bộ khoa học và công nghệ Bộ y tế chơng trình khoa học và công nghệ phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng báo cáo tóm tắt dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm m số KC.10-DA12 5972 10/8/2006 Hà nội 2004 dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc kc.10 da12 hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm Chủ nhiệm dự án : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân Các cán bộ tham gia TS.Nguyễn Tuyết Nga CNSH.Vũ Hồng Nga CN.Lê Hoàng Long TS.Đỗ Tuấn Đạt TS.Đỗ Thủy Ngân TS.Nguyễn Quế Anh PGS.TS.Đoàn Huy Hậu PGS.TS.Hồ Bá Do BS.Đinh Hồng Dơng Các cơ quan tham gia Công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắc xin và các chế phẩm sinh học Trung tâm khoa học sản xuất vắc xin Sabin Bộ môn Dịch tễ - Học viện Quân y các chữ viết tắt ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axít ribonucleic) ALT Alanin transferaza AST Asparagin Transferaza CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ) cADN Complementary ADN (ADN bổ sung) ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ED50 Effective dose 50 (Liều gây miễn dịch 50%) ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) ELU ELISA Unit (Đơn vị ELISA) GMT Geometric mean titer (hiệu giá trung bình nhân) HAV Hepatitis A Virus (Virút viêm gan A) HLA kháng nguyên bạch cầu ngời HT Huyết thanh IFN interferon- IFN interferon- IFN interferon- kD kilodalton (kilôdalton) LH 3 E Lactalbumin hydrolysate Egle mIU mili International unit (mili đơn vị quốc tế) àg mcg M Mol MSV Master seed virus (Chủng gốc giống) NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử ) nm nanomet NCR Non coding region (Vùng không mã hóa) ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza) PFU Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMMK Primary Monkey Kidney Cell (Tế bào thận khỉ tiên phát) rpm round per minute (Vòng/phút) SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamid) TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50 (LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo) VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1 VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng VX V¾cxin WSV Working seed virus ( Chñng s¶n xuÊt) mục lục Đặt vấn đề 1 CHƯƠNG 1 : Vật liệu và phơng pháp 2 1.1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt 2 1.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 3 1. 2.1. An toàn chung 3 1. 2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3 1.2.3. Kiểm tra chất gây sốt 3 1.2.4. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4 1.2.5. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 4 1.2.6. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 4 1.2.7. Kiểm tra công hiệu 4 1.3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 5 1.3.1. Đối tợng nghiên cứu. 5 1.3.2. Vật liệu nghiên cứu 5 1.3.3. Phơng pháp nghiên cứu 5 CHƯƠNG 2: Kết quả và bàn luận 8 2.1. Hoàn thiện qui trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt 8 2.1.1 Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình nuôi cấy8 2.1.2. Hiệu giá vi rút viêm gan A trong quá trình tinh khiết virút 8 2.1.3 Hàm lợng Protein toàn phần 8 2.1.4. Thử nghiệm bất hoạt9 2.1.5. Pha chế vắc xin và đóng ống 9 2.2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan A bất hoạt 10 2. 2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 10 2.2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học 11 2.3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan A bất hoạt trên thực địa lâm sàng 13 2.3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm gan A trên các đối tợng 13 2.3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối tợng có anti-HAV (-) 14 2.3.