Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactic ứng dụng trong chế biến sản phẩm lên men truyền thống

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic 1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên quá trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic  Ảnh hưởng của nguồn cacbon  Ả

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iv

LỜI CẢM ƠN v

Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vẽ và đồ thị viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS PLANTARUM B33 2

1.1.1 Đặc điểm của chủng Lactobacillus plantarum b33 2

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic

3

1.1.3 Ứng dụng chủng L.plantarum b33 3

1.2 QUÁ TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC 4

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm vi khuẩn lactic 4

1.2.1.1 Phương pháp sấy 4

1.2.1.2 Chất mang 8

1.2.2 Các nghiên cứu tạo chế phẩm L.plantarum trong và ngoài nước 13

1.2.3 Ứng dụng của chế phẩm vi khuẩn lactic 15

1.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT NEM CHUA 16

2.1 VẬT LIỆU 18

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất, môi trường và thiết bị 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Phương pháp vi sinh 19

2.2.1.1 Hoạt hoá, làm sạch và giữ giống 19

2.2.1.2 Xác định lượng tế bào sống theo phương pháp Korch 19

2.2.1.3 Quan sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram 20

2.2.1.4 Phương pháp nuôi cấy tạo sinh khối 21

ii

2.2.2 Phương pháp hoá lý 21

2.2.2.1 Xác định pH bằng máy đo pH 21

2.2.2.2 Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo OD (Optical Density) 21

2.2.2.3 Xác định khả năng sinh axit lactic 22

2.2.2.4 Xác định khả năng kháng khuẩn 23

2.2.2.5 Xác định sinh khối vi khuẩn lactic 24

2.2.2.6 Xác định độ ẩm chế phẩm 24

2.2.2.7 Xác định tỷ lệ sống sót của vi khuẩn L.plantarum b33 trong chế phẩm 25

2.2.3 Quy trình tạo chế phẩm vi khuẩn L.plantarum b33 25

3.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG TẠO SINH KHỐI CHỦNG L.PLANTARUM b33 27

3.1.1 Kiểm tra đặc tính chủng L.plantarum b33 27

3.1.1.1 Hình thái vi khuẩn L.plantarum b33 27

3.1.1.2 Xác định khả năng sinh trưởng của L.plantarum b33 28

3.1.1.3 Khả năng sinh axit lactic 29

3.1.1.4 Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh 29

3.1.2 Xác định khả năng tạo sinh khối của chủng L.plantarum b33 30

3.2 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC

31

3.2.1 Ảnh hưởng của loại chất mang đến quá trình tạo chế phẩm 32

3.2.1.1 Ảnh hưởng của maltodextrin 32

3.2.1.2 Ảnh hưởng của trehaloza 33

3.2.1.3 Ảnh hưởng kết hợp hai chất mang maltodextrin và trehaloza 35

3.2.2 Kiểm tra đặc tính chủng L.plantarum b33 trong chế phẩm 36

3.2.2.1 Xác định đặc điểm hình thái của chủng trong chế phẩm 36

3.2.2.2 Khả năng sinh axit lactic của chủng trong chế phẩm 37

3.2.2.3 Khả năng kháng khuẩn của chủng trong chế phẩm 38

iii

3.3 XÁC ĐỊNH THỜI GIAN BẢO QUẢN CHẾ PHẨM 39

3.3.1 Hiệu quả bảo quản chế phẩm khi phối trộn chất độn vào chế phẩm sau sấy 40

3.3.2 Hiệu quả bảo quản chế phẩm sau khi phối trộn chất độn vào chế phẩm và bảo quản chế phẩm trong các bao bì khác nhau 42

3.4 ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM TRONG LÊN MEN NEM CHUA 43

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 46

Ứng dụng các kết qủa nghiên cứu của luận văn vào thực tiễnTÀI LIỆU THAM KHẢO 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu của luận văn này là hoàn toàn có thật, do chính bản thân tôi tổ chức thí nghiệm và nghiên cứu theo sự hướng dẫn của PGS.TS.Lê Thanh Mai Các số liệu tham khảo từ các tài liệu đều được liệt kê ở phần tài liệu tham khảo

Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012

Người thực hiện

Trịnh Thị Thảo

v

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này là kết quả của một thời gian dài nghiên cứu và làm việc để áp dụng những kiến thức đã học vào thực tiễn dưới sự hướng dẫn tận tình của PGS.TS Lê Thanh Mai, sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội

Với tình cảm chân thành, người viết xin gửi lời cảm ơn đến:

- PGS.TS Lê Thanh Mai là người hướ+97 ng dẫn khoa học đã rất tận tình hướng dẫn và cho những lời khuyên sâu sắc không những giúp tôi hoàn thành luận văn mà còn truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về nghề nghiệp

- Các thầy cô giáo của trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn, giúp đỡ trong suốt hai năm học để tôi có được những kiến thức ứng dụng trong công tác và là cơ sở thực hiện luận văn này

