Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan B tái tổ hợp pdf

HBV cũng chịu trách nhiệm tới 90% các trường hợp ung thư gan nguyên phát, trong khi ở các nước đã tiến hành tiêm phòng vắcxin viêm gan B cho cộng đồng từ những năm đầu thập niên 80 thì c

Bộ khoa học và công nghệ bộ y tế

Chương trình khoa học và công nghệ

phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Báo cáo tóm tắt Dự án sản xuất thử nghiệm

Dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nước KC.10-DA.06

Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất

vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

Cố vấn khoa học: GS.TSKH Nguyễn Thu Vân

Chủ nhiệm dự án: TS.Ngô Thùy Anh

Các cán bộ tham gia: KS Trịnh Tuấn Việt

Cn Vũ Vân Quỳnh

Cn Vũ Hồng Nga

Cn Đinh Minh Tuấn

Cn Quách Minh Tuân

Ts Đỗ Thủy Ngân

Ts Vũ Hồng Cương

Các cơ quan tham gia:

- Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

- Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắcxin và các chế phẩm sinh học

- Trung tâm y tế dự phòng - Thanh Hóa

mục lục

Đặt vấn đề ……… 1

CHƯƠNG I: Vật liệu và phương pháp ………… 2

1 Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp.……… 2

2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam……… 3

2.1 An toàn chung 3

2.2 Kiểm tra vô khuẩn 3

2.3 Xác định hàm lượng HBsAg 3

2.4 Kiểm tra chất gây sốt 4

2.5 Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 4

2.6 Kiểm tra hàm lượng Merthiolat 4

2.7 Kiểm tra hàm lượng Formaldehyt 4

2.8 Kiểm tra hàm lượng protein toàn phần 4

2.9 Kiểm tra công hiệu 4

2.10 Thử nghiệm nhận dạng 5

3 Phương pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng ……… 5

3.1 Đối tượng nghiên cứu……… 5

3.2 Vật liệu nghiên cứu……… 5

3.3 Phương pháp nghiên cứu……… 5

CHƯƠNG II : Kết quả và bàn luận … … 7

1 Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 7

1.1 Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 7

1.2 Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 7

1.3 Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 7

1.4 Kiểm tra vỡ tế bào 8

1.5 Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 8 1.6 Pha chế vắcxin và đóng ống……… 12

2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

sản xuất tại Việt Nam……… 12

2.1 Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học……… 12 2.2 Xây dựng về các chỉ số sinh học……… 13

3 Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin

viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 14

3.1 Kết quả đánh giá tính an toàn……… 14 3.2 Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch

sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2……… 15

Chương III Kết luận …… 18

Tài liệu tham khảo ……… 21

mục lục

Đặt vấn đề ……… 1

Chương I: Tổng quan … 3

1 Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B … 3

1.1 Thông tin đại cương về virút viêm gan B 3

1.2 Lịch sử virút viêm gan B 3

1.3 Cấu trúc sinh học phân tử của virút B……… 4

1.4 Bệnh lý học 12

1.5 Dịch tễ học virút viêm gan B 12

1.6 Chẩn đoán viêm gan B 13

1.7 Các thể lâm sàng 14

1.8 Điều trị 15

1.9 Dự phòng 16

1.10 Chiến lược loại trừ lây truyền viêm gan virút B … 17

1.11 Phòng nhiễm virút viêm gan B 18

1.12 Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG) 18

2 Các loại vắcxin viêm gan B và những nghiên cứu về vắcxin viêm gan B hiện nay……… 18

2.1 Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu hướng phát triển……… 18

2.2 Tính an toàn của vắcxin viêm gan B……… 20

2.3 Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B……… 21

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của vắcxin phòng viêm gan B……… 23

3 Sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN để biểu thị kháng nguyên 26

3.1 Các hệ biểu thị khác nhau 26

3.2 Biểu thị ở nấm men 26

3.3 Biểu thị ở tế bào động vật 27

3.4 Hệ biểu thị ở Pichia pastoris 27

CHƯƠNG II: Vật liệu và phương pháp … 31

1 Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp.……… 31

1.1 Chủng sản xuất 31

1.2 Môi trường ……… 31

1.3 Cấy chủng ……… 33

1.4 Nhân chủng ……… 33

1.5 Biến nạp nội bào ……… 33

1.6 Gặt tế bào……… 34

1.7 Tách chiết HBsAg……… 34

1.8 Tinh chế HBsAg……… 34

1.9 Bất hoạt virút……… 35

1.10 Pha chế vắcxin……… 35

1.11 So sánh qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã được hoàn thiện với qui trình sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm …… 35

2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam……… 37

2.1 An toàn chung 37

2.2 Kiểm tra vô khuẩn 37

2.3 Xác định hàm lượng HBsAg 38

2.4 Kiểm tra chất gây sốt 38

2.5 Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)3 38

2.6 Kiểm tra hàm lượng Merthiolat 39

2.7 Kiểm tra hàm lượng Formaldehyt 39

2.8 Kiểm tra hàm lượng protein toàn phần 40

2.9 Kiểm tra công hiệu 40

2.10 Thử nghiệm nhận dạng 40

3 Phương pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng ……… 40

3.1 Đối tượng nghiên cứu……… 40

3.2 Vật liệu nghiên cứu……… 41

3.3 Phương pháp nghiên cứu……… 41

CHƯƠNG III: KếT QUả Và bàn luận 46

1 Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 46

1.1 Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 46

1.2 Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 46

1.3 Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 48

1.4 Kiểm tra vỡ tế bào 50

1.5 Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 50

1.6 Pha chế vắcxin và đóng ống……… 58

2 Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam……… 59

2.1 Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học……… 59

2.2 Xây dựng về các chỉ số sinh học……… 64

3 Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 68

3.1 Kết quả đánh giá tính an toàn……… 68

3.2 Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2……… 74

Chương IV Kết luận 78

Tài liệu tham khảo 81

Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen

(kháng thể kháng kháng nguyên lõi virút viêm gan B) Anti-HBe Antibody against Hepatitis B e antigen

(kháng thể kháng kháng nguyên e virút viêm gan B) Anti-HBs Antibody against Hepatitis B surface antigen

(kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B)

(tế bào trứng chuột đất vàng) CTTCMR Chương Trình Tiêm Chủng Mở Rộng

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

(thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym) FDA Food and Drug Administration

(c¬ quan qu¶n lý thuèc vµ thùc phÈm) GMP Good manufacturing practice

(thùc hµnh s¶n xuÊt tèt)

(hiÖu gi¸ trung b×nh nh©n)

(glycoprotein)

HBcAg Hepatitis B core antigen

(kh¸ng nguyªn lâi virót viªm gan B) HBeAg Hepatitis B e antigen

(kh¸ng nguyªn e virót viªm gan B) HBsAg Hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B) HBx Hepatitis B x antigen

(kh¸ng nguyªn x virót viªm gan B) HBIg Hepatitis B immunoglobulin

(globulin miÔn dÞch phßng viªm gan B) HLKN Hµm l−îng kh¸ng nguyªn

LHBs Large hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i lín)

LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle

MHBs Medium hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i trung b×nh)

(liÒu g©y chÕt tèi thiÓu)

SHBs Small hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i nhá) TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi

VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1

VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng

( Chñng s¶n xuÊt)

đặt vấn đề

Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ người mang HBsAg cao trong cộng đồng, theo các báo cáo của các tác giả khác nhau có thể giao động từ 11%-26% HBV vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong các căn nguyên gây viêm gan ở các bệnh nhân bị viêm gan, trên 40% có căn nguyên gây bệnh là HBV HBV cũng chịu trách nhiệm tới 90% các trường hợp ung thư gan nguyên phát, trong khi ở các nước đã tiến hành tiêm phòng vắcxin viêm gan B cho cộng đồng từ những năm đầu thập niên 80 thì căn nguyên chủ yếu gây ung thư gan nguyên phát hiện nay lại là virút viêm gan C, khi tỷ lệ người mang HBsAg đã giảm xuống dưới 1%

do kết quả tiêm phòng viêm gan B Tỷ lệ người mang ở phụ nữ có thai là khoảng 12%, trong đó nếu mẹ chỉ bị HBsAg dương tính không thôi thì khả năng truyền sang cho con trong thời kỳ chu sinh là khoảng 40%, và nếu mẹ mang cả HBsAg

và HBeAg dương tính thì khả năng truyền cho con sẽ là khoảng > 90%

Người mang HBV mạn tính có nguy cơ cao bị bệnh gan trầm trọng khi trưởng thành, bao gồm ung thư gan và xơ gan Tử vong và bệnh gây ra bởi bệnh gan mạn tính là rất phổ biến Cũng rất khó có thể nói được bệnh nào là do HBV gây ra vì tình trạng bệnh thường không được báo cáo đầy đủ Tuy nhiên rõ ràng

là nhiễm HBV là một vấn đề y tế cộng đồng quan trọng và có thể dự phòng được

Năm 1991, nhóm Cố vấn toàn cầu của Chương trình tiêm chủng mở rộng

đã kêu gọi tất cả các nước đưa thêm vắcxin viêm gan B vào Chương trình tiêm chủng quốc gia ở Việt Nam, chính phủ đã cho phép đưa vắcxin viêm gan B vào Chương trình tiêm chủng mở rộng để tiêm cho trẻ em dưới 1 tuổi từ tháng 8 năm

1997 Bên cạnh vắcxin viêm gan B sản xuất từ huyết tương người mang HBsAg cao, việc ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực công nghệ sinh học

để có được một vắcxin viêm gan B tái tổ hợp ADN là hết sức cần thiết nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng vắcxin ngày càng lớn trong nhân dân

Dựa trên kết quả đáng khích lệ của đề tài KHCN-11-10A (1999) và KHCN-11-10B (2002): “Nghiên cứu tiếp thu chuyển nhượng kỹ thuật để xây dựng qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A và vắcxin viêm gan B tái tổ hợp ADN”, vắcxin viêm gan B tái tổ hợp (RecomBvax) do Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương sản xuất có khả năng phục vụ rộng rãi cho nhu cầu phòng bệnh Việc bổ sung trang thiết bị để mở rộng sản xuất, hoàn thiện qui trình, đào tạo cán bộ KHCN nắm vững kiến thức và kỹ thuật

để ứng dụng được công nghệ sản xuất vắcxin là hết sức cần thiết Do đó, dự án

“Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp” có mục tiêu như sau:

- Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam

- Chuẩn bị năng lực khoa học công nghệ để tiếp thu dự án vay vốn của Hàn Quốc với công suất 20 triệu liều/năm

Nội dung chính của dự án là :

- Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam

- Đánh giá tính an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa ở giai đoạn 3, với cỡ mẫu n=300

- Đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học, công nhân kỹ thuật lành nghề nắm vững kiến thức và kỹ thuật để có thể tiếp nhận đ−ợc công nghệ và sử dụng trang thiết

bị trong dự án vay vốn của Hàn Quốc

Chương I Tổng quan

1 Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B

1.1 Thông tin đại cương về virút viêm gan B

Thời kỳ ủ bệnh : 30-180 ngày

Đường lây truyền : Máu và dịch tiết

Tấn công cấp tính : Nhẹ hoặc dữ dội

Chẩn đoán huyết thanh : Anti-HBc, anti-HBs hoặc HBsAg

Điều trị : Triệu chứng

1.2 Lịch sử virút viêm gan B

Danh từ viêm gan virút được hiểu là một nhiễm trùng gan do một trong những virút viêm gan khác nhau gây ra

Danh từ viêm gan B được MacCallum giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1947 nhằm phân biệt nhiễm viêm gan (gây thành dịch) và viêm gan huyết thanh Những danh từ này sau đó đã được ủy ban Viêm gan virút của TCYTTG sử dụng

Trước khi phát hiện ra virút, sự lây truyền viêm gan được phân biệt dựa vào quan sát theo dõi dịch tễ học Kiểu viêm gan B được coi như là lây truyền qua

đường máu

Vào năm 1963, khi nghiên cứu tính đa dạng các protein huyết thanh, Blumberg đã khám phá ra một protein chưa từng được biết trước đây trong máu của một thổ dân Australia Ông gọi protein này là kháng nguyên Australia (Au) Sau này người ta thấy kháng nguyên này có liên quan đến kiểu viêm gan B Đến năm 1968, các nhà nghiên cứu khác là Prince, Okochi và Murakami đã xác định

được kháng nguyên Au (ngày nay người ta gọi là kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B hoặc HBsAg) và được tìm thấy một cách đặc hiệu trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm viêm gan kiểu B

Vào năm 1973, Dane phát hiện ra các hạt kiểu virút trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm viêm gan B Những hạt này được gọi là virút viêm gan B (HBV) Những virút không có liên quan khác cũng đã được khám phá ra sau đó, song virút viêm gan B vẫn giữ tên của nó

Bản chất virút của các hạt này cũng đã được khẳng định, Kaplan et al đã xác

định được ADN polymeraza nội gen phụ thuộc ADN cùng với lõi của nó Việc khám phá ra polymeraza này cho phép Robinson et al xác định và đặc tính hoá

được genôm của HBV

Những nghiên cứu trên toàn cầu về chu trình nhân lên của HBV với quan tâm hàng đầu là sự kết dính và xâm nhập của virút vào tế bào chủ Những nghiên cứu lâm sàng cũng đang được tiến hành nhằm tìm ra được các phương pháp điều trị bệnh viêm gan B cấp tính hoặc mạn tính Các phòng thí nghiệm khác cũng đang nghiên cứu tìm kiếm cơ chế gây ung thư của HBV

1.3 Cấu trúc sinh học phân tử của virút viêm gan B

1.3.1 Genôm của virút viêm gan B

Genôm của virút viêm gan B được trình bày ở hình 1 Kích thước genôm giao động giữa các phân týp khác nhau của HBV, song tất cả đều có độ dài khoảng 3,2 Kb

ở viriôn của HBV người ta tìm thấy genôm ở dạng sợi kép không hoàn chỉnh Điều này có lẽ do tính chất riêng trong chu trình sống của HBV HBV sử dụng Transcriptaza phiên mã ngược để phiên mã toàn bộ độ dài ARN sợi dương trong genôm của nó ngược trở lại thành ADN Transcriptaza ngược này cũng có hoạt tính ADN polymeraza và nhờ đó bắt đầu một quá trình sao chép một ADN-sợi âm mới được tổng hợp Tuy nhiên protein lõi capsid hoá Transcriptaza phiên mã ngược/polymeraza trước khi hoàn thành quá trình sao chép

Khi nào và ở đâu ADN sợi kép một phần này của genôm được sửa chữa thành ADN khép kín đồng hoá trị vẫn còn chưa được biết

1.3.2 Quá trình sao chép genôm của HBV

Sự sao chép genôm HBV xảy ra bên trong nhân một tế bào bị nhiễm ARN polymeraza II phiên mã ADN sợi tròn của HBV thành một sợi ARNm lớn hơn độ dài đầy đủ Một khi đã được sao chép, ARN genôm có mặt trong nhân và xâm nhập vào bào tương, ở đó được phiên dịch để tái sinh polymeraza, protein lõi và

e của HBV

Từ trạng thái tự do, trước hết virút phải kết dính bản thân nó vào màng một tế bào chủ đặc hiệu Quá trình kết dính của virút là một trong những bước quan trọng để xác định tế bào chủ và tính đặc hiệu tế bào Tuy nhiên hiện nay cũng chưa có một giòng tế bào nào để HBV có thể gây nhiễm được in vitro Một vài giòng tế bào như HepG2 có thể hỗ trợ quá trình nhân lên của virút chỉ ở mức gây nhiễm ngắn ngủi hoặc sử dụng ổn định HBV.ADN

Sau khi kết dính, quá trình hoà nhập vỏ virút với màng tế bào chủ phải xẩy ra

để cho phép protein lõi của virút có chứa genôm và polymeraza xâm nhập vào tế bào Những nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình axít hoá là cho phép đối với

sự xâm nhập của virút, song các kết quả nghiên cứu hiện nay lại ngược lại Cũng không đáng ngạc nhiên khi những giai đoạn đầu tiên của quá trình nhiễm trùng vẫn còn nhiều tranh luận

Viriôn gây nhiễm, gọi một cách khác là hạt Dane có đường kính khoảng 42nm Như sơ đồ trên, có chứa tất cả các protein bề mặt của HBV cũng như protein lõi, genôm và polymeraza của HBV

1.3.4 Những hạt virút viêm gan B khác

Có hai loại hạt khác đã được tìm thấy trong huyết thanh của người bị nhiễm HBV và được gọi là hạt viêm gan B hình cầu và hạt viêm gan B hình ống Cả hai loại hạt này đều không có chứa bất kỳ một thông tin di truyền nào chứng tỏ chúng gây nhiễm Cả hai loại hạt đều có đường kính 22 nm, tuy nhiên hạt viêm gan B hình ống có độ dài thay đổi Mỗi loại hạt được cấu thành độc nhất từ các protein bề mặt của virút viêm gan B Hạt hình cầu tiết ra được cấu tạo chủ yếu từ protein bề mặt có kích thước nhỏ và trung bình trong khi hạt hình ống tiết ra có chứa cả protein bề mặt virút viêm gan B trọng lượng phân tử lớn Có thể tìm thấy những hạt này với hiệu giá cao trong máu những người mang HBV

Các hạt không gây nhiễm này có hiệu giá cao cho thấy virút phải được hình thành để sử dụng chúng theo một kiểu nào đấy Cũng có giả thiết cho rằng các hạt không gây nhiễm có hàm lượng cao trong huyết thanh cho phép các hạt virút gây nhiễm chạy ngang qua máu không xác định được bằng hệ miễn dịch Tuy nhiên theo mô hình mẫu virút viêm gan B ở vịt hình như có sự tăng nhanh nhiễm trùng khi virút được trộn ở tỷ lệ nào đó với các hạt không gây nhiễm Sự bám dính các hạt không gây nhiễm vào tế bào có thể để hoạt hóa tế bào, chuẩn bị sẵn sàng cho virút gây nhiễm Điều này cũng có thể đúng cho virút viêm gan B ở người, song vẫn chưa được kết luận

1.3.5 Protein lõi virút viêm gan B (HBc)

Protein lõi virút viêm gan B (HBc) được cấu tạo phần lớn từ axít amin ưa nước và tích điện Protein này không bao giờ được glycosyl hoá, cũng như không

có liên kết lipit nào Tuy nhiên trong các tế bào eukayriot có lẽ protein này được phosphoryl hoá

Protein này được tổng hợp trong bào tương và có thể lắp ghép với nhau thành hạt lõi có chứa genôm của virút Biểu thị protein HBc ở vi khuẩn cho thấy ARN lắp ráp theo một kiểu không đặc hiệu Khả năng lắp ráp hạt cư trú trong vòng 149 axít amin đầu Bốn cụm Arginin trong vòng 36-38 axít amin cuối có lẽ tham gia vào quá trình lắp ghép các axít nucleic

Quá trình phosphoryl hoá xẩy ra hoặc ở Serin thứ 170 hoặc 172 Các axít amin này khu trú giữa cụm Arginin 3 và 4 Vì thế quá trình phosphoryl hoá các

điểm Serin có thể ức chế quá trình gắn các axít amin

Những nghiên cứu sử dụng hệ lai kép cùng với kỹ thuật quét peptit đã xác

định được các axít amin tương tác mạnh (aa 78 và 117) có thể tạo thành một phần

bề mặt tiếp giáp dimer Ngược lại, các vị trí 113 và 143 có lẽ tham gia vào quá trình multimer hoá các dimer Đột biến ở hai vị trí này có lẽ đã tác động đến tính

ổn định của capsit

1.3.6 Protein e virút viêm gan B (HBe)

Virút hepadna biểu thị dạng tiết của protein HBc Điều này đạt được nhờ quá trình phiên dịch trình tự đầu 5’ vào ORF của HBc được gọi là trình tự tiền-C Trình tự tiền-C có chứa vị trí xuyên màng kỵ nước/tín hiệu tiết xuất dẫn đến di chuyển protein HBe vào trong lòng ống mô lưới nội bào (ER)

Trong ER, vị trí 19 trong 29 vị trí vùng tiền -C được cắt ra nhờ một tín hiệu peptidaza trong khi 10 vị trí còn lại ngăn ngừa việc lắp ráp HBe vào hạt lõi Một vùng khác sau này được cắt ra bằng một proteaza Golgi ở vùng giàu Arginin Sản xuất các thể tiết xuất này của HBc có thể bằng cách nào đấy đã đàn áp

sự đào thải miễn dịch của tế bào sản xuất - HBV HBe ở hàm lượng cao được tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm HBV huyết cao với ít triệu chứng Đồng thời, cáo đuôi chồn sẽ không phải chịu đựng nhiễm dai dẳng virút viêm gan B, nếu sử dụng phương án HBe-âm của virút

1.3.7 Hạt lõi

Hạt virion tinh khiết có chứa protein HBc tạo ra các hạt lõi bao bọc genôm

và polymeraza của virút ở virion trưởng thành, hạt lõi này được tạo vỏ bọc bằng nhiều kháng nguyên bề mặt khác nhau của HBV Hơn nữa có thể một protein-kinaza cũng được bao vào trong hạt lõi Có lẽ một nồng độ HBc nhất định là cần thiết cho quá trình lắp ráp hạt Các dimer của protein HBc bắt đầu được hình thành, lắp ráp ở nồng độ 0,8 àM thành các hạt đẳng điện đối xứng không gian ba chiều (180 tiểu đơn vị HBc tạo thành một hạt lõi) Các hạt lõi đã lắp ghép sau đó

