả tương tự [69] Trên các tế bào gan chuột nuôi cấy bị gây độc bằng CCl4 hay

galactosamine, dịch chiết n-hexan của cây Phyllanthus niruri và các chất phân

lập được từ dịch chiết này là phyllanthin, hyphophyllanthin và triacontanal có tác dụng bảo vệ tế bào rất tốt [59]

- Giúp cơ thể người dùng sản xuất ra kháng thể chống HbsAg [33], Diệp hạ châu được ứng dụng để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HbsAg (+) Năm 1988 (Lancet Oct.1.1988) Blumberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37

bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng B bằng Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus

amarus) với liều hàng ngày 200 mg cao toàn cây Diệp hạ châu đắng (loại bỏ rễ) trong 30 ngày Kết quả 22/37 (59%) bệnh nhân được điều trị đã mất kháng nguyên bề mặt của viêm gan B khi làm xét nghiệm ở 15-20 ngày sau khi kết thúc điều trị, so với tỷ lệ 1/23 (4%) bệnh nhân đối chứng dùng placebo có hiện tượng

này Một số đối tượng được theo dõi 9 tháng, không có trường hợp nào kháng nguyên bề mặt xuất hiện trở lại Không thấy có hoặc chỉ có ít tác dụng độc Tuy vậy, hiệu quả của Diệp hạ châu đắng trong điều trị những người mang virus viêm gan B không thật rõ ràng, có cả những trường hợp thành công và thất bại được

báo cáo [27] Các tác giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm

ức chế lên men polymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [5]

- Các cây thuộc loài Phyllanthus có một vài lignan, flavonoid và tanin thủy phân

có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HbsAg, ức chế mạnh HIV trancriptase ngược [13],[45]

Ngoài ra, đã có một số nghiên cứu của nước ngoài thực hiện định tính và định lượng phyllanthin trong cây Diệp hạ châu:

- Định tính và định lượng phyllanthin bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với điều kiện tiến hành như sau:

 Điều kiện 1 [30],[34],[64],[69]

+ Bản mỏng Silicagel GF254

+ Dung môi khai triển là n-hexan : ethyl acetat (2:1)

+ Dung dịch đối chiếu là phyllanthin trong MeOH 0,5 mg/ml

+ Dung dịch thử tương ứng 5 g bột Diệp hạ châu trong 10 ml MeOH

+ Thể tích chấm 10 µl, hiện màu bằng H2SO4 10%

 Điều kiện 2 [56]:

+ Bản mỏng Silicagel GF254

+ Dung môi khai triển là n-hexan : acetone : 1,4 dioxane (9:1:0,5)

- Định tính và định lượng phyllanthin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện tiến hành như sau:

 Chương trình sắc ký 1 [69]:

+ Máy sắc ký Shimadzu, detector DAD

+ Cột E-Merck Nitrile (250 mm x 4 mm)

+ Pha động: đệm phosphate pH 2,8 - ACN (83:17)

- Trên thế giới, hàm lượng phyllanthin trong cây Phyllanthus amarus theo một

tài liệu của Ấn Độ là khoảng 0,5% [12],[69]

1.3.2 Ở Việt Nam

Từ năm 1961 đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về cây Diệp hạ châu

và phyllanthin trong cây Diệp hạ châu ở trong nước như sau:

- Năm 1961, Phòng Đông y - Viện vi trùng Việt Nam nghiên cứu tác dụng kháng sinh của Chó đẻ răng cưa thấy kết quả kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5), Typhi (0,9), Flexneri (1,1), Sonnei (0), Shiga (1), Subtilis (0,4), Coli (0) cm [5]

- Năm 1977, một nhóm bác sỹ Việt Nam, thuộc khoa Tiêu hóa, Gan, Mật đã sử dụng bài thuốc gia truyền của lương y Trần Xuân Thiện gồm 3 vị là Diệp hạ châu đắng, Xuyên tâm liên, quả Dành dành để điều trị cho những người có kết quả xét nghiệm HbsAg(+) Sau một thời gian điều trị, kết quả xét nghiệm âm tính được coi là khỏi đạt tỷ lệ 26/98 bệnh nhân Ngoài ra, thuốc còn giúp cơ thể người dùng sản xuất kháng thể chống HbsAg (59/98 bệnh nhân) Một đợt điều trị trung bình kéo dài 4-5 tháng [33]