- Quý thầy cô đã dành thời gian quý báu để đọc và phản biện luận văn này, xin cảm ơn những ý kiến nhận xét sâu sắc của quý thầy cô

Mặc dù đã rất cố gắng nhưng do thời gian có hạn, kinh nghiệm và trình độ bản thân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn luận văn không tránh khỏi những sai sót, tác giả rất mong nhận được những ý kiến góp ý của các thầy cô và các bạn đồng nghiệp

để luận văn được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 09 năm 2012

vi

Danh mục các chữ viết tắt

L.plantarum b33 Lactobacillus plantarum b33

viii

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

Trang Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn các giai đoạn của quá trình sấy đông khô …….7 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của maltodextrin ……… 10 Hình 1.3:Cấu trúc của trehaloza ………13

Sơ đồ 1.1:Quy trình sản xuất nem chua truyền thống……….17

Sơ đồ 2.1: Xác định khả năng kháng khuẩn của L.plantarum b33 …….23

Sơ đồ 2.2:Quy trình tạo chế phẩm vi khuẩn L.plantarum b33………… 26

Hình 3.1:Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn L.plantarum

b33……… 27

Hình 3.2: Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn L.plantarum b33 theo thời

gian……….28 Hình 3.3: Khả năng phân giải CaCO3 của vi khuẩn lactic……… 29

Hình 3.4: Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn L.plantarum

b33……… 30 Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin đến tỷ lệ tế bào sống sót trong quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm……….33

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ trehaloza đến tỷ lệ tế bào sống sót trong quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm………34

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ trehaloza và maltodextrin đến quá trình sấy đông khô tạo chế phẩm……….35

Hình 3.8: Khả năng kháng Staphylococus aureus của vi khuẩn L.plantarum

Hình 3.9: Xác định khả năng kháng E.coli của chế phẩm L.plantarum b33

sau quá trình sấy đông khô… ………39

Hình 3.12: Sự biến đổi số lƣợng tế bào vi khuẩn L.plantarum b33 trong

nem chua theo thời gian……… 44

1

MỞ ĐẦU

Từ ngàn đời xưa, cha ông ta đã biết dự trữ thực phẩm để sử dụng lâu dài Phương pháp dự trữ không chỉ đơn thuần là phơi khô hay ướp muối mà còn biết muối chua (lên men) Quá trình muối chua chỉ được chú ý và quan sát rất đơn giản như biến đổi màu sắc, mùi vị hay tuổi thọ của sản phẩm được dự trữ

Năm 1857 Louis Pasteur phát hiện ra vi khuẩn lactic có trong sữa chua thì loài người mới bước đầu hiểu biết thực sự quá trình lên men Ngày nay, các sản phẩm lên men truyền thống không chỉ dừng lại ở lên men tự nhiên mà còn cần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm Tại Việt Nam, có rất nhiều sản phẩm như vậy như: nem chua, tôm chua, dưa chua, cà muối, tương… Trong các sản phẩm này, có lẽ nem chua là phổ biển nhất trong các sản phẩm lên men truyền thống của nước ta được nhiều bạn bè trên thế giới biết đến Tuy nhiên, quá trình sản xuất nem chua không gia nhiệt, lên men diễn ra bởi các vi sinh vật tự nhiên, nguyên liệu sản xuất lại giàu dinh dưỡng, độ ẩm lại cao Cho nên, quá trình lên men đã tạo điều kiện thích hợp cho hệ vi sinh vật gây bệnh phát triển Vì vậy, chất lượng nem chua thường không đồng đều và không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Vậy làm thế nào để nem chua không chỉ có chất lượng đồng đều, giữ được hương vị thơm ngon truyền thống, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm mà vẫn kéo dài thời gian sử dụng Để giải quyết vấn đề này, trong những năm gần đây

đã có không ít các nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic làm chủng khởi động cho quá trình lên men sản xuất nem chua công nghiệp Tuy nhiên, các

nghiên cứu chỉ là bước đầu nên chúng tôi quyết định “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm lactic ứng dụng trong chế biến sản phẩm lên men truyền thống”

2

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS PLANTARUM B33

Vi khuẩn đầu tiên được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm lên men truyền thống chính là vi khuẩn lactic Tuy nhiên, năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên chứng minh sữa chua được tạo thành do hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặc biệt, ông đặt tên là vi khuẩn lactic nhưng ông chưa phân lập được chúng Năm

1878, J.Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên là Bacterium lactic[14]

Từ đó cho đến nay có rất nhiều chủng vi khuẩn mới được phân lập Vi khuẩn lactic

nói chung được xếp vào họ Lactobacteriacae, chúng không đồng nhất về hình thái,

hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt oxy và tuổi tế bào Tuy nhiên, về mặt sinh lý chúng là các vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết axit lactic

1.1.1 Đặc điểm của chủng Lactobacillus plantarum b33

Lactobacillus plantarum là loài lớn trong họ Lactobacillus, đây là họ lớn nhất trong họ thuộc loài vi khuẩn lactic, là trực khuẩn gram dương, lên men đồng hình