được làm ổn định nhờ các cầu nối disulphid

Hiện nay, người ta thấy một cách rõ ràng hơn là vùng tiền -S1 và S của protein vỏ bọc sẽ tương tác với hạt lõi Điều này cũng không có gì đáng ngạc nhiên vì hạt lõi phải được lắp ghép một cách đặc hiệu bởi màng giàu protein bề mặt của HBV để có thể sản sinh ra được các viriôn trưởng thành

1.3.8 Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B

Sơ đồ sau đây là các kiểu khác nhau của kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B Trong genôm của HBV, vùng mã hoá kháng nguyên bề mặt HBV gồm ba khung bắt đầu từ các vị trí có chung một codon kết thúc Bởi vậy, các protein bề mặt khác nhau của HBV đều có liên quan đến nhau bởi một vùng chung nhau như đã biết là vùng S

1.3.8.1 Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (HBsAg hay là SHBsAg)

Protein này là loại protein nhỏ nhất trong số các protein bề mặt virút viêm gan B và có chứa độc nhất vùng-S Trong lịch sử nó cũng được gọi là kháng nguyên Australia (kháng nguyên Au) Là kháng nguyên kỵ nước chứa 4 vùng xuyên màng có trật tự HBsAg chứa một lượng lớn Cystein, tổng số là 14 và từng Cystein có liên kết chéo với một Cystein khác HBsAg cũng có thể được glycosyl hoá ở Asp 146 Hai dạng protein này thường nhìn thấy được trên gel chạy điện di

với hạt HBsAg tinh khiết từ huyết tương người mang Protein này là đoạn khởi

đầu lập thành tất cả các dạng hạt của HBV, vì vậy protein này được sản xuất với một lượng lớn ở virút Nó cũng chứa epitop có tính kháng nguyên cao Phân tích epitop này cho phép xác định được phân týp của người mang HBV

Vi tính hoá mô hình cho thấy liên quan đến các đường xoắn ốc 3 và 4 là vùng xuyên màng ngăn nắp được gài vào màng ER sau giai đoạn phiên dịch Hai vòng xoắn này được xem như là vị trí thực hiện quá trình multimer hoá Điều này

được củng cố thêm nhờ quan sát HBsAg bị xén bớt vùng xoắn ốc này sẽ không

có khả năng tạo thành các hạt và sẽ ở lại màng ER Tế bào bị nhiễm ở giai đoạn sớm sản sinh ra một lượng lớn nhất protein Hiệu giá hạt HBsAg không gây nhiễm tìm thấy trong huyết thanh người mang có thể cao tới 200àg/ml Biểu thị HBsAg có thể cũng được cảm ứng nhờ một chấn động trong lòng ống lưới nội bào, điển hình là khi LHBsAg có ở lượng lớn

Mặc dù những hạt này có tính kháng nguyên và tỷ lệ mắc cao, song hệ miễn dịch hình như về cơ bản đã quên lãng sự có mặt của chúng Nghiên cứu các yếu

tố hoà tan điều chế từ tế bào lyphô T khi có nhiễm HBV cho thấy HBsAg có nguồn gốc từ tế bào T có lẽ đã ngăn chặn sự sản sinh ra kháng thể kháng HBsAg trong các tế bào T khác Sự ngăn chặn này là đặc hiệu đối với HBsAg Sự kiềm chế miễn dịch của các kháng thể kháng các thành phần khác nhau của HBV thường dai dẳng ở người có tình trạng mang HBsAg mạn tính

Gen khởi động S nằm trong vùng tiền-S Đột biến ở vùng này sẽ dẫn đến HBsAg được sản sinh ra với mức thấp Sản xuất HBsAg giảm đi có lẽ làm cho

virút ứ đọng trong nội bào cũng như mất khả năng lắp ráp các hạt virút

Các phân týp của SHBsAg đã được xác định nguồn gốc bằng sự nhận biết kháng thể Vùng kháng nguyên có mặt ở tất cả các phân lập HBs đã biết được gọi

là quyết định kháng nguyên a Bốn phân týp chủ yếu khác nhau là d hoặc y và w hoặc r Hai bộ này được cặp đôi theo kiểu thành viên của mỗi cặp sẽ loại trừ lẫn nhau Quyết định d có Lysin ở vi trí 122, trong khi y có Arginin Tương tự, quyết

định w có Lysin ở vị trí 160 trong khi r có Arginin Hiện nay người ta cũng đã tìm thấy các quyết định khác có chứa các epitop kháng nguyên không được nhận biết bởi các kháng thể kháng lại các phân týp đã được biết trước đây Với cách nhận định như vậy, một số kháng thể đặc hiệu phân týp đặt vấn đề : liệu vắcxin

sử dụng hạt HBs có gây được đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở người với tất cả các chủng HBV không ? Câu trả lời là “có” Tuy nhiên cũng vào những năm này kiểu

đột biến “chạy thoát” (escape) đã được phát hiện cho chúng ta thấy rằng cần phải

có vắcxin hoặc phương pháp điều trị hiện đại hơn

1.3.8.2 Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại trung bình (MHBsAg)

Protein bề mặt virút viêm gan B loại trung gian hoặc kích thước trung bình này có chứa thêm một vùng 55 aa đã được biết là tiền -S2 Vùng này ưa nước và

có lẽ cư trú ở ngoại bào Vùng tiền-S2 cũng có một vị trí glycosyl hoá bổ xung ở Asp 4 Có thể vị trí này luôn luôn được glycosyl hoá, song vị trí glycosyl hoá ở

vùng S có lúc ở dạng glycosyl hoá hoàn toàn, có lúc ở dạng glycosyl hoá một phần protein này

Một số nghiên cứu cho rằng protein MHBsAg tham gia vào quá trình kết dính và xâm nhập của HBV vào tế bào gan Tuy nhiên, trong một nghiên cứu phân tích di truyền HBV ở bệnh nhân viêm gan bạo phát, codon khởi đầu tiền-S2

có mang một biến dị đúp ngăn cản biểu thị protein tương ứng Như vậy, có lẽ tiền-S2 không cần thiết cho tính gây nhiễm của HBV cũng như hình thái của hạt virút Điều này có thể loại trừ HBsAg trung bình là protein kết dính của HBV, mặc dù nó có thể chia sẻ với quá trình kết dính virút theo kiểu cơ chế thứ phát

1.3.8.3 Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại lớn (LHBsAg)

Đây là protein lớn nhất trong số protein bề mặt của HBV có chứa vùng S1, tiền-S2 và S Trình tự vùng tiền-S1 có thể giao động rất lớn trong số bệnh nhân bị nhiễm cho thấy rằng có thể đây là protein của HBV tham gia vào quá trình kết dính vào tế bào gan Vùng tiền-S1 không có vị trí glycosyl hoá bổ sung, song có chứa tín hiệu myrin hoá ở đầu cuối -N, buộc đầu cuối -N vào màng tế bào

Có giả thiết về hai kiểu sắp xếp của protein này : Một kiểu tìm thấy trên bề mặt tế bào và trong viriôn trưởng thành, kiểu khác tìm thấy trên bề mặt của hệ thống lưới nội bào (ER) Các kiểu sắp xếp được ghi chép dựa trên những nghiên cứu proteaza và kháng thể ở virút viêm gan B của vịt, LHBsAg có kiểu họa đồ lưỡng cực Có lẽ cả hai vùng tiền-S1 và tiền-S2 ở lại trong nội bào khi LHBsAg ở trong ER Vì vậy, vùng tiền-S2 không được glycosyl hoá trong khi vùng tiền-S1

được myrin hoá Khi nào, ở đâu và như thế nào vùng tiền-S được di chuyển qua màng tế bào vẫn còn là một vấn đề cần tranh luận Tuy vậy, một mô hình giả thiết cho virút viêm gan B ở vịt cũng đã được thiết lập Mô hình này cho biết vùng tiền-S được di chuyển qua một lỗ nước trong vỏ của virút Lỗ này được hình thành nhờ quá trình oligomer hoá các vùng trải rộng xuyên màng trong vùng S Biểu thị dư thừa LHBsAg không thôi, dẫn đến ứ đọng protein này trong ER Tuy nhiên, lúc đầu người ta nghĩ rằng sự ứ đọng trong ER là do một yếu tố bào tương liên kết LHBsAg như một protein xuyên màng Tuy vậy, các chứng minh mới

đây cho rằng quá trình hình thành các hạt trong nội bào của LHBsAg xẩy ra trong lòng ống của lưới nội bào Sự ứ đọng có lẽ do liên kết LHBsAg với calnexin Protein này, theo đa số ý kiến, là protein chịu trách nhiệm cho sự kết dính của virút vào tế bào chủ Tuy nhiên, thụ thể cho HBV vẫn chưa phân lập

được

1.3.9 Polymeraza của virút viêm gan B

Protein polymeraza của HBV được lắp ráp cùng với ARN tiền genôm trong hạt lõi Polymeraza trong virion trưởng thành có kích thước 90 KD và có lẽ là ARN- hoặc ADN-phụ thuộc (có nghĩa là Transcriptaza phiên mã ngược) Có thể nhìn thấy một băng protein có trọng lượng phân tử 70 KD trên điện di trên gel blot với

• Vùng đầu kết thúc amino mã hoá một protein liên kết với đầu 5’ của ADN-sợi âm của virút Protein này là thiết yếu để khởi đầu cho quá trình tổng hợp sợi âm, vì vậy cũng được gọi là “primaza”

• Vùng tiếp theo có lẽ có chức năng không đặc hiệu trừ khi đó có thể là một khoảng trống

• Vùng này mã hoá ARN-polymeraza hoặc ARN-polymeraza phụ thuộc ADN

• Vùng cuối cùng có hoạt tính H-ARN-aza hoá giáng ARN nếu nó có mặt trong một thể lai ghép ARN và ADN

Có thể hoạt tính của protein polymeraza phụ thuộc vào ion kim loại và phần

có cấu trúc hình cong kiểu elíp Yêu cầu phải có tín hiệu elíp này để hoạt hoá polymeraza cũng đã được chứng minh ở hệ virút viêm gan B của vịt Ion Magnesium có lẽ là cần thiết cho quá trình sao chép ngược

1.3.11 Protein X của virút viêm gan B

Protein X của HBV được gọi như vậy vì chức năng đầy đủ của nó vẫn còn là một điều bí mật Protêin X có 154 axít amin được mã hoá bởi ORF-X Trình tự của nó không thay đổi ở cả hai loại virút viêm gan của sóc và chuột chũi, song virút viêm gan ở vịt không có HBx Điều này ngụ ý rằng protein HBx không tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép genôm và lắp ráp virion

Trên quan điểm triết lý di truyền học cho thấy gen HBx là một sự bổ sung tức thời từ genôm của tế bào eukariot vào genôm của HBV mà ngược lại là hoàn toàn không thay đổi Không có một chứng cớ nào chứng tỏ protein HBx là thành phần của virion trưởng thành hoặc hạt lõi Phân tích aa cho thấy protein HBx có nguồn gốc bào tương Những nghiên cứu về protein HBx cho biết rất khó biểu thị protein này in vitro và rất không ổn định với thời gian bán hủy hoại rất ngắn -