- Những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài Phyllanthus

đã phát hiện thấy thành phần của các cây này có một vài lignan, flavonoid và

tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HbsAg, ức chế mạnh HIV trancriptase ngược [13],[19],[45]

- Các thí nghiệm in vitro của cây Diệp hạ châu với kháng nguyên HbsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorid (CCl4) gây nên đã chứng minh cây Diệp hạ châu có khả năng chống virus viêm gan B Cây Diệp hạ châu có tác dụng kháng

khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn E Coli, Shigella

dysenteriae, S Flexneri, S Shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus

fumigatus [27]

- Viện dược liệu đã chiết xuất từ cây Phyllanthus amarus thuốc bột Dihacharin

để chế tạo ra viên nang Dihacharin và Bệnh viện Quân y 103 đã thử lâm sàng tác dụng chữa bệnh viêm gan B mạn tính có kết quả tốt Để có cơ sở về độ an toàn của của bột Dihacharin, nhóm nghiên cứu gồm Nguyễn Kim Phượng, Đỗ Trung Đàm, Đỗ Thị Phương, Nguyễn thượng Dong đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và ảnh hưởng của bột này trên trạng thái chung và chỉ

số huyết học ở thỏ Kết quả của nghiên cứu đã được đăng trên Tạp chí Dược học

số 380 (2007) cho thấy: ở liều bột Dihacharin 70 g/kg (tính ra dược liệu khô là

1000 g/kg), cho uống một lần, chuột vẫn không chết, chứng tỏ thuốc có độc tính cấp thấp Thử trên thỏ với liều 0,7 g/kg (tính ra dược liệu khô là 10 g/kg), Dihacharin không có ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến thể trạng chung, cân nặng và một số thông số huyết học như hồng cầu, bạch cầu, huyết sắc tố [14]

- Công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đậu và Trần Thị Thu Hà, Khoa Hóa học - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội, đăng trên Tạp chí Dược học năm 2007 đã trình bày nghiên cứu của các tác giả về hóa học thực

vật của cây Chó đẻ (Phyllanthus niruri L.) mọc ở Bắc Ninh theo định hướng

phân lập các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan Từ phần dịch chiết n-hexan đã phân lập được β-sitosterol, phyllanthin và hypophyllanthin; từ phần dịch chiết ethylacetat đã thu được hai hợp chất là 2,4,6-cyclohepta-tri-en-

2,3,7-tri-hydroxy-5-ethoxy-1-on và 5,7,8-trihydroxy-9,10-peoxi-4-ethoxy benzo[2,3-d] coumarin [22]

- Luận văn Thạc sỹ hóa học của học viên Ngô Đức Trọng dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Văn Thỉnh với đề tài “Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số

nhóm chất có trong cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.,

Euphorbiaceae)” bảo vệ năm 2008 [13] Luận văn đã thực hiện:

+ Nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật và thiết lập quy trình ngâm chiết mẫu đối với

cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) mọc hoang tại Thái Nguyên

+ Phân tích định tính khẳng định trong cây Chó đẻ răng cưa có những lớp chất: Đường khử, alkaloid, steroid, flavonoid, polyphenol, cumarin và saponin

+ Phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 4 hợp chất là: β-sitosterol, hydroxymethylfufural, acid gallic và kaempherol

5-+ Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết tổng của cây Chó đẻ răng cưa

(Phyllanthus urinaria L.) cho thấy có tác dụng kháng các khuẩn Staphylococcus

aureus (Tụ cầu vàng), E Coli (Trực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi

- Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học Khóa 59 của sinh viên Lê Quân do PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS Trần Văn Ơn hướng dẫn với đề tài

“Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của các loài mang tên ‘Chó đẻ’ thuộc chi

