đề tài công nghệ sản xuất vacxin viêm gan b

Đa số người bị nhiễm siêu vi B đều không biết là mình bị nhiễm và có thể vô tình lây sang người khác qua đường máu.. Tuy nhiên đa số trẻ sơ sinh và trẻ em bị nhiễm đều không

TIỂU LUẬN: CNSX Vacxin Và kháng sinh

ĐỀ Tài: CNSX Vacxin viêm gan B

GV hướng dẫn:

GV Nguyễn Thị Thương Thương

Nhóm SV thực hiện :

Trần Trung Hiếu (Leader)036

Nguyễn Quang Huy 042

Cấn Thị Khánh Huyền 044

Hoàng Thị Hường 049

Hoàng Thị Yến 098

Mục lục

• Giới thiệu về bệnh viêm gan B

• Virus viêm gan B

• Giới thiệu về vaccine

• Quy trình sản xuất vaccine viêm gan B tái

tổ hợp

• Quy trình sản xuất vaccime viêm gan B từ huyết tương người lành

Bệnh viêm gan B là gì?

Viêm gan siêu vi B là bệnh gan hiểm

nghèo thường gặp nhất trên thế giới do siêu

vi khuẩn B gây ra Việt Nam là một trong

những quốc gia có tỷ lệ bị nhiễm siêu vi B cao nhất thế giới Ở nước ta có khoảng 10 triệu người đang bị nhiễm căn bệnh này

Tại sao viêm gan B được coi là căn bệnh

nguy hiểm?

• Vì đây là căn bệnh lây lan lặng lẽ, tiến triển âm thầm Đa số người bị nhiễm siêu vi B đều không biết là mình bị nhiễm và có thể vô tình lây sang người khác qua đường máu Đa số người lớn bị nhiễm đều có thể loại trừ siêu vi B dễ dàng Tuy nhiên đa số trẻ

sơ sinh và trẻ em bị nhiễm đều không thể loại trừ được siêu vi khuẩn này và sẽ trở thành người mang siêu vi B mạn tính

• Cứ 4 người mang siêu vi B mạn tính sẽ có 1 người bị thiệt mạng

do xơ gan và ung thư gan trong suốt cuộc đời của họ Siêu vi B có thể thầm lặng tấn công gan trong nhiều năm mà bệnh nhân không hề hay biết Đến khi bệnh nhân cảm thấy cần đi khám bệnh thì thường bệnh đã vào giai đoạn cuối Nhiều bệnh nhân đã chết do ung thư gan vẫn không biết thủ phạm chính là siêu vi khuẩn B

Bệnh viêm gan siêu vi B có thể phát hiện sớm một cách dễ dàng nhờ vào các xét nghiệm máu đơn giản Việc phát hiện sớm viêm gan B mạn tính giúp gia tăng hy vọng ngăn ngừa biến chứng xơ gan và ung thư gan bằng cách khám sức khỏe định kỳ và điều trị với những loại

thuốc đặc trị mới

Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Virus viêm gan B

• Virus viêm gan B( HBV)

thuộc họ Hepadnaviridae là

những virus có kích thước

nhỏ

• Có 3 loại tiêu thể: hình cầu

nhỏ (d=22nm), hình cầu lớn

(d=42-45nm) và hình cầu

nhỏ và hình ống

• Bộ gene gồm một DNA có phần

gập đôi, khoảng 3.2 kilo cặp

base, tạo nên các antigen:

1 HBsAg (kháng nguyên bề

mặt): thuộc lớp vỏ của HBV -

dùng trong xét nghiệm máu để

biết có HBV trong cơ thể

2 HBcAg (kháng nguyên lõi):

thuộc lớp lõi của HBV - dùng

để biết HBV đang phát triển

3 HBeAg (kháng nguyên nội

sinh): nếu có trong máu bệnh

nhân đang có khả năng lây rất

cao

4 gen X : có thể là nguyên nhân

tạo ung thư gan

5 gen P

• Cấu trúc bộ gene viêm gan B

Hepatitis B virus

Cấu tạo bộ gen HBV

Sự xâm nhập vào tế bào

Các dạng vaccine

Phân loại theo nguồn gốc:

Vaccine truyền thống

Vaccine tái tổ hợp

Vắc-xin kinh điển

Vắc-xin bất hoạt

Vắc-xin sống, giảm độc lực

Các "toxoid“

Vaccine DNA

• Loại kỹ thuật được sử dụng để bảo vệ sinh vật chống lại bệnh bằng cách tiêm trực tiếp DNA vào cơ thể sinh vật

• Tạo ra một đáp ứng miễn dịch

DNA tái tổ hợp từ

Bước 4: Biến tính tế bào và đưa plasmide tái tổ hợp vào

Bước 5: Tế bào sinh ra Protein, chiết tách

protein

Bước 6: Kiểm tra chất lượng protein

Bước 7: Phân loại và tinh sạch protein

Bước 8: Thu nhận thành công protein đích

Giải trình tự chuỗi

Thực hiện PCR

 Lấy mẫu và bảo quản

 Ly trích và tinh sạch

 Khuếch đại DNA bằng phản

ứng PCR trong máy luân

nhiệt

 Kiểm tra và phát hiện sản

phẩm khuếch đại trên gel

Agarose

 Thực hiện phản ứng cắt

 Điện di và phân tích kết quả

Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:

 Hiệu suất biến nạp cao

 Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20 μL

 Có thể cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp

Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền

 Hóa biến nạp

Đây là phương thức kinh điển để biến nạp

plasmid vào tế bào E coli Các tế bào

được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở

thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận plasmid

Gồm 2 bước :

 Chuẩn bị tế bào khả biến

 Cấy plasmid vào bằng shock nhiệt

Chuẩn bị tế bào khả biến

lấy một khuẩn lạc đơn, nuôi trong 3 mL môi trường LB lỏng, (lắc qua đêm ở 37 0 C,

200 vòng/phút)

Cấy ria trên môi trường LB(Luria-Bertani) đặc (nuôi qua đêm, 37 0 C)

Chuyển 1 mL dịch nuôi sang 100 mL môi trường LB lỏng mới, tiếp tục nuôi lắc 37 0 C, 200

vòng/phút Sau 2 – 3 giờ, khi OD600 đạt 0,375

Chuyển dịch sang 6 ống ly tâm 15 mL đã được giữ lạnh trong đá

Bỏ phần nổi, hòa tan phần cặn trong 300 µL CaCl2

Tế bào khả biến được chia vào các ống eppendorf, mỗi ống 100 µL

đem bảo quản ở nhiệt độ -80 0 C Dịch tế bào sau khi ly tâm 6000 vòng/phút ở 4 0 C trong 5 phút được rửa 2 lần bằng 3 mL CaCl2 60mM sau đó

dịch hòa tan được giữ trong đá 30 phút

Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli

JM109 bằng phương pháp sốc nhiệt

Tế bào được sốc nhiệt ở 42 0 C trong 30 giây sau đó giữ trên đá

2 phút

Bổ sung 5 µL DNA vector PMD 18 T vào ống eppendorf chứa 50 µL tế

bào khả biến và giữ trên đá 20 phút

Tế bào sau biến nạp được nuôi trong 600 µL môi trường LB (lắc 200 vòng/phút ở

37 0 C, 60 phút)

Cấy trải 100 µL dịch lên môi trường LB rắn có bổ sung ampicillin

(100mg/L) (37 0 C, qua đêm)

Thu nhận dòng cần

Cắt plasmide

Chuyển gen vào plasmide biểu hiện (pcDNA 3.1)

Điện di Kết quả Hind III

EcoR1

Tách chiết, thu nhận DNA của plasmid

từ E.coli

• Phá vỡ màng tế bào (lysis method)

• Ly tâm (centrifugation)

• Ủ với enzym Hind III và EcoR1

• Tách chiết và tinh khiết ADN của

plasmid (plasmid DNA extraction and

purification)

Đưa Plasmid vào Saccharomyces

cerevisiae trên môi

trường

Chi Saccharomyces

Môi trường LB khả biến đặt trong đá lạnh

Cho plasmid pcDNA 3.1+ vào môi trường

Tiến hành ủ đá

Sau đó ủ đá trong vòng 20 phút

Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt

Nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae

 Nuôi cấy nấm men trong môi

Tách và tinh sạch protein

Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả

tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử

dụng các biện pháp khác nhau

-Nhiệt độ

-Nồng độ proton (pH)