20 phút Tuy nhiên, nó có thể phosphoryl hoá

Sợi trên của gen này có một vùng đã biết là vùng tăng cường I của HBV, có chứa một số trình tự hoạt hoá phần Cis- cho việc biểu thị gen của HBV có hiệu quả Có thể một tỷ lệ vùng tăng cường này là trung gian cho quá trình phiên mã gen X của HBV Protein này có nhiều hoạt tính dư thừa từ Dinucleotit-kinaza đến

ức chế proteaza Phần lớn những luận điểm này cần phải được nghiên cứu sâu hơn nữa Tuy nhiên, cũng có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng HBx protein

hoạt hoá quá trình phiên mã của nhiều gen Có thể có một kiểu là qua HBx tăng cường khả năng liên kết ADN và hiệu quả phiên mã qua tác động tương hỗ với vùng dây kéo Leucin (bZcp) của nhiều yếu tố phiên mã Có lẽ khả năng đáng ghi nhận nhất của protein HBx là hoạt tính gây khối u Hoạt tính này đã được chứng minh ở nuôi cấy tế bào gan chuột và ở chuột truyền gen Một con đường có khả năng là qua sự hoạt hoá Src-kinaza Người ta cho rằng protein HBx tác động tương hỗ với Ras-Raf-kinaza Liệu sự kích thích sinh trưởng này có xẩy ra ở các khối u hay không vẫn đang được xem xét

Một số công trình cho rằng HBx gây cảm ứng ARN polymeraza III-phụ thuộc phiên mã gen qua sự hoạt hoá đường tín hiệu Ras Điều này dẫn đến làm tăng mức độ protein liên kết TATA trong tế bào Protein X cũng có liên quan đến việc điều hoà quá trình phiên mã trung gian Sp1 của Insulin-kiểu yếu tố sinh trưởng II (IGF-II) Điều hoà gen IGF-II có thể khởi động sự phân chia tế bào trong quá trình phát triển của tổ chức gen

1.4 Bệnh lý học

Bệnh lý học của cả viêm gan cấp tính và viêm gan virút đều đang được tháo

gỡ một cách chậm chạp Hơn nữa phần lớn các số liệu đều cho thấy rằng các thành viên họ Hepadnaviridae về bản chất đều không có tính gây độc cao

Virút được lây truyền một cách có hiệu quả nhất qua đường xuyên da Truyền nhiễm qua đường tình dục và chu sinh là ít có hiệu quả hơn, đặc biệt đòi hỏi hiệu giá virút phải cao HBV có nồng độ đậm đặc nhất trong gan và máu và với số lượng ít hơn trong nước bọt và tinh dịch

Hoàn toàn không có gì đáng ngạc nhiên khi virút viêm gan nhân lên đầu tiên

ở gan Tuy nhiên, nhiều vị trí khác nhau ngoài gan cũng đã được đề cập đến

Điều này cũng đúng cho hàng loạt những thay đổi huyết học thỉnh thoảng thấy ở bệnh nhân viêm gan cấp tính

Các sản phẩm trung gian và/hoặc phiên bản của virút trong quá trình nhân lên của HBV cũng tìm được ở các vị trí ngoài gan

1.5 Dịch tễ học virút viêm gan B

Viêm gan B được lan truyền trong cộng đồng người trên toàn thế giới Mặc

dù có nhiều báo cáo cho thấy rằng HBsAg có cả ở những động vật bậc cao khác nữa, song người vẫn là ổ chứa chủ yếu ở những nước phát triển hơn, tỷ lệ nhiễm HBV đã giảm đi, có lẽ do thay đổi cách sống của nhóm có nguy cơ cao, vắcxin viêm gan B đã sẵn có cùng với việc sàng lọc những người cho máu

Nguồn HBV đầu tiên là máu Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm thấy virút trong hàng loạt dịch tiết cơ thể như nước bọt, nước mũi, tinh dịch và máu hành kinh Người ta không tìm thấy virút trong phân, có lẽ do virút đã bị bất hoạt bởi các enzym có trong niêm mạc ruột hoặc khuẩn trí đường ruột Có thể giả thiết một cách chắc chắn rằng virút có mặt trong tất cả các dịch tiết của một bệnh nhân bị nhiễm Máu bị nhiễm của một người mang HBeAg dương tính có hiệu

1.7 Các thể lâm sàng

1.7.1 Viêm gan cấp tính

Tiến triển lâm sàng của HBV cũng tương tự như viêm gan A (HAV), song sẽ trầm trọng hơn và có thể có liên quan với các triệu chứng như kiểu bị bệnh huyết thanh Những kiểu tấn công nhẹ nhất không có biểu hiện lâm sàng và chỉ có thể xác định được bằng mức tăng transaminaza trong huyết thanh Nói cách khác bệnh nhân có thể không vàng da nhưng sẽ bị mắc các triệu chứng kiểu bệnh cúm

và viêm ruột- dạ dày Những bệnh nhân này thường không chẩn đoán được trừ khi có một tiền sử mắc bệnh rõ ràng Mức độ trầm trọng của bệnh có thể thay đổi

từ không có triệu chứng và vàng da (ở những người được hồi phục một cách điển hình) cho đến bạo phát và tử vong Thể tấn công vàng da ở người lớn được đánh dấu bằng một thời kỳ triệu chứng tiền lâm sàng (điển hình từ 3-4 ngày cho đến 2-

3 tuần) Trong thời kỳ này, bệnh nhân cảm thấy mệt mỏi, bị mắc các triệu chứng

về đường tiêu hoá như chán ăn, buồn nôn và có thể sốt Những triệu chứng chung như sốt, rét, chán ăn, không thích uống rượu và hút thuốc, mệt mỏi và thỉnh thoảng đau đầu nặng Thời kỳ tiền triệu có kèm theo nước tiểu sẫm mầu và phân bạc, vàng da tiến triển

1.7.2 Viêm gan bạo phát

Rất ít thể bệnh xẩy ra với bệnh nhân trong vòng 10 ngày Thể này có thể tiến triển nhanh đến nỗi vàng da không nhận thấy được và có thể nhầm lẫn với rối loạn tâm thần cấp tính hoặc viêm màng não mủ cấp tính Mặt khác bệnh nhân có thể bị vàng da trầm trọng Những biểu hiện của cơ thể lặp lại như nôn, hơi thở hôi, chứng lẫn và buồn ngủ Hiện thượng run rẩy có thể chỉ thoảng qua, nhưng co cứng là thường xuyên Những hiện tượng này sau đó sẽ bị gián đoạn bởi hôn mê chứng tỏ gan bị tổn thương trầm trọng Thân nhiệt của bệnh nhân tăng, vàng da trầm trọng và teo gan, có thể kèm theo xuất huyết lan tỏa Bilirubin và Transaminaza là những dấu hiệu tiên lượng kém vì mức Transaminaza có thể giảm đi thật trong khi tình trạng lâm sàng của bệnh nhân lại kém đi Promthrobin

là dấu hiệu tiên lượng tốt nhất Tần suất quá trình viêm gan bạo phát khác nhau phụ thuộc vào kiểu viêm gan virút và tỷ lệ mắc viêm gan B

1.7.3 Triệu chứng hậu viêm gan

Bệnh nhân lớn tuổi cảm thấy khá hơn đối với những khoảng thời gian khác nhau sau viêm gan cấp tính Điển hình là thời kỳ này kéo dài vài tuần và có thể

đến hàng tháng Những hình ảnh chung là lo âu, mệt mỏi, sút cân, biếng ăn, sợ rượu và khó chịu vùng sườn phải trên, bờ gan có thể bị đau Transaminaza huyết thanh có thể cao gấp 3 lần mức bình thường Tổ chức mô tế bào gan thay đổi nhẹ,

có hiện tượng viêm và xơ hoá, đôi khi có thay đổi thành phần mỡ trong tế bào gan Những điểm này cũng không khác so với bệnh nhân đã bình phục và cả bệnh nhân hết triệu chứng Không được tiến hành làm sinh thiết gan trong vòng 6

tháng sau viêm gan cấp vì có thể gặp khó khăn trong việc phân biệt những thay

đổi còn lại sau một viêm gan cấp và một viêm gan tiến triển

1.7.4 ứ mật kéo dài

Thỉnh thoảng vàng da kéo dài là kết quả của kiểu ứ mật Khởi đầu bệnh là cấp tính, song vàng da trầm trọng và trong vòng 3 tuần đầu bệnh nhân bắt đầu bị ngứa Sau một vài tuần đầu bệnh nhân cảm thấy khoẻ mạnh, lên cân và không có biểu hiện lâm sàng trừ vàng da và gan hơi to Hiện tượng vàng da dai dẳng từ 8-

29 tuần, sau đó là giai đoạn phục hồi

1.7.5 Tái phát

Một số trường hợp tấn công ban đầu được nhân gấp đôi, song điển hình ở thể trung bình vào khoảng 1,8%-15% các trường hợp Thông thường sự tái phát đơn giản chỉ thấy được do Transaminaza và Bilirudin huyết thanh tăng Hiện tượng tái phát có thể là kết quả của một hoạt tính yếu hoặc uống một lượng rượu quá nhiều Sự tái phát nhiều lần có thể xẩy ra, tuy nhiên bệnh nhân có thể bình phục sau tái phát ở một số bệnh nhân, tái phát là dấu hiệu của quá trình tiến triển thành viêm gan mạn tính

1.7.6 Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC)

Ung thư biểu mô tế bào gan là một cụm từ kỹ thuật của ung thư gan Thể bệnh này phát triển ở các cá thể sau một thời gian dài bị nhiễm viêm gan B mạn tính Những yếu tố nào đã thúc đẩy căn bệnh này, hiện nay chưa biết

Một loạt các yếu tố đã được sử dụng để điều trị HBV mạn tính Mục đích của

điều trị gồm ba mức: hạn chế nhiễm trùng và lây truyền HBV sang người khác, ngăn chặn viêm gan tiến triển và cải thiện tiên lượng lâm sàng, ngăn ngừa phát triển ung thư gan (HCC)

Hiện nay điều trị bằng Interferon là một chọn lựa về phương pháp trị liệu cho những người viêm gan HBV mạn tính tiến triển Liều Alpha-interfron điều trị có thể giao động từ 7 triệu đơn vị đến 30 triệu đơn vị/m2. Các nghiên cứu cho thấy

điều trị bằng liều cao (>15 triệu đơn vị/m2) xem ra có hiệu quả hơn liều thấp Tuy nhiên, bệnh nhân dương tính với HBsAg và âm tính với HBeAg và ADN hình như không có lợi khi điều trị bằng Interferon Bên cạnh đó, những người bị

viêm gan B bạo phát hoặc viêm đa động mạnh kết nối sẽ không có hiệu quả gì khi điều trị theo phác đồ này