[18] Hình dạng của chúng chủ yếu là hình que dài, kích thước 0,7- 1,1µm đến 3- 8µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của

L.plantarum là 30-40oC, chúng có khả năng sinh trưởng được ở 15oC nhưng lại không sinh trưởng tại 45o

C L.plantarum có khả năng tổng hợp axit lactic ở cả hai

dạng đồng phân D và L Đây là loài vi hiếu khí nên nó có thể lên men kỵ khí hoặc

hiếu khí (do có thể sử dụng oxy nhưng không có chuỗi hô hấp và cytochrome) L.plantarum b33 mang đầy đủ các đặc điểm chung của loài Lactobacillus plantarum như: là trực khuẩn Gram dương, không có hoạt tính catalaza, không sinh

bào tử, không sinh khí, không có khả năng di động

3

Hình thái chủng L.plantarum b33 sau khi được nhuộm Gram và soi tiêu bản

trên kính hiển vi với vật kính 1000 có đặc điểm: bắt màu tím tinh thể, tế bào hình que, có màu tím, thường xếp song song thành từng cặp hoặc riêng rẽ, kích thước tế bào khoảng 0,8-1.5 µm

Hình thái khuẩn lạc L.plantarum b33 nhỏ, đường kính khoảng 0,5-1mm, tròn,

mép trong, khuẩn lạc có màu trắng ngà

Đặc điểm sinh trưởng: chủng sinh trưởng ở nhiệt độ thích hợp nhất là 30o

C; pH thích hợp 6,2; có khả năng lên men tạo axit lactic là chủ yếu Sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MRS trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí [31].Quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn này đạt cân bằng sau 24h nuôi cấy [2; 9; 5] và pH đạt được khoảng 3,5-4 Ngoài ra, chủng có khả năng sinh bacteriocin mạnh [2; 9]

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic

1) Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên quá trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Cũng như nhiều vi khuẩn lactic khác thì L.plantarum b33 cũng có một số

ứng dụng trong thực tiễn:Trong ngành công nghiệp sản xuất axit lactic, đây là nguồn nguyên liệu rất cần thiết cho ngành công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, in ấn, sơn và công nghiệp chế tạo chất dẻo có khả năng phân hủy sinh học

4

 Trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm

 L.plantarum b33 có khả năng lên men galacza, glucoza, fructoza…

nên chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm lên men như các sản phẩm nguồn gốc động vật (nem chua, xúc xích, salami, tôm chua…), các sản phẩm có nguồn gốc thực vật (kim chi Hàn quốc, bắp cải muối, ngũ cốc lên men, tương…) và một số sản phẩm từ sữa khác

 L plantarum b33 được sử dụng để ủ thức ăn gia súc trong điều kiện

kỵ khí, các vi khuẩn này lên men nhanh và át hẳn các vi khuẩn khác trong vòng 48h Hơn nữa, do có khả năng lên men lactic sinh ra axit hữu cơ làm giảm pH môi trường khiến các vi sinh vật gây thối, hỏng thực phẩm hay vi sinh vật gây bệnh bị tiêu diệt do đó được sử dụng trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm Năm 2010, Nguyễn Thế Trang đã tiến hành sử dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm bảo quản cá

 Hơn nữa, một số chủng thuộc loài L.plantarum có khả năng sinh

bacteriocine nhóm IIB (<10kDa) như: plantaricins loại S và T[22], plantaricins LR14 [32], plantaricins TF711 [21] Đây là các bacteriocin bền nhiệt có thể chịu pH 100oC trong 30 phút và có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ pH = 2-

7[21; 32] Riêng chủng L.plantarum b33 cũng có khả năng sinh bacteriocin và

cũng được ứng dụng trong sản xuất nem chua, tôm chua[2; 9]

1.2 QUÁ TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo chế phẩm vi khuẩn lactic

5

Hiện nay, có bốn phương pháp sấy được sử dụng phổ biến để tạo chế phẩm vi sinh vật:

Bảng 1.1: Các phương pháp sấy phổ biến hiện nay

- Rẻ tiền, đơn giản

- Cường độ sấy lớn, cho phép sấy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ cho phép vì thời gian tiếp xúc ngắn

-Hiệu quả sử dụng cao -Có khả năng điều khiển tự động

- Phạm vi sử dụng hẹp: chỉ dùng cho nguyên liệu kích thước nhỏ, độ ẩm thấp

+Bộ phận đốt nóng không khí(air heater)

+Bộ phận nhập liệu (feeding) +Cơ cấu phun (atomization) +Bộ phận thu hồi sản phẩm (powder collection),

+Cyclon tách bụi (dust

separation)

-Gồm ba giai đoạn cơ bản:

+Phun sương: tạo sương mù cho nguyên liệu ở dạng lỏng, huyền phù thành dạng hạt

+ Trộn mẫu và tác nhân sấy:

sau khi trộn, ẩm trong mẫu bốc hơi

+Thu hồi sản phẩm

-Thời gian sấy cực ngắn -Chất lượng sản phẩm đồng đều

-Hoạt động liên tục và điều khiển tự động

-Phạm vi sử dụng hẹp, thiết bị mang tính đặc thù -Vốn đầu tư lớn

- Hiệu suất thu hồi thấp

Sấy chân không

(Vacuum drying)