Phyllanthus L tại Việt Nam” bảo vệ năm 2009 [8] Đề tài thực hiện nghiên cứu

trên 10 mẫu mang tên “Chó đẻ” thuộc 2 loài Phyllanthus amarus Schum et Thorn (6 mẫu) và Phyllanthus urinaria L (4 mẫu) Kết quả nghiên cứu cho thấy

rằng loài Phyllanthus amarus không có sự biến đổi hình thái theo mùa, còn loài

Phyllanthus urinaria có sự biến đổi về màu sắc thân, cành, quả Về kết quả định

lượng sơ bộ, 06 mẫu thuộc loài Phyllanthus amarus có hàm lượng phyllanthin

trong khoảng 0,52% - 0,89% và hypophyllanthin khoảng 0,12% - 18%; 04 mẫu

thuộc loài Phyllanthus urinaria không có phyllanthin Điều này khác với một số công bố trước đó cho rằng loài Phyllanthus urinaria có cả hai hợp chất

phyllanthin và hypophyllanthin [27],[32],[39],[68]

- Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học Khóa 59 của sinh viên Trần Thị Mai Hương do GS.TS Nguyễn Xuân Thắng và Ths Nguyễn Thị Phương Lân hướng dẫn với đề tài “Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết hai loài

Diệp hạ châu: Phyllanthus amarus Schum et Thonn và Phyllanthus urinaria L

trên chuột nhắt trắng” bảo vệ năm 2009 [25] Đề tài đã đưa ra được những kết luận sau:

+ Dịch chiết Phyllanthus amarus (10 g/kg) và dịch chiết Phyllanthus urinaria

(10 g/kg) có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột bình thường; đồng thời cả hai loại dịch chiết này cũng có tác dụng hạn chế tăng glucose huyết trên chuột uống glucose (5 g/kg), chuột tiêm adrenalin (0,6 g/kg) và chuột tiêm STZ (150 mg/kg)

+ Dịch chiết Phyllanthus amarus có sự phụ thuộc tỷ lệ thuận giữa liều lượng và

tác dụng hạn chế tăng glucose huyết trên chuột tiêm adrenalin Liều thích hợp

của dịch chiết Phyllanthus amarus là 15 g/kg thể trọng Còn dịch chiết

Phyllanthus urinaria không có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng và tác

dụng hạ glucose huyết Liều thích hợp của dịch chiết Phyllanthus urinaria là

5g/kg thể trọng

- Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học Khóa 59 của sinh viên Phạm Hương Quỳnh do GS.TS Nguyễn Xuân Thắng và Ths Nguyễn Thị Phương Lân hướng dẫn với đề tài “Nghiên cứu độc tính cấp và khả năng ức chế hoạt tính alpha

amylase nước bọt người của dịch chiết Diệp hạ châu xanh (Phyllanthus amarus

Schum et Thonn., Euphorbiaceae” bảo vệ năm 2009 [23] Đề tài đã khẳng định

dịch chiết toàn phần của cây Phyllanthus amarus có tác dụng ức chế hoạt tính

enzym alpha amylase trong khoảng nồng độ 0,01% - 0,08% Nghiên cứu chưa xác định được LD50 của dịch chiết Phyllanthus amarus, chuột uống đến liều

480g/kg chưa thể hiện độc tính cấp

- Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế một số hợp chất tự nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu” do PGS.TS Trịnh Văn Lẩu làm chủ nhiệm đề tài (mã số đề tài: KC.10.16/06-10), thời gian thực hiện đề tài từ năm 2008 đến năm 2010 Kết quả

mà đề tài đạt được là [30]:

+ Xây dựng được quy trình chiết tách và tinh chế 10 chất chuẩn từ dược liệu

(acid Chlorogenic từ Kim Ngân Hoa, Conessin từ Mực Hoa Trắng, Holothurin B

từ Hải Sâm, Kaempferol từ Đơn Lá Đỏ, Linarin từ Cúc Hoa, Malloapelta B từ Bùm Bụp, Myricetin từ Chè Dây, Nuciferin từ Lá Sen, Phyllanthin từ Diệp hạ châu đắng, Silybin từ Cúc Gai)

+ Xây dựng được 10 bộ dữ liệu phân tích cấu trúc, nhận dạng và đánh giá độ tinh khiết các hợp chất làm chuẩn trên