Hiện nay có một loại thuốc đã biết là Lamivudine đang được thử nghiệm trên thực địa ở giai đoạn ba Trị liệu bằng Lamivudine đang được nghiên cứu như

là một phương pháp khả quan để điều trị những người viêm gan B mạn tính Hơn nữa đã có những bằng chứng về sự dung nạp và ngăn chặn được sự nhân lên của virút trong quá trình điều trị Cũng có biểu hiện là kháng nguyên e và sự sản sinh

ra HBs cũng giảm đi ở bệnh nhân được điều trị lâu dài Những nghiên cứu sau này nhằm mục đích có được một hình ảnh tốt hơn về hiệu quả điều trị của loại thuốc này khi sử dụng liều cao hơn và thời gian kéo dài hơn

Mặc dù cũng đã có được hy vọng nhỏ, song không một phương pháp điều trị nào được gọi là chữa khỏi bệnh Thực tế việc chữa khỏi bệnh này vẫn chưa nắm bắt được

1.9 Dự phòng

HBV được tìm thấy trong hầu hết các dịch tiết của cơ thể, đặc biệt là máu vì vậy phải rất thận trọng khi tiếp xúc với máu, sản phẩm của máu hoặc dịch tiết cơ thể người Như một nguyên tắc chung, tất cả máu và dịch tiết cơ thể người phải

được xử lý như là chúng có chứa các tác nhân gây nhiễm khác nhau như HIV và HBV Những bề mặt nghi ngờ bị nhiễm phải được tẩy trùng và làm sạch

Hiện nay phương pháp tốt nhất để phòng ngừa nhiễm HBV là tiêm vắcxin Vắcxin chung nhất hiện nay trên thị trường được điều chế từ nguồn nấm men tái

tổ hợp Protein bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (SHBs) được sản xuất trong tế bào nấm men Biểu thị protein này ở nấm men dẫn đến hình thành các hạt SHBs Tuy nhiên các hạt này không được nấm men tiết ra Phá vỡ tế bào nấm men nhằm giải phóng các hạt hình cầu đã được sản xuất vào dung dịch Những hạt này sau

đó được làm tinh khiết nhờ các bước làm sạch, siêu lọc, sắc ký và siêu ly tâm Các hạt tinh khiết sau đó được hấp phụ với Hydroxyt nhôm và bảo quản bằng Merthiolate

Hai loại vắcxin điều chế từ nấm men được cấp bằng ở phần lớn các nước là Engerix-B (SmithKline Beecham, Philladelphia, P.A) và Recombivax HB (Merck

& Co., West Point, P.A) Cả hai sản phẩm đều tương tự về mặt cấu trúc và thành phần hoá học với hàm lượng protein nấm men còn lại trong dung dịch ít hơn 2% Tuy nhiên Recombivax HB được sử lý với Formaldehyt trước khi cho hấp phụ với nhôm Cả hai đều là sản phẩm từ nấm men, protein-S không được glycosyl hoá (vì nấm men không chế biến theo cơ chế đúng của giai đoạn sau phiên dịch để làm việc này) Đây là những vắcxin hoàn toàn có hiệu lực cho phép gây được miễn dịch phòng ngừa HBV Tuy nhiên không được làm đông băng vắcxin vì như vậy sẽ làm tổn hại đến tính miễn dịch Nhiều nghiên cứu cho thấy làm đông băng

sẽ dẫn đến làm giảm đáp ứng miễn dịch Cũng có nhiều kiểu gây miễn dịch và các loại vắcxin khác, song những vắcxin nêu trên có lẽ nhìn chung là có hiệu lực nhất và được sử dụng rộng rãi nhất

Lịch tiêm vắcxin điển hình là các tháng 0, 1 và 6 hoặc 0, 1, 2 và 10 Lịch tiêm 0, 1 và 6 dùng tốt hơn để phòng bệnh trước khi bị phơi nhiễm Lịch tiêm 4 liều có thể dùng tốt cho những người thỏa hiệp miễn dịch hoặc sau khi bị phơi nhiễm Người ta cũng khuyến cáo một liều nhắc lại mỗi 5 năm hoặc 7 năm sau mũi tiêm đầu Trẻ em cũng có thể tiêm phòng theo phương thức này

Tuy nhiên cũng có một vài báo cáo về phản ứng phụ của vắcxin điều chế từ nấm men Các phản ứng phụ có thể là phản ứng da, khớp, mạch máu, mắt, huyết học và thần kinh

1.10 Chiến lược loại trừ lây truyền viêm gan virút B

Một chiến lược toàn diện đề phòng nhiễm HBV, viêm gan B cấp tính và những hệ quả của nó là phải loại trừ được lây truyền xẩy ra ở lứa tuổi nhi đồng và thiếu niên, cũng như ở thanh niên và người lớn ở Mỹ người ta đã chứng minh rằng lây truyền HBV không thể ngăn ngừa được bằng cách tiêm vắcxin chỉ cho nhóm có nguy cơ lây nhiễm cao Hiện nay không có phương pháp điều trị y học nào có thể loại trừ được nhiễm HBV mạn tính cũng như ngăn chặn nguồn nhiễm mới ở những người cảm thụ Vì vậy những trường hợp nhiễm mới chỉ có thể ngăn ngừa bằng cách gây miễn dịch với vắcxin viêm gan B cho những người dễ cảm thụ Thăm khám thường kỳ trước khi đẻ và chăm sóc tốt trẻ em phải là mục đích của việc dự phòng viêm gan B

Một chiến lược dự phòng đầy đủ bao gồm :

a) Kiểm tra các bà mẹ có thai trước khi sinh về HBsAg để xác định những trẻ sơ sinh cần phải được ngăn ngừa lây nhiễm trong thời kỳ chu sinh bằng phương pháp dự phòng miễn dịch và xác định những người tiếp xúc trong gia đình cần phải tiêm vắcxin

b) Tiêm vắcxin thường xuyên cho trẻ sinh ra từ các mẹ HBsAg-âm tính

c) Tiêm phòng vắcxin cho một số thanh niên

d) Tiêm vắcxin cho người lớn có nguy cơ lây nhiễm cao

Trẻ nhỏ và trẻ em cần được tiêm vắcxin trong những lần thăm khám định kỳ, không cần phải có những lần thăm khám bổ sung Việc thực thi chiến lược gây miễn dịch này dễ dàng đi rất nhiều nhờ sự phát triển và sử dụng vắcxin nhiều kháng nguyên (như bạch hầu-uốn ván-ho gà/ DTP / viêm gan B / Haemophilus influenzae týp b / viêm gan B) Những vắcxin này sẽ làm giảm số lần tiêm ở trẻ

em, giảm giá quản lý phí và việc phân phối vắcxin rộng rãi dễ dàng đi rất nhiều Vì đại đa số nhiễm HBV xẩy ra ở người lớn, việc kiểm soát bệnh cần được tăng cường bằng việc tiêm vắcxin khẩn cấp ở nhóm cộng đồng có nguy cơ như thanh niên và những người cảm thụ tiếp xúc với người mang HBV mạn tính Khuyến cáo tiêm vắcxin đại trà cho trẻ không loại trừ tiêm vắcxin cho người lớn

được xác định là có nguy cơ cao, cũng như các khuyến cáo trước đây về dự phòng sau khi tiếp xúc với HBV

Việc giảm tỷ lệ viêm gan B cấp tính và viêm gan B có liên quan đến bệnh gan mạn tính là kết quả của việc tiêm đại trà cho trẻ em có thể thấy rõ trong

nhiều năm Tuy nhiên, giám sát đại trà HBsAg ở phụ nữ có thai để phòng nhiễm HBV chu sinh cho thấy đã tiết kiệm được và ước tính giá thành tiêm vắcxin đại trà cho trẻ em rẻ hơn giá thành việc chăm sóc y tế trực tiếp và nghỉ làm việc có liên quan Hiện nay giá một liều vắcxin viêm gan B cho trẻ em phân phối ở khu vực Nhà nước cũng tương đương các vắcxin khác cho trẻ em Tiêm vắcxin cho thanh niên và người lớn thường đắt hơn do giá vắcxin cao hơn và chi phí thực hiện cao hơn ở nhóm đích trong cộng đồng Sau này việc tiêm đại trà vắcxin cho trẻ em có lẽ hạn chế được nhu cầu tiêm vắcxin cho thanh niên và người lớn tuổi

1.11 Phòng nhiễm virút viêm gan B

Có hai loại sản phẩm dùng để dự phòng nhiễm HBV Vắcxin viêm gan B dùng

để bảo vệ lâu dài đối với nhiễm HBV và khuyến cáo dùng để dự phòng cả trước

và sau khi phơi nhiễm HBIG dùng để bảo vệ tạm thời (có nghĩa là 3-6 tháng) và chỉ định dùng cho một vài trường hợp sau phơi nhiễm

1.12 Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG)

HBIG được điều chế từ huyết tương người có hiệu giá kháng thể kháng HBsAg (anti-HBs) cao ở Mỹ, HBIG có hiệu giá anti-HBs > 100.000 bằng thử nghiệm

đồng vị phóng xạ Huyết tương người dùng để điều chế HBIG phải được kiểm tra kháng thể kháng HIV, ngoài ra qui trình dùng để điều chế HBIG phải bất hoạt

được và loại trừ được HIV ở thành phẩm cuối cùng Không có một chứng cớ nào chứng tỏ HIV có thể lây truyền qua HBIG

2 Các loại Vắcxin viêm gan b và những nghiên cứu về vắcxin viêm gan b hiện nay

Xuất phát từ những hiểu biết về vai trò tạo miễn dịch bảo vệ của HBs và tính kháng nguyên cao của HBsAg nên từ đầu những năm 80 của thế

anti-kỷ 20, người ta đã sử dụng kháng nguyên HBsAg để nghiên cứu sản xuất

vắcxin phòng viêm gan B

2.1 Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu hướng phát triển

Năm 1971, Krugman và cộng sự là người đi tiên phong trong lĩnh vực này, các tác giả đã dùng huyết tương của người nhiễm HBV được bất hoạt bằng nhiệt tạo thành vật liệu sinh miễn dịch có thể dự phòng viêm gan B

Đến năm 1980, quy trình sản xuất vắcxin có quy mô đã được tiến hành ở Pháp và Mỹ Từ đó, cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu sản xuất vắcxin viêm gan B của các nước

2.1.1 Vắcxin viêm gan B từ huyết tương người

Năm 1981, vắcxin viêm gan B lần đầu tiên được điều chế tại Mỹ từ HBsAg có trong huyết tương những người nhiễm HBV Vắcxin đó mang biệt dược Heptavax-B của hãng Merck Sharp & Dohme