-Tác nhân hóa học…

Phương pháp sắc ký lọc gel

Các phần tử lớn không thấm vào trong hạt sephadex

Hạt sephadex Các phần tử nhỏ thấm

vào trong cá hạt sephadex

Tách các phân tử theo kích thước bằng sắc ký lọc gel Hoạt động của lọc phân tử sephadex

Qui trình sản xuất vacxin viêm gan b từ huyết

tương người

• Vacxin này thuộc loại vacxin dưới đơn vị

phần kháng nguyên có tính sinh miễn dịch là protein vỏ của virus viêm gan b ( HbsAg) được tách và tinh chế từ huyết tương của những

người mang virus viêm gan B nhờ các kỹ thuật tách thông thường như kết tủa, cô đặc, ly

tâm…với 20 bước như sau:

Bước 1 thu thập huyết tương người mang

HbsAg có hiệu giá cao (>104-105)

Bước 2 tạo huyết thanh từ huyết tương (tủa với (NH4)2S04 30% nồng độ cuối), để ơ nhiệt

độ phòng 30 phút, ly tâm 5000v/phút trong 20 phút/40c bỏ cặn, lấy dịch nổi

Bước 3 tủa với sulphatamol 50% (nồng độ

cuối) để qua đêm ở nhiệt độ phòng, ly tâm

như trên Bỏ nước nổi, cặn

Bước 4 hòa cặn với KBr, khuấy đều ít nhất 1 giờ ở nhiêt độ phòng, để lắng loại bỏ cặn

bằng phễu lọc hút chân không

Bước 5 điều chỉnh dịch để có tỉ trọng

1,32g/cm3 (thêm bớt KBr)

Bước 6 chuẩn bị mấy siêu li tâm 55pp và onal rotor RPZ35T

HITACH- Bước 7 cho các dung dịch vào rotor

o Nước cất d=1: 500ml

o Dung dịch KBr d = 1,3g/cm3: 400ml

o Dung dịch mẫu d=1,32g/cm3: 1000ml

o Ly tâm ở 25000 v/phút trong 24 giờ/20oc Lấy mẫu từng

o Phân đoạn 30ml và xác định HsbAg trong chúng Trộn các phân đoạn có HsbAg dương tính cao

o Siêu li tâm 3 lần

 Bước 8 cô đặc đến thể tích 300ml

 Bước 9 siêu li tâm từng vùng với sacaroza graddient (2 lần)

ml đầu, lấy mẫu từng phân đoạn 30 ml và xác định HsbAg trong chúng Trộn các phân đoạn HsbAg có hiệu giá cao

Bước 10 cô đặc dịch (V=300ml)

Bước 11 bất hoạt HsbAg tinh khiết ở 60oc/10 giờ Lọc qua màng lọc 8um và 0,45um Bất

hoạt tiếp với formaldehyt (nồng độ cuối

1:2000) trong 96 giờ/37oc

Bước 12 cô đặc và thẩm tích loại formaldehyt (bằng Pellicon cassette) Kiểm tra độ tinh sạch của HbsAg (điện di, kính hiển vi điện tử)

kiểm tra HBV-ADD tồn dư (PCA)

Bước 13 kiểm tra hàm lượng HbsAg (đo mật

độ quang và ELISA)

 Bước 14 lọc vô trùng qua

màng lọc 0.22um

 Bước 15 hấp phụ HbsAg vào gel Al(OH)3 và pha vacxin với hàm lượng HbsAg 20ug/ml nồng độ cuối của nhôm:

300ug/ml thêm chất bảo quản thimerosal ở nồng độ 1:10000

 Bước 16 lắc đều các chai

trong 1 tuần, 2 lần/tuần

Bước 17 lấy mẫu bán thành phẩm kiểm tra vô khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt và các chỉ số hóa học

Bước 18 đóng lọ, dán nhãn, đóng gói

Bước 19 lấy mẫu kiểm tra chất lượng

vacxinvoo khuẩn, an toàn, công hiệu, chất gây sốt và các thành phần hóa học

Bước 20 xuaatss xưởng vacxin

Sản phẩm vaccine viêm gan B được điều chế từ huyết tương người lành mang kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B

(HBsAg) không có triệu chứng lâm sàng

• Thành phần:

Một liều 1ml bao gồm:

- Kháng nguyên bề mặt virút

viêm gan B tinh

THE END

THANK YOU FOR LISTENING