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch sau tiêm VX ở nhóm đối tợng có anti-HAV (+) 18 Kết luận 20 Kiến nghị 22 Tài liệu tham khảo 23 1 đặt vấn đề Virút viêm gan A (HAV) là rất phổ biến ở tất cả các nớc khu vực Tây Thái Bình Dơng và Đông Nam á. Điều kiện vệ sinh kém đã làm lây lan HAV ở những vùng dịch lu hành cao. Mức độ lu hành của HAV trong cộng đồng là cực kỳ cao. Các nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Bangladesh, Bhutan, India, Maldive và Nepal chứng minh rằng 85-95% trẻ em ở 10 tuổi đã có miễn dịch với HAV. Chỉ có một số ít trẻ bị nhiễm phát triển thành các trờng hợp nhiễm trùng có triệu chứng. Nghiên cứu căn nguyên các trờng hợp viêm gan rải rác ở các nớc này chứng minh rằng nhiễm HAV chịu trách nhiệm tới khoảng 10-25% tất cả các trờng hợp viêm gan ở trẻ em, trong khi nhiễm ở ngời lớn thờng chỉ là 1-5%. Dịch viêm gan A thờng xẩy ra ở các thành phố có liên quan đến việc sử dụng nguồn nớc uống và thực phẩm không an toàn. Kết quả nghiên cứu huyết thanh-dịch tễ học ở Indonesia và Thái Lan cho thấy huyết thanh dơng tính ở trẻ em giảm xuống trong năm 1994- 1995 (30-35%) so với kết quả nghiên cứu đã tiến hành vào năm 1977-1978 (85-90%) ở trẻ em tuổi từ 7-12 tuổi. Đây có thể là kết quả cải thiện tiêu chuẩn vệ sinh, làm sạch môi trờng, thiết bị nớc uống và cũng do giảm mạnh sự lu hành của HAV. ở Việt nam nhiều nghiên cứu về HAV cũng đã đợc tiến hành và cho thấy HAV là nguyên nhân chủ yếu các trờng hợp viêm gan cấp tính (29%), 59% trong số đó có độ tuổi > 20 tuổi. Những nghiên cứu khác cho thấy 90% dân ở nông thôn có anti-HAV (IgG) thuộc tuổi thanh niên. Tình hình dịch tễ học HAV đang thay đổi ở nhiều nớc. Với việc tăng cờng tiêu chuẩn vệ sinh ở nhiều nớc tỷ lệ nhiễm HAV ở trẻ nhỏ đã giảm đi nhiều, thậm trí cả ở những nớc và vùng có dịch lu hành cao, song các 2 ổ dịch thấp đang xuất hiện. Do đó ở nhiều nớc đang chuẩn bị phải đón nhận các trờng hợp viêm gan A lâm sàng ngày càng tăng ở những trẻ lớn hơn và ngời lớn. Mặc dù đã có vắcxin tốt, song giá thành rất đắt và vì vậy không có khả năng tiêm đại trà đợc. Các sinh phẩm chẩn đoán viêm gan A hiện nay cũng rất đắt do đó cũng hạn chế việc sử dụng để thử nghiệm trớc khi tiêm phòng. Đề tài KHCN 11-10 đã nghiệm thu xuất sắc, nghiên cứu xây dựng đợc công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ PMMK, đảm bảo yêu cầu tối thiểu của TCYTTG về loại vắcxin này. Hiện nay, tiêu chuẩn Việt nam đề ra cho loại vắcxin này vẫn cha đợc dự thảo. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A trên nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát PMMK có nguồn cung cấp dồi dào trong nớc nhằm giảm giá thành của vắcxin là yêu cầu cấp thiết đợc đặt ra. Mặt khác hiện nay liều tiêm và lịch tiêm rất khác nhau giữa các vắcxin viêm gan A đợc sử dụng cũng nh sự cần thiết của liều tiêm nhắc lại vẫn đang là vấn đề cần nghiên cứu. Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết đó, dự án Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt quy mô 100.000 liều/năm có mục tiêu nh sau: 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt ở qui mô 100.000 liều/năm đạt tiêu chuẩn quốc tế. 2. Xây dựng tiêu chuẩn Việt nam cho vắcxin viêm gan A bất hoạt. 3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin trên thực địa lâm sàng, xác định lịch tiêm và liều tiêm phù hợp. Với những mục tiêu đó, Dự án có nội dung chính nh sau : 3 1.Hoàn thiện qui trình sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt từ nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát Maccaca mulatta : bổ sung trang thiết bị cần thiết để mở rộng sản xuất; nghiên cứu và xây dựng đợc các thông số hóa, lý, sinh học tối u; cải tiến một số công đoạn trong quy trình sản xuất để nâng cao công suất 2. Xây dựng tiêu chuẩn quốc gia thích hợp cho vắcxin viêm gan A bất hoạt về các thành phần hoá học (protein, formaldehyt, hydroxyt nhôm, pH), an toàn, công hiệu, vô khuẩn, chí nhiệt tố. Nghiên cứu tính ổn định về chất lợng và các thành phần của các loạt vắcxin viêm gan A do Việt nam sản xuất so sánh với tiêu chuẩn của TTYTTG. 3. Đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A trên thực địa lâm sàng giai đoạn III, theo dõi tính an toàn, phản ứng phụ, đáp ứng miễn dịch trên nhóm ngời tình nguyện, đánh giá hiệu lực của vắcxin viêm gan A với cỡ mẫu n = 300. Xác định liều tiêm và lịch tiêm phù hợp cho các đối tợng khác nhau. [...]