Vắcxin này, có thành phần chủ yếu là protein S, là tập hợp những hạt HBsAg hình cầu 22nm và được sản xuất trên nguyên lý: Lấy từ nguồn huyết tương người mang HBV với hiệu giá HBsAg cao trong máu, được xử lý qua nhiều bước lấy tủa, ly tâm, lọc rửa và bất hoại virút bằng nhiệt hoặc hoá học -

được gọi là vắcxin thế hệ 1 Vắcxin huyết tương đã được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới như Pháp (Pasteur), Mỹ (Merck Sharp & Dohme), Hà Lan (Redcross), Nhật (Green Cross và Viện Kitasato), Đài Loan (Life Quard), Triều Tiên (Green Cross & Cheisugar) và Trung Quốc Tính đến năm 1988

đã có 13 hãng sản xuất với 300 triệu liều một năm Một số vắcxin huyết tương được sử dụng như Hevax-B, Heptavax-B, HBvaccine, Hepavax

Vắcxin từ nguồn huyết tương người có hiệu lực bảo vệ tốt, giá thành phải chăng Tuy vậy ngày nay nhiều nước không sử dụng bởi vì nguồn huyết tương giàu HBsAg ngày càng trở nên khó khăn hơn do hiệu quả tích cực của chính việc dùng vắcxin, mặt khác các sinh phẩm có nguồn gốc từ máu người vẫn luôn là vấn đề đáng e ngại bởi các nguy cơ tiềm ẩn lây nhiễm các bệnh lây truyền qua đường máu Vì vậy các nhà khoa học đã lưu ý tới nghiên cứu phát triển loại vắcxin khác

2.1.2 Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp còn gọi là vắcxin viêm gan B thế hệ thứ 2,

được sản xuất bằng phương pháp công nghệ sinh học phần tử và công nghệ di truyền Người ta đưa gen S của HBV vào tế bào nhận Gen S tích hợp vào ADN plasmid của tế bào nhận Tế bào nhận tổng hợp nhiều kháng nguyên HBsAg dưới sự điều khiển của gen S Có 2 loại tế bào đang được dùng phổ

biến làm tế bào nhận hiện nay là tế bào nấm men Sacharomyces cereviriae

và tế bào buồng trứng của chuột đất vàng Trung Quốc (CHO)

Từ năm 1986, vắcxin tái tổ hợp bắt đầu được sản xuất, cho tới nay nhiều nước như Mỹ, Bỉ, Nhật, Pháp, Cu Ba, Trung Quốc, Triều Tiên đã sản xuất

được vắcxin viêm gan B tái tổ hợp Xu hướng chung hiện nay là sản xuất và

sử dụng vắcxin tái tổ hợp vì nó có nhiều ưu điểm, nhất là khi vắcxin huyết tương đang dần gặp khó khăn về nguồn plasma giàu HBsAg Hơn nữa, vắcxin tái tổ hợp dễ sản xuất với số lượng lớn, giá cả hợp lý, có tính sinh miễn dịch cao và rất an toàn

Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp có các loại:

Vắcxin tái tổ hợp từ nấm men chỉ có vùng S: Vắcxin được sản xuất trên

cơ sở sao chép HBsAg với týp huyết thanh adw2 trên tế bào nấm men

Sacharomyces cerevisiae Nhiều vắcxin tái tổ hợp từ nấm men đã được cấp

giấy phép trong đó có hai loại được sử dụng nhiều nhất là Engerix-B (Smith Kline - Bỉ) và Recombivax (Merck - Mỹ) Hơn 90% lượng kháng thể được hình thành là kháng thể loại “a” đặc hiệu và có khả năng bảo vệ giống như vắcxin làm từ huyết tương người Cho đến năm 1989, đã có 76 nước sử dụng

vắcxin này trong dự phòng với hơn 15 triệu liều, riêng hãng Smith Kline sản xuất khoảng 10 triệu liều

Vắcxin tái tổ hợp từ nấm men có chứa vùng tiền S2 (Pre - S2): Thành

phần bao gồm các protein trung bình là các axit amin được mã hoá bởi gen S + tiền-S2, những thành phần mới này đã làm cho vắcxin có tính sinh miễn dịch cao hơn các đối tượng có đáp ứng miễn dịch và những người không có

đáp ứng miễn dịch do nguồn gốc di truyền

Vắcxin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào động vật: Tế bào thường dùng là

trứng chuột đất vàng Trung Quốc (CHO) Các vắcxin cũng được phát triển dựa trên nguyên lý tái tổ hợp gen, kích thích sản sinh ra được kháng thể kháng S và tiền-S2 (một số tạo được cả kháng thể kháng tiền-S1), như Genhevac B của Pháp, Biohep-B của Nhật, Hepa-gene-3 (HG3) của Đức Qua thử nghiệm loại vắcxin này cho thấy khả năng gây đáp ứng miễn dịch sớm hơn các loại vắcxin chỉ chứa vùng gen S, ngoài ra còn gây được đáp ứng miến dịch trên các trường hợp không có đáp ứng với các loại vắcxin chỉ chứa protein mã hóa bởi vùng gen S Các tác giả cho rằng thành phần vắcxin có chứa vùng tiền-S1, tiền-S2 hoạt hoá được tế bào T hỗ trợ, cũng như tăng cường sự tương tác giữa anti-HBs và anti-tiền S làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch

Hiện nay vắcxin có chứa vùng tiền-S1, tiền-S2 đã được sản xuất và được

sử dụng trong các trường hợp đột biến, đáp ứng anti-HBs muộn hoặc không

đáp ứng miễn dịch

2.1.3 Vắcxin viêm gan B tổng hợp chuỗi polypeptit

Trên cơ sở hiểu biết cấu trúc chuỗi polypeptít ở dạng gây miễn dịch của HBsAg, người ta nghiên cứu tổng hợp ra chuỗi polypeptit để làm vắcxin Loại vắcxin viêm gan B này hiện nay đang trong quá trình thử nghiệm Đây

là vắcxin viêm gan B thế hệ thứ 3, vắcxin này trong tương lai sẽ là vắcxin rẻ nhất

2.2 Tính an toàn của vắcxin viêm gan B

Cả 2 loại vắcxin làm từ huyết tương người và vắcxin tái tổ hợp đều cho phản ứng tại chỗ nhẹ và phản ứng toàn thân rất hiếm khi gặp, nếu có thì sẽ nhanh chóng qua khỏi Các phản ứng tại chỗ hoặc toàn thân gây nên thường là do các chất bảo quản, các chất hấp phụ có trong thành phần vắcxin gây nên Các phản ứng này thường mất nhanh trong vòng 24-48 giờ sau tiêm

2.2.1 Tính an toàn của vắcxin viêm gan B sản xuất từ huyết tương người

Ngay từ những năm 80, sau khi quá trình sản xuất vắcxin phòng viêm gan B

từ huyết tương với quy mô lớn được thực hiện ở Pháp (Viện Pasteur) và ở Mỹ (Công ty Merk Sharp & Dohne) và tiếp theo đó nhiều hãng trên thế giới đã sản

xuất loại vắcxin này đều cho thấy: vắcxin huyết tương đã đạt được độ an toàn cho hàng triệu người dùng Tuy nhiên, lúc đó và sau này, một số tác giả vẫn lưu ý việc sử dụng loại vắcxin như thế có thể gây ra tình trạng đột biến chủng làm thay

đổi yếu tố di truyền của virút viêm gan B và e ngại những khả năng an toàn của loại vắcxin này Thực tế đã xác nhận rằng, hàng năm trên thế giới có 300 triệu liều vắcxin phòng viêm gan B được sử dụng đã không có trường hợp nào được báo cáo về sự lây nhiễm HIV và gây viêm gan virút do các loại vắcxin này

2.2.2 Tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

Tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp được nghiên cứu đầy đủ trên nhiều đối tượng, với liều lượng kháng nguyên và các thành phần tá dược cũng như nguồn gốc sản xuất khác nhau của nhiều hãng dược phẩm Các công bố trong 10 năm gần đây cho thấy các vắcxin viêm gan B tái tổ hợp an toàn về mọi khía cạnh và dung nạp tốt Sau đây là một số công trình nghiên cứu:

Các tác giả Tejedor - Torres - JC (1993), Goldfrab - J (1996), Yerushalmi -

B (1997), Hsu-H (2001) đã đánh giá tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất từ nấm men hoặc từ tế bào buồng trứng chuột (CHO) dùng cho trẻ sơ sinh và trẻ em với các liều 5,10, 20 àg đều không thấy tác dụng phụ đáng kể nào sau tiêm

Trên đối tượng người lớn khoẻ mạnh, các tác giả Leroux - Roels G (1996), Joshi N (2000), Kim - Y (1993), Min C.H (1991), thấy phản ứng tại chỗ sau tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp như đau chiếm 3,6% - 8,6%; sưng đỏ 2,2,% - 2,9%; Các phản ứng toàn thân như mệt mỏi, đau đầu, sốt nhẹ, buồn nôn chỉ xuất hiện thoảng qua với tỷ lệ nhỏ hơn 5%, tự khỏi sau 24-48 giờ và các phản ứng phụ ở những lần tiêm sau giảm dần

Các tác giả Bertinio J.S (19697), Heineman T.C (1999), Evan - J (2000), Joshi - N (2000) nghiên cứu tính an toàn của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp với các thành phần kháng nguyên khác nhau chứa gen S, tiền - S1, tiền-S2 cùng các tá dược MF559, GM-CSF trên người khoẻ mạnh và bệnh nhân chạy thận nhân tạo dài ngày đều thấy vắcxin hầu như không gây phản ứng phụ tại chỗ và toàn thân Vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đảm bảo tính an toàn ngay cả khi sử dụng cho trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai hoặc người đang ốm

Nhìn chung các vắcxin viêm gan B tái tổ hợp được đánh giá là an toàn, tạo

đáp ứng miễn dịch tốt và hầu như không có các tác dụng phụ (trừ một ít các phản ứng tại chỗ), do vậy vắcxin viêm gan tái tổ hợp hiện nay được nhiều nước trên thế giới sử dụng

2.3 Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B

Đối với bất cứ một loại vắcxin nào, ngoài các yêu cầu về an toàn, ít hoặc không có phản ứng phụ, phải đạt được 2 yêu cầu cơ bản sau đây:

- Có tính sinh miễn dịch cao tức là kích thích cơ thể sinh miễn dịch bảo vệ với hiệu giá kháng thể chấp nhận được theo quy ước của TCYTTG

- Có hiệu lực bảo vệ ở thực địa tức là hiệu quả cuối cùng cần đạt theo mục

đích sử dụng vắcxin

2.3.1 Tính sinh miễn dịch của vắcxin sản xuất từ huyết tương người

- Sử dụng trên người lớn: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm 3 liều 20 àg

theo lịch 0-1-6 tháng, cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch 92,3% - 100% Với các liều 5,