-Gồm một buồng sấy, trong có giá đỡ đựng các khay Vỏ của buồng sấy là lớp vỏ áo

-Những thiết bị đi kèm: bơm chân không, thiết bị ngưng

-Áp suất trong buồng sấy là áp suất chân không, vỏ áo được gia nhiệt bằng hơi nước bão hoà hay nước nóng Khi được gia nhiệt dưới áp suất chân

-Nhiệt độ sấy thấp -Lượng ẩm bốc ra nhiều, không gây ô nhiễm môi trường

-Sấy được vật liệu không

-Chi phí năng lượng và chi phí thiết bị cao -Chỉ dùng cho một số sản

phẩm chất lượng cao

6

tụ,bộ phận gia nhiệt, áp kế không, ẩm từ vật liệu thoát ra

và liên tục được hút ra ngoài nhờ bơn chân không Nhiệt độ

sấy nhỏ hơn 100°C

chịu được nhiệt độ cao

Sấy đông khô

(Freeze drying)

-Gồm ba giai đoạn:

+Giai đoạn lạnh đông + Giai đoạn thăng hoa

+Giai đoạn tách hơi ẩm

- Nhiệt độ sấy thấp nên bảo toàn được giá trị dinh dưỡng và màu sắc, cấu tử hương, cấu trúc vật liệu không thay đổi đáng kể

-Chi phí cho thiết bị và năng lượng cao dẫn tới

giá thành sản phẩm đắt

7

 Sấy đông khô

Sấy đông khô gồm 3 giai đoạn chính [8]:

 Giai đoạn làm lạnh (giai đoạn lạnh đông)

Trong giai đoạn này vật liệu sấy được làm lạnh từ nhiệt độ môi trường xuống nhiệt

độ -20°C Ở giai đoạn này không gian của bình thăng hoa được hút chân không và áp suất trong bình giảm Do áp suất giảm (gồm áp suất hơi nước và áp suất trong lòng vật liệu sấy) dẫn tới hiện tượng thoát ẩm từ vật liệu sấy cho nên nhiệt độ vật liệu sấy nhỏ hơn điểm 3 thể (T<273k, p>610Pa)

Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn các giai đoạn của quá trình sấy đông khô

 Giai đoạn thăng hoa

Đây là giai đoạn tách ẩm chính của phương pháp sấy đông khô Ở giai đoạn này, áp suất hơi nước được giữ dưới 4,58 mmHg (610,5 Pa) và nước ở dạng băng, khi sản phẩm được cung cấp nhiệt, thì băng rắn sẽ thăng hoa trực tiếp thành hơi mà không bị tan chảy Hơi nước tiếp tục được tách ra khỏi sản phẩm bằng cách giữ cho áp suất trong buồng thăng hoa thấp hơn áp suất hơi nước trên bề mặt của băng, đồng thời tách hơi nước bằng máy bơm chân không và ngưng tụ nó bằng các ống xoắn ruột gà lạnh Quá trình sấy tiếp diễn, bề mặt thăng hoa di chuyển vào bên trong sản phẩm đông lạnh,

8

làm sản phẩm được sấy khô Hơi nước di chuyển ra khỏi sản phẩm qua các kênh và đến

bình ngưng, sau đó thành băng bám trên bề mặt ống

 Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại

Là giai đoạn làm bay hơi ẩm liên kết, nhiệt độ của vật liệu sấy tăng nhanh Tốc độ sấy phụ thuộc phần lớn vào tính cản trở nhiệt của sản phẩm và ở mức độ thấp hơn vào

độ cản trở dòng hơi (dịch chuyển khối) ra khỏi bề mặt thăng hoa

Sau giai đoạn thăng hoa do trạng thái của nước trong vật liệu nằm trên điểm 3 thể nên ẩm trên vật liệu trở về dạng lỏng Vì khi đó áp suất trong bình thăng hoa vẫn được duy trì bé hơn áp suất khí quyển nhờ bơm chân không và vật liệu sấy vẫn tiếp tục được gia nhiệt nên ẩm vẫn không ngừng biến từ dạng lỏng sang dạng hơi và đi vào không gian bình thăng hoa Như vậy giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy chân không bình thường

Phương pháp này đã được chứng minh là cho tỷ lệ sống sót của tế bào sau khi sấy cao nhất Năm 2011, Papanna cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sấy vi khuẩn