... quan 1 Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan A 1.1 Lịch sử virút viêm gan A Hội chứng vàng da đã đợc mô tả trong lịch sử từ thế kỷ thứ 8 Tuy nhiên đến tận thế kỷ 17, 18 và 19 những vụ dịch vàng da lớn đã đợc mô tả đầy đủ hơn Năm 1947, Mac Callum đã a ra cụm từ viêm gan A và viêm gan B để phân biệt các loại viêm gan virút Những cụm từ này đã đợc Uỷ ban Viêm gan virút c a Tổ chức y tế thế giới công. .. c a viêm gan virút rất a dạng Q a trình nhiễm virút viêm gan cấp có thể chia thành 4 giai đoạn : (a) giai đoạn ủ bệnh gi a phơi nhiễm và ngày đầu tiên xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc vàng da ; (b) giai đoạn tiền lâm sàng ; (c) giai đoạn lâm sàng ; (d) giai đoạn hồi phục Thời gian ủ bệnh c a viêm gan A từ 10 đến 50 ngày, trung bình 1 tháng Tuy nhiên, lợng virút lớn xâm nhập sẽ làm rút ngắn giai... kháng thể bảo vệ anti-HAV sau khi tiêm phòng vắcxin viêm gan A có thể tồn lu tới hơn 20 năm sau tiêm phòng Khả năng bảo vệ kéo dài sau khi tiêm vắcxin viêm gan A là quan trọng để tránh sự thay đổi hình thái nhiễm trùng sang l a tuổi lớn hơn với khả năng tiến triển bệnh nặng hơn Uỷ ban t vấn về thực hành tiêm chủng c a Mỹ đã a ra kết luận rằng chiến lợc tốt nhất để giảm tỷ lệ mắc viêm gan A là tiêm chủng... cao men gan ALT và AST 1.5 Chẩn đoán Bởi vì tác nhân gây bệnh c a viêm gan virút thờng không thể phân biệt d a trên đặc điểm lâm sàng và bội nhiễm HAV có thể xẩy ra trên bệnh nhân nhiễm virút viêm gan B và C nên các thử nghiệm huyết thanh đợc tiến hành để xác định nguyên nhân Để chẩn đoán giai đoạn cấp c a nhiễm HAV, một dấu ấn quan trọng thờng đợc xác định là IgM anti-HAV Kháng thể này tăng cao nhanh... ngày sau đó và vàng 12 da niêm mạc Có thể gặp viêm gan kịch phát trong 6 đến 8 tuần c a bệnh gây ra sốt cao đột ngột, đau dữ dội, nôn, và vàng da tiếp theo là hội chứng não do viêm gan lên quan đén hôn mê sâu và chảy máu não Tỷ lệ chết cao liên quan đến tuổi, tỷ lệ sống sót rất hiếm đối với bệnh nhân trên 45 tuổi Chẩn đoán lâm sàng viêm gan virút cấp d a trên đánh giá chức năng sinh h a c a gan với... ondansetron Nếu thời gian chẩy máu kéo dài có thể sử dụng liều đơn vitamin K (10mg) Việc điều trị với viêm gan kịch phát vẫn cha thành công và tỷ lệ chết vẫn cao Việc sủ dụng neomyxin hoặc lactuloza theo đờng uống có thể làm giảm hàm lợng ammonia trong máu, do đó hạn chế hội chứng viêm não do viêm gan Điều trị rối loạn các yếu tố đông máu bằng cách sử dụng plasma tơi Bởi vì giảm glucoza huyết thờng hay... nhân lên c a phần lớn các biến chủng HAV là không gây thơng tổn hủy hoại tế bào ở các giòng tế bào nuôi Tế bào đơn nhân cũng xâm nhập vào bức tranh toàn cảnh trong tổ chức học c a viêm gan A cấp tính Mặc dù vai trò c a interferon trong điều trị viêm gan A cha đợc xác định rõ, song quá trình nhân lên c a HAV có lẽ là hoàn toàn nhậy cảm với interferon- (IFN) và IFN Tuy nhiên IFN không đợc sản xuất từ nguyên... quan đến việc sử dụng vắcxin viêm gan A Điều quan trọng nhất là xác định hiệu lực bảo vệ c a vắcxin kéo dài bao lâu và liệu mũi nhắc lại có cần thiết hay không Điều quan trọng thứ hai là xác định thời gian phù hợp để a vắcxin viêm gan A vào lịch tiêm chủng định kỳ cho trẻ nhỏ Cuối cùng, giá thành c a vắcxin cũng là một vấn đề cực kỳ quan trọng nhất là các nớc đang phát triển 20 Kháng thể anti-HAV... thấp ARN sợi kép phát hiện đợc đã chứng minh rằng có rất ít sợi ARN âm đợc tổng hợp Sau 14 ngày, có rất ít hoạt tính quá trình trao đổi chất c a virút Có nhiều cơ chế đã đợc a ra để giải thích cho sự sao chép 8 chậm HAV trong tế bào Có nhiều h a chất ảnh hởng đến quá trình sao chép c a virút nh guanidin, h a chất kháng virút, amantadin, monensin Từ những số liệu c a các thử nghiệm miễn dịch, HAV chỉ... ở những nớc đang phát triển và bệnh tản phát ở những vùng bệnh dịch ít xẩy ra hơn Vắcxin viêm gan A bất hoạt bằng formalin đã đợc chứng minh là an toàn và hiệu quả Đáp ứng miễn dịch với vắcxin viêm gan A có thể đạt tới hơn 90% sau một liều tiêm Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng một lịch tiêm nhiều liều là cần thiết để tạo ra một đáp ứng miễn dịch đủ lớn và kéo dài D a theo các công thức ớc . vắcxin viêm gan A bất hoạt quy mô 100. 000 liều/ năm có mục tiêu nh sau: 1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt ở qui mô 100. 000. dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc kc.10 da12 hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100. 000 liều/ năm Chủ