10, 15 àg theo lịch tiêm 0-1-6 đạt được hiệu lực đáp ứng miễn dịch cao 93-97%

- Sử dụng trên trẻ em: Liều 10 àg theo phác đồ 0-1-2 tháng cho đáp ứng miễn dịch cao ở tất cả các nhóm tuổi: dưới 6 tháng: 96%, 13-24 tháng: 91,3% Với liều 3 àg theo phác đồ 0-1-2 tháng trên những trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HBV

đạt 73,14%

2.3.2 Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp

Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã được nghiên cứu

một cách đầy đủ đối với các loại vắcxin được chế tạo ở các nước khác nhau Nhìn chung, tính sinh miễn dịch được thể hiện qua sự chuyển dịch huyết thanh (tỷ lệ chuyển đổi từ anti-HBs âm tính sang dương tính) và tỷ lệ phần trăm có hiệu giá kháng thể bảo vệ (≥10mIU/ml) và hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) của các đáp ứng miễn dịch sau từng mũi tiêm và hiệu giá cuối cùng

* Tính sinh miễn dịch của vắcxin tái tổ hợp từ nấm men

- ở người lớn: Vắcxin, được sử dụng trên các nhóm đối tượng như bệnh nhân chạy thận nhân tạo, đồng tính luyến ái nam, nhóm nhân viên y tế, nhóm người khoẻ mạnh thuộc nhiều lứa tuổi, đều đã chứng minh được tính sinh miễn dịch đạt tỷ lệ từ 90% - 100% ở Việt Nam, nhóm tác giả sử dụng Heberbiovac (Cu Ba) theo phác đồ 0-1-2, liều 20 àg cho đáp ứng miễn dịch đạt 98%, hiệu giá GMT là 201 mIU/ml

- ở trẻ em: Các loại vắcxin tái tổ hợp, dùng cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ lứa tuổi từ 1-10, đã chứng minh đáp ứng miễn dịch bảo vệ sau khi tiêm đủ 3 liều là 90-98% và từ 85-90% ở trẻ sinh ra từ mẹ mang HBsAg và 5 năm sau không thấy nhiễm HBV

Xu hướng chung trong vài năm gần đây người ta thường tập trung nghiên cứu tìm kiếm một vài loại tá chất hợp lý (như vi khuẩn H.influenzae hoặc tá chất

có nguồn gốc hoá học) để tăng cường hiệu lực đáp ứng miễn dịch hoặc sự kết hợp với một vắcxin khác (ví dụ: vắcxin viêm gan A) như một vắcxin đa giá, đồng tác dụng hỗ trợ miễn dịch Sau khi có sự kết hợp này trong thực nghiệm, người ta

đánh giá hiệu quả sinh miễn dịch và an toàn trên người tình nguyện và kết luận

về tác dụng của các tá chất này Nhìn chung các kết quả nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy: sau mũi tiêm thứ 3 có 97,6% - 100% đạt hiệu giá bảo vệ khi kết hợp vắcxin viêm gan A và B; Còn đối với vắcxin viêm gan B có chứa chất tá dược (MF 59) thì chỉ sau mũi tiêm thứ nhất đã đạt hiệu giá bảo vệ là 89%

trong khi vắcxin không có tá dược tỷ lệ này là 12% và hiệu giá GMT của vắcxin HBV/MF59 cao gấp 5 lần vắcxin không có tá dược Cả 2 vắcxin dung nạp tốt, tác dụng phụ ít, nhẹ thoáng qua

* Tính sinh miễn dịch của vắcxin tái tổ hợp được sản xuất từ tế bào động vật

Vắcxin cũng được phát triển trên nguyên lý tái tổ hợp ở tế bào CHO, gây

được hiệu quả miễn dịch cao và kích thích cơ thể tạo kháng thể kháng S, tiền-S1, tiền-S2 Vắcxin tái tổ hợp sản xuất từ tế bào CHO (vắcxin HG3) đã được thử nghiệm lâm sàng trên nhóm người khoẻ mạnh và 3 nhóm bệnh nhân chạy thận nhân tạo, ghép tạng, ghép tim (các nhóm này đã không có đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắcxin chỉ chứa vùng S) Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch có được sau khi tiêm

đủ 3 liều vắcxin HG3 lần lượt ở các nhóm trên là 100%, 92%, 42%, 40%

Viện Pasteur (Pháp) đã tiến hành nghiên cứu so sánh vắcxin huyết tương Hevac B có chứa 1-2% protein tiền-S2 với vắcxin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào CHO là GenHevacB có chứa 20% protein tiền - S2 220 trẻ em được tiêm 3 liều

5 àg Hevac B hoặc 20 àg GenHevacB, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch ở cả 2 loại vắcxin

là 100% với GMT là 3864 và 2864 mIU/ml Kháng thể kháng kháng nguyên “a”

đặc hiệu có ở 2 nhóm này là 84,2% và 98,4%

Kết quả tương tự cũng thu được ở Pháp trên trẻ sơ sinh và các bà mẹ có HBsAg (+) hoặc anti-HBe (+) Sau 3 mũi tiêm liều 20 àg GenHevac B, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% đối với anti-HBs và kháng thể kháng tiền-S2; hơn 90% trẻ em có anti-HBs với hiệu giá cao hơn 1000 mIU/ml chứng tỏ có sự miễn dịch kéo dài

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của vắcxin phòng viêm gan B

2.4.1 Đối tượng tiêm

Đã có nhiều thử nghiệm nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan

B trên những đối tượng khác nhau Các nghiên cứu đều cho thấy sự phát triển và hiệu quả kéo dài của kháng thể bảo vệ anti-HBs đều liên quan đến tuổi, giới, cân nặng trên đối tượng tiêm vắcxin viêm gan B

Đáp ứng miễn dịch của trẻ nhỏ cao hơn so với người trưởng thành và phụ nữ

có đáp ứng miễn dịch tốt hơn so với nam giới Vắcxin viêm gan B cũng có tác dụng bảo vệ tốt ở một số nhóm đối tượng có nguy cơ mặc dù tỷ lệ đáp ứng miễn dịch thấp hơn so với ngưòi khoẻ mạnh, điều này đã được chứng minh trên các nhóm bệnh nhân ưa chảy máu, thẩm tích máu, đồng tính luyến ái

2.4.2 Liều vắcxin

Hiện nay chưa có sự thống nhất trong việc sử dụng liều tiêm và lịch tiêm của các chế phẩm vắcxin viêm gan B Pasteur Merieux đưa ra lịch tiêm 4 mũi với liều 5 àg, trong khi đó Marck Sharp & Dohme và nhiều hãng khác sử dụng lịch

tiêm 3 mũi với liều 20 àg cho người lớn và 10 àg cho trẻ em Việc sử dụng liều tiêm và lịch tiêm chủ yếu phụ thuộc vào một số yếu tố như đối tượng tiêm, mức

độ lưu hành dịch ở địa phương, thành phần cấu tạo và chất lượng của từng loại vắcxin Liều tiêm cho nhóm vị thành niên gấp đôi liều lượng dùng cho trẻ dưới

1 tuổi, với người lớn dùng liều gấp 2-4 lần liều của trẻ dưới 1 tuổi Các nhóm nguy cơ cao được tiêm liều cao gấp 2 - 4 lần liều người lớn tùy theo chế phẩm

Để thăm dò và lựa chọn được 1 liều tiêm vắcxin thích hợp trong cộng đồng cho từng loại vắcxin viêm gan B nhiều nghiên cứu đã tiến hành với những liều tiêm thay đổi

Sử dụng vắcxin ở các liều cao thường đạt được đáp ứng miễn dịch cao, khả năng tồn lưu kháng thể bảo vệ kéo dài Những nghiên cứu đầu tiên thường sử dụng ở liều 40 àg HBsAg cho người lớn và tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau 2 mũi tiêm đã đạt 100% Tuy nhiên theo tiêu chuẩn của TCYTTG chỉ cần đạt hiệu giá anti-HBs ≥ 10 mIU/ml là có tác dụng bảo vệ và hiệu quả tích cực của mũi tiêm tiếp sau tăng tính sinh miễn dịch (nhờ vai trò của ký ức miễn dịch) Do vậy, các nghiên cứu sau này đã cho phép có thể chấp nhận và sử dụng vắcxin ở những liều thấp hơn

Việc giảm liều vắcxin mà vẫn giữ nguyên tính sinh miễn dịch đang rất

được quan tâm đặc biệt là ở những nước đang phát triển, nơi mà tỷ lệ nhiễm HBV lớn nhưng công tác tiêm chủng đang gặp trở ngại lớn là giá thành vắcxin còn cao

Trong một số thử nghiệm giảm 1/2 liều vắcxin so với liều tiêm chuẩn 20àg của Engerix-B và 10 àg của HepavaxII-B trên đối tượng người lớn ở Singapo và Australia (1991), các tác giả nhận thấy việc giảm 1/2 liều vẫn tạo ra tỷ lệ bảo vệ tương đương liều chuẩn

Một nghiên cứu tương tự được thực hiện trên trẻ em được tiêm vắcxin viêm gan B tái tổ hợp theo lịch 0-1-5 tháng với liều 5; 2,5; 1,25 hoặc 0,6 àg tỷ lệ miễn dịch ở thời điểm 6 tháng sau mũi tiêm thứ 1 giao động từ 90-100% Sau một năm 20% có hiệu giá ≤ 10 mIU/ml và sau 2 năm có 40%, song tất cả đều có đáp ứng miễn dịch tăng lên sau liều tiêm nhắc lại

Một nghiên cứu tương tự trên 153 trẻ sơ sinh khoẻ mạnh với liều từ 5 àg

và 10 àg vắcxin Engerix-B, cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch bảo vệ là 98,5% ở cả hai nhóm Tuy nhiên, liều 10 àg tạo ra nồng độ GMT cao hơn so với liều 5 àg (1641 mIU/ml so với 880 mUI/ml)

Các nghiên cứu nhìn chung đều đi đến thống nhất là liều tiêm có ảnh hưởng đến hiệu giá kháng thể đạt được sau khi tiêm ở mỗi cá thể, song nó không tạo ra một sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ có miễn dịch bảo vệ trong cộng đồng Khi mà sự hạn chế về thời gian tồn lưu kháng thể bảo vệ sau tiêm được giải quyết bằng một mũi tiêm nhắc lại thì việc giảm liều là một giải pháp hữu hiệu cho các nước ở vùng có dịch lưu hành cao khi cần phải tiêm miễn dịch hàng loạt cho trẻ

em nhưng kinh phí lại hạn hẹp

2.4.3 Đường tiêm, vị trí tiêm

Chỉ định thông thường với vắcxin viêm gan B là đường tiêm bắp ở đùi hoặc cơ delta Trên trẻ em, đặc biệt là trẻ sơ sinh, cơ delta quá nhỏ nên tất cả các mũi vắcxin tiêm bắp bao gồm cả vắcxin viêm gan B đều được tiêm ở đùi