+ Có được 10 chất chuẩn sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu

- Đề tài nhánh của đề tài KC.10.16/06-10, đề tài khoa học cấp Bộ, tên đề tài nhánh “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế phyllanthin từ cây Diệp hạ châu đắng làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu” mã số đề tài KC.10.16.09/06-10

do TS Lê Việt Dũng làm chủ nhiệm đề tài hoàn thành năm 2009 Đề tài đã xây dựng được phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế phyllanthin từ cây Diệp

hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) để làm chất chuẩn phục vụ cho kiểm nghiệm

dược liệu [11],[12]

- Vì phyllanthin bắt đầu được chiết xuất để thiết lập chất chuẩn và dùng làm thuốc nhưng trong các Dược điển hiện chưa có chuyên luận về phyllanthin nên

nhóm tác giả gồm Lê Thị Thu, Lê Quang Thảo, Nguyễn Thị Kim Thanh, Trịnh

Văn Lẩu đã thực hiện nghiên cứu “Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng phyllanthin trong nguyên liệu” năm 2010 Nghiên cứu đã xây dựng

được phương pháp HPLC để định lượng phyllanthin trong mẫu nguyên liệu với điều kiện sắc ký như sau:

Pha động: ACN-H2O (65:35); cột C18 Purospher STAR (150 x 4,6 mm; 5 µm); tốc độ dòng 1 ml/phút; bước sóng phát hiện 230 nm [9]

1.4 TỔNG QUAN VỀ HPLC

1.4.1 Khái niệm cơ bản về HPLC [1],[2],[15],[29]

HPLC là phương pháp hóa lý dùng để tách, định tính, định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn nhau: Pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi bên trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Mẫu thử và dung môi pha động được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng với 2 pha

và dẫn tới sự tách các chất, sự tách các chất này đạt được là do quá trình phân

bố, hấp thu hoặc trao đổi ion Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector (tử ngoại, huỳnh quang, chỉ số khúc xạ…) Các tín hiệu được truyền qua bộ phận xử lý kết quả và được ghi hoặc hiển thị trên màn hình Đường cong rửa giải sau một quá trình gọi là sắc ký đồ

1.4.2 Các thành phần của hệ thống HPLC [1],[2],[15],[29]

Các bộ phận cơ bản của máy HPLC gồm: Bình chứa pha động, bơm cao áp, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích (có thể được đặt trong bộ phận điều nhiệt), detector (bộ phận phát hiện), bộ phận thu nhận và xử lý số liệu…

Pha tĩnh (Stationary phase)

Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột, hay còn gọi là chất mang Trong HPLC, pha tĩnh thông dụng nhất là silicagel dưới dạng hình cầu Hiện nay, các vi

tiểu phân có kích thước 3 µm ÷ 10 µm, diện tích bề mặt riêng 50 m2/g ÷ 500

m2/g là vật liệu được dùng nhiều nhất để nhồi cột phân tích Với loại vật liệu này, kỹ thuật nhồi khô không thích hợp mà phải nhồi cột ướt với dung môi thích hợp dưới áp suất tương đối cao

Yêu cầu đối với pha tĩnh là phải trơ với pha động và chất phân tích; bền vững

với các điều kiện của quá trình sắc ký; các hạt có kích thước tương đối và đồng nhất; có khả năng tách chọn lọc 1 hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc

ký nhất định; cân bằng động học xảy ra nhanh, lặp lại tốt; tính chất bề mặt ổn định

Pha tĩnh được chế tạo trên nền các chất sau: Pha tĩnh trên nền silicagel, pha tĩnh trên nền oxyd nhôm, pha tĩnh trên nền mạch carbon Trong 3 loại trên, pha tĩnh

trền silicagel có nhiều ưu điểm hơn cả và thường được sử dụng

Pha tĩnh trên nền silicagel:

- Silicagel trung tính: dùng trong sắc ký pha thuận

Ví dụ: Lichrosorb Si 40, Lichrosorb 60, Hypersil, Micropack-Si…

- Silicagel đã alkyl hóa: Dùng cho sắc ký pha đảo để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực ít có khả năng tạo cặp ion Các nhóm OH hoạt động trên bề mặt đã bị alkyl hóa, vì vậy nó không còn phân cực hoặc rất ít phân cực Ví dụ: Hypersil ODS, Lichrosorb RP18, Lichrosorb RP8…

Pha động là các chất hữu cơ phân cực: MeOH, ACN, nước hoặc hỗn hợp các chất trên Sự tách của các chất nhồi cột loại này có độ lặp lại cao nên được ứng dụng nhiều hơn loại silicagel trung tính

- Silicagel đã được sulfonic hóa, nitro hóa hoặc amin hóa: dùng cho sắc ký trao đổi ion

Pha động

- Pha động trong HPLC là dung môi được cho chảy qua cột một cách liên tục Pha động có thể là một hay một hỗn hợp các dung môi khác nhau trộn theo tỷ lệ

nhất định hoặc có thể là dung dịch muối có chứa các chứa các chất đệm, chất tạo phức

- Yêu cầu đối với pha động: Trơ đối với pha tĩnh; hòa tan được các chất phân tích; bền theo thời gian, càng bền lâu càng tốt, ít nhất là trong thời gian chạy sắc ký; có độ tinh khiết cao: hóa chất loại PA, dung môi tinh khiết loại dùng cho HPLC; phù hợp với loại detecter sử dụng; nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký; sẵn có và kinh tế, cho phép thu hồi lại mẫu hay các chất phân tích; an toàn,

càng ít cháy nổ, ít độc càng tốt

- Trong sắc ký phân bố pha đảo: Pha động là các dung môi phân cực, hay dùng là ACN, MeOH, THF Pha động thường là hỗn hợp ACN và nước vì nó có độ nhớt thấp nên có thể sắc ký ở áp suất thấp Có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách cho thêm vào những tỷ lệ nước nhất định Ngoài ra, trong một số trường hợp còn cho thêm chất tạo cặp ion dể sử dụng trong sắc ký cặp ion, chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký…

Detector

Đây là một trong những bộ phận quan trọng nhất của máy HPLC Việc chọn detector để sử dụng dựa vào đặc tính lý hóa của chất phân tích Hiện nay, các loại detector hay được sử dụng bao gồm: detector UV-VIS, detector huỳnh quang, detector điện hóa, detector khối phổ, detector tán xạ bay hơi,

1.4.3 Một số đại lượng đặc trưng trong HPLC

Thời gian lưu t R (Retention time): Thời gian lưu của một chất là thời gian cần

thiết để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký tới detector và cho píc trên sắc ký đồ (tính từ khi tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của píc trên sắc ký đồ) tR = t0 + t’R hoặc tR = t0 (1+k’)

k’: hệ số dung lượng

t0: thời gian lưu của 1 chất tan không bị lưu giữ

(Thời gian cần thiết để pha động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu)

tR: Thời gian lưu của một chất

t’R: Thời gian lưu hiệu chỉnh

- Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: bản chất chất tan; bản chất, tốc độ pha động; bản chất pha tĩnh và trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH của pha động

- Trong 1 phép phân tích, nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém Còn nếu tR quá lớn (tR>20 phút) thì píc bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích kéo dài

Hệ số dung lượng k ’ (Capacity factor): Hệ số dung lượng cho biết khả năng

phân bố của chất đó trong 2 pha

0 1

R

t

t −

QS, QM : lượng chất tan trong pha tĩnh và pha động

VS, QM : thể tích của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Nếu k’ quá nhỏ thì quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, chất cần tách bị rửa giải

ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu Do vậy khả năng tách không tốt Nếu k’quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài (tR lớn), đỉnh píc giãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp Hai chất có thể tách ra khỏi nhau nếu chúng có k’ khác nhau Trị số tối ưu: 1 ≤ k’ ≤8

Độ chọn lọc α (Selectivity factor)

Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, thể hiện mức độ tách Theo quy ước, chất B lưu giữ mạnh hơn chất A , vì vậy α luôn lớn hơn 1, α càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ

'

0 '

0

B

A

R B

t t k

α càng khác 1 nhiều thì khả năng tách càng rõ, tối ưu là 1,05 ≤ α≤ 2,0 Nếu α quá lớn thì thời gian phân tích dài

Hiệu lực cột (Colum efficiency): Hiệu lực của cột là thông số về hiệu suất phân

tích của cột, được biểu thị bởi đại lượng quan trọng nhất là số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Cột có N lớn là cột có hiệu lực cao Thực tế N nằm trong khoảng 2500-5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

Số đĩa lý thuyết được tính toán dựa theo công thức:

Độ phân giải R S (Resolution)

Là đại lượng biểu thị mức độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho

Độ phân giải của 2 píc cạnh nhau được tính theo công thức:

R R S

−

=

+

Thực tế nếu các píc cân đối thì độ phân giải để 2 píc tách tối thiểu là RS = 1 Trong phép định lượng, RS= 1,5 là phù hợp Nếu RS lớn thì thời gian phân tích kéo dài, tốn nhiều pha động, độ nhạy kém Nếu RS nhỏ thì các píc chưa tách hẳn, việc tính diện tích píc không chính xác

Rs = 0,75: Hai píc tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

Rs = 1 : Hai píc tách khá tốt, còn xen phủ 4%

Rs = 1,5 : Hai píc tách hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

1.4.4 Các phương pháp định lượng

1.4.4.1 Nguyên tắc định lượng trong phân tích HPLC

Do có mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ của chất phân tích với diện tích hoặc chiều cao píc của nó, vì vậy có thể định lượng các chất dựa vào sự so sánh chiều cao hoặc diện tích píc của chất cần xác định với mẫu chuẩn đã biết trước

nồng độ

Dựa vào diện tích píc: Phương pháp này hay được sử dụng nhất vì luôn có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất với diện tích píc của chất đó Không áp dụng phương pháp này trong trường hợp píc quá cao, đường nền nhiễu hoặc píc

bị doãng, không đối xứng…

Dựa vào chiếu cao píc: Áp dụng khi píc có dạng không đổi, thì nồng độ chất tuyến tính với chiều cao píc, vì vậy nếu không tính theo diện tích píc thì có thể tính theo chiều cao píc

1.4.4.2 Một số phương pháp định lượng cơ bản

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong DĐVN IV hoặc đạt tiêu chuẩn tinh khiết sắc ký bao gồm:

- Dung môi: Acetonitril, methanol dùng cho HPLC (Merck)

- Hóa chất: Kali dihydrophosphat (KH2PO4); acid phosphoric (H3PO4); nước cất

- Chất chuẩn đối chiếu hóa học phyllanthin lọ 20 mg, SKS: KC.10.16-04.09,

hàm lượng 99,97% C24H34O6 tính theo chế phẩm nguyên trạng công bố trên phiếu kiểm nghiệm (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Máy HPLC: MERCK - HITACHI với detector DAD

- Cột sắc ký: Cột Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)

- Cân phân tích METTLER TOLEDO AB204 (Thụy Sĩ), SARTORIUS-CP224S

- Máy đo pH; máy lắc siêu âm Emasonic S100; bộ dụng cụ đun hồi lưu cách thủy

và các dụng cụ thủy tinh chính xác (bình định mức, pipet,…)

2.2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

 Dược liệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) do Viện

Dược liệu cung cấp

 Các sản phẩm có chứa Diệp hạ châu:

- Diệp hạ châu V (Công ty TNHH Vạn Xuân)

+ Số đăng ký: V1616_H12_10 + Số lô: 051210

+ Dạng bào chế: Viên nang + NSX: 13.12.2010, HD: 23.12.2012

Thành phần 1 viên: Mỗi viên nang 0,45 g được chế từ :

Lá khô Diệp hạ châu: 0,20 g

Cao khô Diệp hạ châu toàn cây: 0,25 g

- Diệp hạ châu (Công ty cổ phần dược DANAPHA)