Leuconostoc mesenteroides MTCC 5209 sử dụng cả bốn phương pháp sấy nêu trên

Kết quả cho thấy chỉ có phương pháp sấy đông khô khi sử dụng chất mang là sucrose 7% cho thấy có hiệu quả sống sót 72% và sau 6 tháng bảo quản ở 4oC chỉ giảm 1log[28] Bên cạnh đó, không chỉ phương pháp sấy có ảnh hưởng tới quá trình tạo chế phẩm mà chất mang cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới quá trình tạo chế phẩm Và cũng đã có không ít các nghiên cứu về ảnh hưởng của chất mang khi sử dụng phương

pháp sấy đông khô tạo chế phẩm vi khuẩn lactic [14; 11; 18; 25; 31; 36; 28; 26]

1.2.1.2 Chất mang

Chất mang có vai trò rất lớn trong quá trình sấy và bảo quản vi khuẩn lactic Do đó việc lựa chọn chất mang phù hợp với chủng vi khuẩn nghiên cứu là rất cần thiết Có ba loại hợp chất thường được sử dụng làm chất mang:

9

 Chất có khả năng hấp thụ qua thành và màng nguyên sinh chất làm thành tế bào dẻo hơn, chúng ngăn sự tách nước, giảm tính độc của muối và ngăn sự tạo thành tinh thể bên trong tế bào trong quá trình sấy Các chất thuộc loại này bao gồm: monosaccharide, disaccharide, glycerol….[28]

 Chất thấm qua thành tế bào nhưng không qua màng nguyên sinh chất gây co nguyên sinh tế bào trước khi lạnh đông, tập trung vào giữa màng tế bào và thành tế bào như lớp đệm chống lại sự tạo thành băng vì vậy tạo thành sự bảo vệ cơ học dưới màng như maltodextrin

 Chất không thấm qua thành tế bào hoặc không trực tiếp tương tác với thành hoặc được hấp thụ trên bề mặt của các vi sinh vật ở đó chúng tạo thành lớp gel, do đó kìm hãm được tốc độ tạo tinh thể thông qua sự gia tăng tính nhầy của dung dịch và giữ cấu trúc vô định hình của tinh thể gần như trạng thái của tế bào như protein, polysaccharide…

Ngoài ra còn có một số loại đường và dẫn xuất của đường (glucose, fructose, lactose, manose ), rượu có gốc đường (sorbitol, inositol) và đường không khử (trehaloza) [17; 10] với các tính năng như giá thành rẻ, không độc hại, được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và được bổ sung vào chế phẩm trước khi sấy nhằm bảo vệ vi khuẩn trong quá trình sấy và bảo quản chế phẩm sau này Qua nghiên cứu các tài liệu chúng tôi nhận thấy hai chất mang không những mang đầy đủ các đặc tính có lợi trên mà còn góp phần nâng cao tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn lactic trong quá trình sấy và bảo quản chế phẩm là trehaloza và maltodextrin

1 Maltodextrin

Maltodextrin là polysaccharide có giá trị dinh dưỡng cao, có độ ngọt thấp, được cấu thành từ D-glucose nhờ các liên kết α-1,4 glucozit và có chỉ số DE<20 (Dextrose Equivalent: chỉ số đương lượng khử quy ra D-glusoce được tạo thành trong quá trình

10

thủy phân tinh bột tính theo % chất khô) Maltodextrin được sản xuất bằng nhiều phương pháp khác nhau như: Lý hóa học, sinh học

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của maltodextrin

Maltodextrin được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:

 Maltodextrin được dùng để sản xuất thức ăn trẻ em và đồ ăn kiêng

 Maltodextrin được sử dụng trong sản xuất các loại bánh kẹo và đồ uống

 Maltodextrin có tác dụng trong dược phẩm như làm màng bao, tá dược

 Cuối cùng một đặc tính vô cùng quý báu đó là maltodextrin được dùng làm chất

ổn định, giữ hương vị hay giữ tinh dầu trong sản xuất sôcôla, cà phê, nước quả… Hơn thế nó còn là chất mang bảo vệ vi khuẩn và các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình sấy tạo chế phẩm ứng dụng rất lớn trong đời sống và sản xuất

Trong nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic, maltodextrin được coi là một trong những chất mang được sử dụng rộng rãi

 Năm 2005, Harrie Oldenhof cùng cộng sự đã nghiên cứu thành công sấy khí

(air drying) vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus sử dụng chất mang maltodextrin 5%

(w/w) và kết hợp maltodextrin với sucrose 5% (w/w) cho hiệu quả sống sót của vi khuẩn này sau sấy là cao nhất trong các loại chất mang được nghiên cứu[20]

11

 Năm 2007, Chavez và cộng sự nghiên sử dụng protein đậu nành kết hợp với

maltodextrin cho tỷ lệ sống sót của tế bào vi khuẩn Bifidobacterium lactis BB12 là cao

nhất trong các chất mang được tiến hành nghiên cứu [15]

 Năm 2009, Ibourahema cùng cộng sự năm 2009 đã tiến hành tạo chế phẩm vi

khuẩn L.plantarum bằng phương pháp sấy đông khô và cho tỷ lệ tế bào sống sót sau

sấy lên đến 97% khi sử dụng kết hợp hai loại chất mang maltodextrin 5% với glycerol