Tiêm vào mông làm giảm đáp ứng miễn dịch Đã có hơn 100 báo cáo về tỷ

lệ đáp ứng kháng thể thấp không đạt yêu cầu sau khi tiêm vắcxin viêm gan B vào mông Shaw và cộng sự, tiến hành nghiên cứu ở Mỹ, đã chứng minh những người

được tiêm vắcxin ở cơ delta có nồng độ kháng thể cao gấp 17 lần những người

được tiêm vào mông và hơn nữa những người được tiêm vào mông có 2 - 4 lần khả năng không đạt đến nồng độ kháng thể tối thiểu 10 mIU/ml sau tiêm Hiện tượng trên có thể được giải thích là :

- Vắcxin có thể bị tiêm vào mô mỡ dày dưới da ở mông hơn là vào cơ với kim ngắn hơn 5 cm

- Các tế bào thực bào hoặc trình diện kháng nguyên trong các lớp mỡ rất ít nên việc xử lý bởi đại thực bào và trình diện với các tế bào T và B bị chậm trễ

- Các kháng nguyên tồn tại trong mỡ nhiều giờ hoặc nhiều ngày có thể bị biến tính

Giảm liều phối hợp với kỹ thuật tiêm trong da là một vấn đề đã được nghiên cứu Tuy nhiên, đối tượng có thể áp dụng kỹ thuật này là vấn đề còn nhiều tranh luận Tính an toàn và hiệu quả của vắcxin viêm gan B với liều nhỏ tiêm trong da đã được xác nhận trên một nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch trên sinh viên Y khoa (ở Bethesda - Mỹ) với 4 mũi tiêm trong da với liều 2 àg vắcxin huyết tương, cho thấy tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 96%, GMT là 1198 mIU/ml và

sự tồn tại kháng thể sau 2 năm ở 85 - 89% tổng số người được tiêm Các tác giả

Mỹ đã tiến hành trên binh lính đóng quân ở Hàn Quốc cho thấy cách tiêm trong

da là hoàn toàn có thể chấp nhận được trên người lớn khi cần có một sự bảo vệ ngắn hạn Tuy nhiên, đối với trẻ em đường tiêm trong da dung nạp không tốt Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) khuyến cáo rằng đường tiêm trong da không

được dùng cho trẻ em, đặc biệt đối với trẻ sơ sinh từ những bà mẹ là người mang mạn tính, đường tiêm trong da chỉ được dùng đối với người lớn tuổi trong trường hợp có làm thử nghiệm huyết thanh học sau khi tiêm

Một nghiên cứu sử dụng vắcxin viêm gan B liều 0,1 ml tiêm trong da đã có

đáp ứng miễn dịch tốt và không có phản ứng phụ tại chỗ xảy ra Đường tiêm trong da có thể làm giảm giá thành chỉ cần 10% lượng vắcxin là có thể đạt được mức độ đáp ứng kháng thể như tiêm bắp Tuy nhiên, cho đến khi có những quyết

định từ các nghiên cứu sâu hơn, đường tiêm bắp với liều đầy đủ vẫn là chỉ định với vắcxin viêm gan B

2.4.4 Lịch tiêm

Hiện nay có nhiều lịch tiêm khác nhau tùy theo loại vắcxin của các hãng sản xuất qui định Hai lịch tiêm phổ biến nhất là 0-1-2-12 tháng và 0-1-6 tháng

Lịch thứ nhất cho sự bảo vệ nhanh chóng, lịch tiêm thứ 2 tạo ra kháng thể hiệu giá cao hơn và sự bảo vệ kéo dài hơn

Một nghiên cứu của Đức so sánh 3 lịch tiêm 0-1-2-12; 0-1-6 và 0-1-12 tháng, đưa đến kết luận rằng lịch tiêm cuối cùng cho hiệu giá cao nhất và sự bảo

vệ kéo dài nhất, trong khi lịch 0-1-2-12 tháng cho sự bảo vệ sớm nhất

Nhiều nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắcxin trên động vật và người tình nguyện đã rút ra kết luận cần thiết ít nhất là 3 liều tiêm để có đáp ứng miễn dịch cao, ổn định và khả năng bảo vệ bền lâu Người ta thấy rằng những đứa trẻ chỉ nhận được 2 liều tiêm sẽ được bảo vệ cơ bản nhưng có thể sẽ bị nhiễm ở giai

đoạn sau do các nguồn lây khác nhau Liều nhắc lại thứ 3 là cần thiết để mang lại

tỷ lệ bảo vệ cao đáng kể, duy trì sự bảo vệ lâu dài và kích thích kéo dài trí nhớ miễn dịch

3 Sử dụng công nghệ táI tổ hợp Adn để biểu thị kháng nguyên

3.1 Các hệ biểu thị khác nhau

Nghiên cứu tìm hệ biểu thị cho vắcxin viêm gan B thế hệ hai bắt đầu từ cuối

những năm 70, bị ngắt quãng trong các phòng thí nghiệm có sử dụng rADN Công việc này được khởi động lại vào những năm đầu 80, khi người ta xác định

được gen S mã hoá kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của HBV và biểu thị gen S tái

tổ hợp như như kiểu hạt HBsAg 22 nm ở nấm men và tế bào động vật Cả hai loại vắcxin tái tổ hợp từ nấm men và tế bào động vật (CHO) đều được phát triển và cấp bằng vào thập niên 80 Cả hai loại vắcxin tái tổ hợp đều đạt công hiệu với hiệu giá kháng thể bảo vệ anti-HBs cao ở những người được tiêm Tuy nhiên, các qui trình dựa trên cơ sở tái tổ hợp nấm men nhìn chung vẫn có kết quả hơn Hơn nữa tính an toàn có liên quan đến ADN tồn dư ở sản phẩm từ nấm men về cơ bản

là tốt hơn ở ADN tồn dư ở sản phẩm từ tế bào động vật, mặc dù qui trình làm sạch ADN vẫn phải sẵn sàng cho cả hai loại vắcxin

3.2 Biểu thị ở nấm men

Hệ biểu thị HBsAg ở nấm men là tương tự và điển hình cho các hệ sử dụng

nói chung cho S cerevisiae Các hệ biểu thị sử dụng plasmid có chứa một phần

hoặc toàn bộ các trình tự 2 àm của nấm men, có khả năng khuyếch đại lên nhiều phiên bản, thường là 100-200 phiên bản/tế bào Các plasmid kiểu này tự thay thế các phân tử ADN trong nhân nấm men và có chứa gen chọn lọc đối với quyền sở hữu trong chủng chủ tương thích, như kiểu gen LEU2 để chọn lọc chủng thiếu hụt Leucin (leu-) Bộ máy biểu thị bao gồm đoạn khởi động phiên dịch mạnh từ nấm men, gen S của HBV và trình tự kết thúc phiên dịch từ nấm men Các đoạn khởi động thường có cả hai vùng cấu trúc hoạt động biểu thị HBsAg Qua quá trình lên men của nấm men, nó sẽ tái bổ sung chất cảm ứng biến nạp (thí dụ Galactose cho đoạn khởi động GAL1) hoặc giảm các thành phần môi trường (thí

dụ Phosphat cho đoạn khởi động PHO5) Ngoài ra, plasmid còn chứa các yếu tố

năng AOX1 và AOX2 và phát triển trong Methanol ở tỷ lệ của chủng hoang dại Chủng thứ hai được gọi là sử dụng Methanol chậm (Muts) có gen AOX1 bị rối loạn Chuyển hoá Methanol ở chủng này phụ thuộc vào gen phiên dịch yếu AOX2 Chủng thứ ba được gọi là sử dụng Methanol âm tính (Mut-) Trong chủng này cả hai gen AOX đều bị rối loạn và kết quả chủng này hoàn toàn không có khả năng chuyển hoá Methanol

Biểu thị ở cả ba chủng P Pastoris Mut đều được thực hiện bằng nuôi cấy

trong nồi lên men với qui trình ba bước Hai bước lên men đầu là như nhau ở cả

ba chủng Bước thứ nhất là giai đoạn Glycerol để phát triển sinh khối Bước thứ hai là giai đoạn nuôi khi Glycerol được cho thêm vào ở tỷ lệ giới hạn phát triển Glycerol có hạn trong giai đoạn này kiềm chế bộ máy chuyển hoá Methanol và cho phép tế bào chuyển dịch nhẹ nhàng từ phát triển có Glycerol sang phát triển

có Methanol Giai đoạn thứ ba là giai đoạn cảm ứng Methanol và khác nhau phụ thuộc vào phenôtyp của chủ biểu thị Tuy vậy, hình ảnh chung của giai đoạn thứ

ba này là mức độ Methanol trong nồi lên men phải được kiểm soát chặt chẽ hoặc trực tiếp bằng sắc ký khí hoặc gián tiếp bằng nồng độ ôxy (DO) hoà tan

Chủng Mut +

Chủng Mut+ của P pastoris rất nhậy cảm với hàm lượng Methanol tồn dư

cao Với một lượng ôxy và Methanol thừa thì Formaldehyt, sản phẩm đầu tiên của quá trình chuyển hoá Methanol tăng đến mức gây độc và “làm lên men” tế bào Bởi vậy, để tế bào phát triển và biểu thị protein thành công với chủng Mut+

thì nhất thiết phải duy trì được nồng độ Methanol thấp trong nồi lên men Ưu

điểm của chủng Mut+ để biểu thị so với các chủng thiếu hụt AOX là tỷ lệ phát triển trong Methanol (và sản xuất protein ngoại lai) nhanh hơn nhiều Tuy nhiên, nồng độ Methanol phải được kiểm soát chặt chẽ

Chủng Mut s

Chủng Muts (loại bỏ - AOX1) có thể nhân lên trong quá trình chuyển nạp bằng cách thay thế gen khi gen AOX1 được thay thế bởi bộ biểu thị Nói một

cách khác, một chủng P pastoris như KM71 có chứa gen AOX1 bị rối loạn có

thể sử dụng làm tế bào chủ với vector biểu thị được gài đặt vào Như đã nêu trên, chủng này phát triển chậm trong Methanol do quá trình ôxy hoá rượu nhờ cậy vào gen AOX2 Chiến lược lên men cho chủng Muts cũng như với chủng Mut+, trừ tỷ lệ Methanol nuôi thấp để duy trì Methanol ở hàm lượng 0,2 đến 0,8% trong nồi lên men Một ưu điểm của chủng Muts là nuôi cấy không nhậy cảm lắm với Methanol tồn dư trong môi trường nồi lên men so với chủng Mut+ và vì vậy qui trình có thể mở rộng dễ dàng

Một chiến lược gây cảm ứng khác cho chủng Muts là sử dụng hỗn hợp nuôi Glycerol : Methanol Brierley et al nghiên cứu tỷ lệ nuôi 4:1 và 2:1 (g Glycerol/h : g Methanol/h) Họ cũng mô tả chiến lược nuôi hỗn hợp với tỷ lệ bắt đầu là 2:1,

và tăng lượng Methanol nuôi dần cho đến khi Methanol được tích lũy Tỷ lệ sử