+ Số đăng ký: VD-10924-10 + Số lô: 020111

+ Dạng bào chế: Viên nén bao đường + NSX: 100111, HD: 100114

Thành phần 1 viên: Diệp hạ châu 250 mg (tương đương 36,4 mg cao khô)

Tá dược vừa đủ 1 viên

- Bobina (Công ty TNHH Dược thảo Phúc Vinh)

+ Số đăng ký: VD-0741-06 + Số lô: 020910,

+ Dạng bào chế: Viên bao đường + NSX: 160910, HD: 150912

Thành phần cho 1 viên: Cao Bobina 175 mg tương đương với 1750 mg dược

liệu, trong đó:

Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi Urinariae): 1000 mg

Bồ bồ (Herba Adenosmatis indiani): 500 mg

Rau má (Herba Centella asiaticae): 250 mg

Tá dược vừa đủ 1 viên

- Hamega (Công ty TNHH Nam Dược - Việt Nam)

+ Số đăng ký: 680/2010/YT-CNTC + Số lô: 0021

+ NSX: 160211, HD: 180214 (mẫu H1) + Dạng bào chế: Viên nang + Số lô: 0061

+ NSX: 200511, HD: 200514 (mẫu H2)

Thành phần 1 viên: Diệp hạ châu đắng 2,0 g

Vọng cách 0,3 g

Nhân trần 0,2 g

Phụ liệu vừa đủ 1 viên

- LIVSIN-94 (Công ty cổ phần dược phẩm Hà Tây)

+ Số đăng ký: VD-6245-08 + Số lô: 670810

+ Dạng bào chế: Viên nén bao phim + NSX: 260810, HD: 260812

Thành phần 1 viên:

Cao đặc tổng hợp: 200 mg

(Tương ứng với Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi Urinariae) 1500 mg; Cỏ Nhọ Nồi (Herba Ecliptae) 250 mg; Chua Ngút (Fructus Embeliae) 250 mg)

Tá dược vừa đủ 1 viên

- Bình Can ACP (Xí nghiệp dược phẩm Á Châu – công ty TNHH)

Tá dược vừa đủ 1 viên

- Diệp hạ châu TW3 (Công ty cổ phần dược phẩm TW3)

+ Số đăng ký: V1088-H12-10 + Số lô: 0210

+ Dạng bào chế: Viên nang + NSX: 281210, HD:281213

Thành phần 1 viên:

Diệp hạ châu (Herba Phyllanthi Urinariae): 6,3 g

(Tương đương 450 mg cao)

Tá dược vừa đủ 1 viên

(Lactose, tinh bột sắn, Talc, magnesi carbonat, magnesi stearat)

- LIVBILNIC (Công ty cổ phần dược phẩm Traphaco)

+ Số đăng ký: VD-3548-07 + Số lô: 01

+ NSX: 020411, HD: 020413 (mẫu LIV1) + Dạng bào chế: Viên nén bao phim + Số lô: 04

+ NSX: 050110, HD: 050112 (mẫu LIV2)

Thành phần 1 viên:

Cao đặc Diệp hạ châu đắng (Extractum Phyllanthi): 0,25 g

(Tương đương 2,0 g Diệp hạ châu đắng)

Tá dược (Tinh bột, Lactose, Magnesi stearat, Talc, HPMC, PEG 6000, Titan Dioxyt, Xanh Patente) vừa đủ 1 viên

2.2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Xử lý mẫu

Lựa chọn dung môi thích hợp để hòa tan chất chuẩn và các mẫu nghiên cứu tạo

ra các dung dịch nghiên cứu có nồng độ thích hợp

Phyllanthin là chất bột màu trắng, ở dạng phân tử hầu như không phân cực, có phân tử lượng 418,53 đvC Phyllanthin ít tan trong nước, tan tốt trong methanol, ethylacetate, chloroform và tan một phần trong n-hexan…

Dựa vào đặc điểm tính chất vật lý của phyllanthin và hóa chất sẵn có của phòng

thí nghiệm chúng tôi đã lựa chọn MeOH làm dung môi pha mẫu

 Chuẩn bị mẫu chuẩn

- Chuẩn gốc CA: Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn phyllanthin hòa tan trong bình định mức 10,0 ml bằng dung môi MeOH cho tới vừa đủ