2% Chế phẩm L.plantarum được bảo quản trong 4oC sau 3 tháng mà tỷ lệ sống sót chỉ giảm 1 log [25]

2 Trehaloza

Trehaloza là chất mang được ứng dụng nghiên cứu nhiều nhất trong nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic do mang các đặc tính thực sự cần thiết giúp tế bào vi khuẩn chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt của quá trình sấy đông khô Trehaloza được thấy như là chất bổ trợ cần thiết, do nó thế chỗ các phân tử nước trong màng tế bào khi quá trình loại nước và các liên kết hidro liên kết của các phân tử protein ở hai đầu cực

bị phá vỡ [29] Theo kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy, các tác nhân bảo vệ đặc biệt là các đường tạo nhiệt độ thấp hơn của màng tế bào khi chuyển trạng thái (Tm: transition temperature) và bảo vệ cấu trúc protein trong quá trình sấy Hầu hết các phân

tử nước đều bị giữ ở trong giữa các phân tử đường và các tinh thể đá [16] Samuel và cộng sự đã công nhận trehaloza có khả năng bảo vệ tế bào khô hơn các loại đường khác, nó có thể bảo vệ liposom, cô lập màng sinh học và bảo vệ nguyên vẹn tế bào khỏi

sự ảnh hưởng của quá trình lạnh đông và sấy [29] Đến năm 2003, Hubalek cũng khẳng định khả năng bảo vệ của đường là do đường ngăn sự tạo thành các tinh thể khi mà chúng giữ các dung môi đặc biệt là muối tránh hiện tượng tạo tinh thể [24]

Hơn thế nữa trehaloza còn có tác dụng làm ổn định màng tế bào trong quá trình lạnh đông là do: trong quá trình ưu trương khi các tinh thể đá được hình thành chúng

12

liên kết với các nhóm phospholipid ở đầu cực Trehaloza cũng góp phần ngăn sự hình thành tinh thể đá Bên cạnh đó, trehaloza còn được sử dụng để thay thế một phần lớn các phần ion trong môi trường vì vậy hiệu quả của đường này còn thấy làm giảm tối đa quá trình tạo tinh thể trong dung môi một cách chậm chạp [19]

Tác dụng của trehaloza cũng đã được rất nhiều nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn lactic khẳng định

 Năm 2005, Hsi-Chia Chen và cộng sự đã chứng minh khi sử dụng trehaloza

10% làm chất mang bổ sung vào quá trình sấy Lactobacillus helveticus, Leuconostoc mesenteroides thì tỷ lệ sống sót của tế bào sau sấy đông khô là 35% [23]

 Ngay năm sau đó, Tri Duong cùng cộng sự cũng đã khẳng định khả năng bảo vệ

của trehaloza khi tiến hành sấy đông khô vi khuẩn L.axitophylus sử dụng trehaloza

20% cho tỷ lệ sống sót của vi khuẩn này 94% [34]

 Năm 2008, Xiao và cộng sự sử dụng trehaloza 5% cho hiệu quả sấy đông khô

cao, tỷ lệ tế bào Lactobacillus casei ATCC 393 sống sót sau 1 tuần tạo chế phẩm là

3,57E+7 cfu/g và sau 2 tháng bảo quản ở 4oC giảm số lượng tế bào khoảng 1log [35]

 Đến năm 2009, Siaterlis cùng cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy sử dụng

trehaloza 5% cho tỷ lệ sống sót của vi khuẩn L.plantarum NCIMB sau quá trình sấy

đông khô là 75% [35]

 Jalali và cộng sự, năm 2012 nghiên cứu sử dụng kết hợp 6% sữa gầy, 8%

trehaloza và 4% vitamin C bổ sung cùng với vi khuẩn Lactobacillus paracasei subsp tolerance (DSM 20258) trước khi tiến hành sấy đông khô cho hiệu quả sau sấy là tế

bào vi khuẩn sống sót là 82% và sau 3 tháng bảo quản ở 4oC tỷ lệ sống sót của vi khuẩn này còn 76% [26]

13

Hình 1.3: Cấu trúc của trehaloza

1.2.2 Các nghiên cứu tạo chế phẩm L.plantarum trong và ngoài nước

 Nghiên cứu ngoài nước

Các nghiên cứu sử dụng chủng L.plantarum làm đối tượng nghiên cứu không còn

quá mới mẻ nhưng những thành tựu thu được từ các nghiên cứu nhằm mục đích thu chế phẩm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo cũng như ứng dụng trong công nghiệp

và đời sống còn rất hạn chế

 Linder và cộng sự, năm 1995 sử dụng phương pháp sấy tầng sôi tạo chế phẩm vi

khuẩn lactic L.plantarum, sử dụng chất bảo vệ là carbonhydrate (maltose, sorbitol,

maltose, sucrose) kết hợp với tinh bột và thu được kết quả Sorbitol kết hợp với tinh bột (tỷ lệ theo trọng lượng khô 1: 3,5: 0,8 theo thứ tự là tế bào:tinh bột: sorbitol) cho hiệu quả thu chế phẩm lactic cao nhất và kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu [27; 12] Đến năm 1997, ông cùng cộng sự cũng khẳng định thêm khi tiến hành sấy thông thường ở 22o