- Dãy các dung dịch chuẩn phyllanthin (dãy chuẩn S1): Hút dung dịch chuẩn gốc

CA pha trong vừa đủ methanol theo bảng 2.1 để có dãy chuẩn S1 Dãy chuẩn này

để khảo sát độ lặp lại, độ tuyến tính và sử dụng làm đường chuẩn để định lượng

Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch chuẩn

- Pha dung dịch chuẩn phyllanthin để thử giới hạn phát hiện (LOD) bằng cách: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn C7 cho vào bình định mức 20 ml, thêm methanol vừa đủ tới vạch Tiếp tục pha loãng gấp đôi dung dịch này bằng cách hút 10,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 20 ml, thêm methanol vừa

đủ tới vạch Phân tích sắc ký với các dung dịch sau khi pha loãng cho đến khi không có píc đáp ứng trên sắc ký đồ

 Chuẩn bị mẫu thử

- Mẫu dược liệu Diệp hạ châu:

+ Xay thô dược liệu bằng máy xay sinh tố, sau đó tán nhỏ dược liệu bằng thuyền tán

+ Chiết phyllanthin trong dược liệu: Cân khoảng 0,5 g bột dược liệu đã xay, cho vào bình nón nút mài, thêm vào 100 ml MeOH, đem cân, ghi lại lượng cân Đun hồi lưu cách thủy trong 3 giờ, để nguội Bổ sung dung môi về đúng lượng cân đã cân, lắc kỹ, lọc qua giấy lọc, lọc qua màng 0,45 µm

- Mẫu thử chế phẩm:

Cân chính xác một lương bột viên sau khi đã nghiền nhỏ cho vào bình định mức 50,0 ml; thêm khoảng 30 ml MeOH Lắc siêu âm trong 15 phút để hòa tan, để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm MeOH vừa đủ tới vạch rồi lắc đều, lọc qua giấy lọc và màng lọc 0,45 µm

2.2.2.2 Khảo sát xây dựng chương trình sắc ký

Tham khảo các tài liệu đã công bố, lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp nhất, thường có thể tham khảo được cột, pha động, bước sóng phân tích Dựa vào cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý (độ tan, tính chất phân cực, tính chất hấp thụ ánh sáng,…) để tìm các điều kiện sắc ký phù hợp như: bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử và dung môi pha mẫu

- Cấu trúc phân tử phyllanthin có chứa nhân thơm nên phyllanthin có khả năng hấp thụ các bức xạ ở vùng tử ngoại Dựa vào những tính chất trên chúng tôi dự kiến sử dụng chương trình sắc ký pha đảo sử dụng cột C18 ít phân cực

Sử dụng dung dịch chuẩn phyllanthin 0,02 mg/ml pha trong MeOH để tiêm vào

hệ thống HPLC với detector PDA để khảo sát xây dựng chương trình sắc ký (pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện,…)

- Lựa chọn pha động: Khảo sát trên một số pha động để tìm được pha động phù hợp nhất

- Bước sóng phát hiện: Quét phổ PDA, lựa chọn bước sóng thích hợp

- Tốc độ dòng: 1-2 ml/phút

- Thể tích bơm mẫu: 20-100 µl

2.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng

Thẩm định phương pháp đã xây dựng được với các nội dung sau:

 Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng của phương pháp có thể xác định được một cách chính xác chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử như: tạp chất, sản phẩm phân hủy, tá dược,…

Cách xác định: Pha lần lượt dung môi pha mẫu, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, kết quả cho thấy dung dịch chuẩn và dung dịch thử tương ứng cho píc có thời gian lưu tương ứng, còn dung môi pha mẫu không cho píc ở thời gian tương ứng Hệ HPLC đặc hiệu với chất phân tích

 Độ tuyến tính

Độ tuyến tính biểu thị sự tương quan hồi quy giữa diện tích píc và nồng độ chất phân tích Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ trong khoảng nồng độ phân tích để khảo sát, phân tích mẫu, xác định phương trình hồi quy y = ax + b

và hệ số tương quan r, yêu cầu r ≥ 0,998