C, thời gian 18-22h, L.plantarum P743 có khả năng chống chịu cao hơn

do có được bổ sung chất bảo vệ là các loại đường

 Thêm vào đó, Carvalho và cộng sự, năm 2002 đã tiến hành sấy L.plantarum

LR-ESB sử dụng phương pháp sấy đông khô và trong quá trình sấy có bổ sung thêm các chất mang như trehaloza 5.6% (w/w) và fructose, inositol, sorbitol đều là 20% (w/w)

14

thì sorbitol cũng có kết luận tương tự về hiệu quả sử dụng sorbitol làm chất bảo vệ Có được kết quả này là do trong suốt quá trình bảo quản nó đã ngăn sự phá hủy màng tế bào bằng các phản ứng với màng và làm ổn định cấu trúc và chức năng của protein [13]

 Năm 2009, Siaterlis và cộng sự đã nghiên cứu L.plantarum NCIMB 8826 cho

thấy có khả năng sinh trưởng mạnh trên môi trường MRS chỉ sau 12h nuôi cấy có thể đạt đc 10E10 cfu/ml Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng, trehaloza 5% và 10% (w/w), sau khi sấy đông khô cho hiệu quả sống sót của tế bào là: 75% với nồng độ 10% trehaloza và chỉ 60% với 5% trehaloza và sau quá trình bảo quản 3 tháng ở 4oC thì tỷ lệ

tế bào sống sót vẫn là 93.5% Tác giả cũng chỉ ra rằng một nguyên nhân quan trọng dẫn tới tỷ lệ sống sót của tế bào sau sấy và trong quy trình bảo quản chính là sự thay đổi của nồng độ các axit béo trong tế bào vi khuẩn trước và sau khi sấy đông khô (do các aicd béo có chứa các gốc tự do, trong quá trình sấy và bảo quản các gốc này bị ôxi hóa do ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, hoạt độ nước) [31]

 Đến năm 2011 trên tạp chí khoa học thực phẩm, đã đưa ra quy trình chuẩn sử

dụng chế phẩm L.plantarum trong sản xuất dưa chuột và cho hiệu quả rất cao sau 6

tháng bảo quản chế phẩm vẫn giữ được 50% hoạt tính [30]

 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt nam các nghiên cứu về vi khuẩn lactic được bắt đầu khá sơm và rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, nhà máy hay thậm chí cả các cơ sở sản xuất Tuy nhiên, nghiên cứu tạo chế phẩm lactic chỉ mới bắt đầu đầu thế kỷ XXI

 Năm 2005, Vũ Hồng Minh đưa ra kết quả nghiên cứu tạo chế phẩm

Streptococcus thermophilus Tác giả tiến hành nghiên cứu cả hai phương pháp sấy

đông khô và sấy phun với việc bổ sung thêm sữa gầy và tinh bột Chế phẩm được thu hồi bằng phương pháp đông khô có tỷ lệ sống sót, hiệu suất cao hơn so với phương pháp sấy chân không Trong đó, chế phẩm thu được có hỗn hợp tinh bột và sữa gầy ở

15

tỷ lệ 1:1, hàm lượng chất bổ trợ bao gồm glutamat natri 2% (w/w), glucoza 5% (w/w), bảo quản tại nhiệt độ 5ºC Sau thời gian 3 tháng hoạt lực của chế phẩm thu được vẫn khá tốt không thua kém gì hoạt lực của chế phẩm có nguồn gốc từ Pháp [6]

 Năm 2008, Phan Thanh Tâm đã định tên vi khuẩn lactic được phân lập từ nem

chua là vi khuẩn L.plantarum Sau đó, tác giả tiến hành phương pháp sấy chân không

(độ chân không 200-250mmHg, nhiệt độ sấy 40o

C trong 2h) thì thu được chế phẩm có

độ ẩm 8% và mật độ tế bào là 2x10E+9 cfu/g [9]

 Đến năm 2009, Đinh Thị Hường đã nghiên cứu tạo chế phẩm từ vi khuẩn

L.plantarum b33 sử dụng phương pháp sấy phun với nhiệt độ đầu vào 120 C, chất mang sử dụng là maltodextrin 18% cho tỷ lệ số tế bào sống sót đạt tới 25% [5]

 Năm 2010, Nguyễn Thế Trang phân lập được chủng L.plantarum và tiến hành

tạo chế phẩm vi khuẩn lactic theo hai dạng: dạng bột và dạng ướt Tức là sau khi ly tâm thu sinh khối tế bào vi khuẩn: nếu trộn vi khuẩn với chất mang (có độ ẩm <13%) đến khi có độ ẩm <25% thì tiến hành bỏ vào túi nilon và bảo quản thì được gọi là chế phẩm dạng bột; hoặc nếu phối trộn 400ml dịch vi khuẩn với 1kg chất mang (bột ngô: bột đậu tương= 4:1) rồi thêm 20g đường, 15g muối cho vào túi Thì sau quá trình phối trộn cho thấy: chế phẩm dạng ướt cho mật độ tế bào 3,2x10E8 cfu/g và dạng bột là 6,1x10E9 cfu/g [10]

Tuy nhiên các nghiên cứu vẫn chỉ bước đầu do các hạn chế về mặt công nghệ, cũng như kinh phí Vì vậy việc tiến hành hoàn thiện hơn chế phẩm vi khuẩn lactic phục

vụ cho đời sống và công nghiệp lên men là một việc làm cần thiết

1.2.3 Ứng dụng của chế phẩm vi khuẩn lactic

 Lên men tạo axit lactic ứng dụng trong công nghiệp sản xuất axit lactic, công nghiệp chế biến sữa và chế phẩm sinh học ứng dụng trong y tế: biolactaxyl

1.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT NEM CHUA

Bảng 1.2: Thành phần nguyên liệu sản xuất nem chua

Gia vị (tiêu, tỏi, ớt) 0.3-0.4

Lá ổi, lá đinh lăng

Thuyết minh quy trình [3]:

 Nguyên liệu: Thịt nạc mông được rửa sạch, thấm khô, lọc gân, sụn, máu tụ

 Xử lý bì lợn: Bì tươi được làm sạch lông rồi đem luộc cho chín tới (bì chuyển sang màu trong, trạng thái rắn không quá mềm) để thái sợi dễ và tạo cấu trúc giòn dai cho sản phẩm Để nguội, thái sợi Trộn tỷ lệ thịt: bì= 2,2: 1

17

Sơ đồ 1.1: Quy trình sản xuất nem chua truyền thống

 Thịt được cắt thành miếng rồi đem xay nhuyễn, thêm bì và phụ gia Lưu ý khi xay thịt thì tốc độ dao quay khoảng 2000v/p, cối xay được giữa lạnh <8oC

 Công thức phối trộn phụ gia gồm: 1,5%glucoza, 1,2% muối ăn, 2% thính, 150 ppm muối bảo quản, 500ppm vitamin C

 Định lượng: cẫn hỗn hợp bán thành phẩm theo các khối lượng khác nhau tiện cho quá trình sử dụng và vận chuyển

 Bao gói: Sử dụng túi PE bao gói bên ngoài

 Lên men: sau khi bao gói hỗn hợp bán thành phẩm được đặt trong nhiệt độ 30o

C, pH=4,5- 4,6

NEM CHUA

Thịt lợn nạc

Gia vị nạc

18

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum b33 được phân lập từ nem chua do Bộ

môn công nghệ thực phẩm và công nghệ sinh học - Trường Đại học Bách khoa

Hà nội cung cấp

 Chủng E.coli và Staphylococus aureus (Pháp)

 Maltodextrin (Việt Nam)

 Trehaloza (Trung Quốc)

2.1.2 Hóa chất, môi trường và thiết bị

 Môi trường MPA (meat peptone agar): 3g cao thịt, 5g NaCl, 10g peptone

 Môi trường NB (nutrient broth) (Merck)

19

Tất cả các loại môi trường đều cần:

- Dẫn nước đến 1 lít môi trường nuôi cấy

- Hấp vô trùng ở chế độ 121o

C trong thời gian 20 phút

- Môi trường rắn cần bổ sung thêm 18g/l agar

 Thiết bị

 Máy ly tâm thu sinh khối lớn

 Máy sấy đông khô

20

Nuôi cấy một lượng mẫu nhất định hoặc mẫu đã pha loãng lên môi truờng thạch dinh dưỡng đặc hiệu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó Từ tổng số khuẩn lạc đếm được sẽ suy ra số lượng tế bào sống có trong mẫu phân tích [7]

 Tiến hành

Dùng micropipet vô trùng lấy 1ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý NaCl 0,85% Sau đó tiếp tục pha loãng đến các nồng độ thích hợp, nuôi cấy vi khuẩn lactic trên môi trường MRS đặc hiệu tại 30oC, trong 24h (ít nhất là cấy 2 độ pha loãng liên tiếp nhau, mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần) Sau đó quan sát đếm

số lượng khuẩn lạc, ta tính được số lượng tế bào (khuẩn lạc) trung bình có trong 1ml (1g) mẫu theo công thức:

Trong đó:

Σ C – Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n1 – Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất)

n2 – Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2

f1 – Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1

2.2.1.3 Quan sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

Quy trình nhuộm Gram được tiến hành như sau: Dùng que cấy tròn lấy 1 giọt canh trường của chủng vi khuẩn cần quan sát lên phiến kính sạch Cố định vết bôi bằng ngọn lửa đèn cồn Nhỏ vài giọt tím gentian lên trên, để yên trong 1- 2 phút, sau đó rửa bằng nước cất (nhiều nhất trong 5 phút) Cho tiếp vài giọt lugol, để yên 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất Tẩy bằng etanol 95% trong 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất Cho