Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống ở việt nam

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2021- 2022 Tên đề tài: Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng khá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NĂM 2021- 2022

Tên đề tài: Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập

từ thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam

Mã đề tài: 2021.01.105

Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thị Nam Anh

Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 9 tháng

TP Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 3 năm 2022

NTTU-NCKH-04

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

- Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH

Tên đề tài: Nghiên cứu sơ bộ về tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn phân lập

từ thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam

Số hợp đồng: 2021.01.105

Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thị Nam Anh

Đơn vị công tác: Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT- Đại học Nguyễn Tất Thành

Thời gian thực hiện: 9 tháng

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

1 Nguyễn Thị Phương Công nghệ sinh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iv

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Sơ lược về tình hình kháng kháng sinh 2

1.2 Giới thiệu về thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam 3

1.3 Tình hình nghiên cứu về tính kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam 4

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

2.1 Vật liệu nghiên cứu 6

2.2 Phương pháp nghiên cứu 6

2.2.1 Phân lập vi sinh vật kháng thuốc 6

2.2.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 6

2.2.3 Thử nghiệm sinh hóa 8

2.2.4 Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được 10

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

3.1 Sự phổ biến của các kiểu hình kháng thuốc 12

3.2 Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được 14

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM 23

PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương) 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trong các thực phẩm lên men khác nhau 12 Bảng 2 Kết quả của các thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng sinh đối với các chủng kháng thuốc

được chọn từ các mẫu thực phẩm lên men khác nhau……… ………… 14

Bảng 3 Bảng kết quả định danh các chủng kháng kháng sinh theo phương pháp Sanger dựa

trên gene 16S 15

Bảng 4 Bảng đặc tính của các chủng thu được từ thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam.

15

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

STT Công việc thực hiện Kết quả đạt được

1 Phân lập vi sinh vật kháng thuốc

từ thực phẩm lên men truyền thống

Phân lập được 16 chủng từ thực phẩm lên men truyền thống

2 Định danh vi khuẩn bằng phương

pháp sinh học phân tử và thử nghiệm sinh hóa

Bảng định danh vi khuẩn kháng thuốc cùng kiểu hình kháng thuốc

3 Đánh giá tính kháng kháng sinh

của vi sinh vật phân lập được

Thu được 3 chủng vi khuẩn kháng từ

3 loại kháng kháng sinh trở lên từ 3 loại thực phẩm đã chọn

STT Sản phẩm đạt được Sản phẩm đã đăng ký

1 01 bản thảo bài báo tiếng Anh 01 bài báo đăng trên Tạp chí khoa

học công nghệ đại học Nguyễn Tất

Thành

Thời gian thực hiện: 03/2021 – 12/2021

Thời gian nộp cuốn báo cáo: 20/02/2022

1

MỞ ĐẦU

Kháng sinh Penicillin là phát minh có tính lịch sử của Sir Alexander Fleming trong thế

kỉ XX và được sử dụng như tác nhân trị liệu hóa học tiềm năng nhằm chống lại vi khuẩn gây bệnh Từ đó đến nay, nhiều loại kháng sinh đã được phát hiện ra và được đưa vào sử dụng ngày càng rộng rãi trong y học như một tác nhân quan trọng trong việc cứu chữa bệnh Tuy nhiên, như một tác nhân diệt khuẩn mạnh mẽ, việc sử dụng kháng sinh không chỉ dừng lại ở lĩnh vực y học mà còn được sử dụng có rộng rãi trong chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và nông nghiệp Việc lạm dụng kháng sinh trong cuộc sống làm gia tăng các mầm bệnh và nguy cơ kháng thuốc dẫn đến nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Dưới sự áp lực chọn lọc do kháng sinh gây ra đã dẫn đến sự xuất hiện và lây lan của vi khuẩn kháng thuốc và các gen kháng thuốc của chúng Hậu quả là ngày càng có nhiều trường hợp mắc bệnh, điều trị thất bại, nhiều ca tử vong hơn và chi phí điều trị cao hơn cho xã hội

Do sự xuất hiện của kháng kháng sinh nên việc tìm kiếm các cách thức mới nhằm giảm thiểu

sự hình thành kháng kháng sinh đang trở thành chủ đề trọng tâm của nhiều công trình nghiên cứu từ nhiều nơi trên thế giới trong đó có Ủy ban Khoa học Châu Âu về Dinh dưỡng Động vật (SCAN), Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO),

Tổ chức Thú y Thế giới (OIE)

Việt Nam là một đất nước có lịch sử lâu đời với các sản phẩm lên men truyền thống

Ở Việt Nam, các thực phẩm lên men truyền thống phổ biến như dưa muối, nem chua, sữa chua… được tiêu thụ rộng rãi ở khắp mọi nơi trên cả nước Tuy nhiên, hầu hết là tự chế, không được kiểm soát tốt về mặt vi sinh, tiềm ẩn nhiều nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng Đã có những trường hợp ghi nhận về nguy cơ truyefn ngang gen kháng kháng sinh thông qua những

vi khuẩn không gây bệnh tới vi khuẩn gây bệnh Vì vậy, việc nghiên cứu sự xuất hiện của các kiểu hình đa kháng thuốc (MDR) và gen kháng kháng sinh (ARGs) trong một số thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam là rất cần thiết

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về tình hình kháng kháng sinh

Kháng kháng sinh (AR) là khả năng vi khuẩn hoặc các vi sinh vật khác chống lại tác động của thuốc kháng sinh 1 Thuốc kháng sinh luôn được coi là một trong những khám phá

thần kỳ của thế kỷ 20, nó đã thành công trong việc cứu sống hàng triệu người và giảm bớt nhiều gánh nặng cho con người Tuy nhiên, sự gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh trong bệnh viện, cộng đồng và môi trường diễn ra đồng thời với việc sử dụng chúng Khả năng di truyền bất thường của vi khuẩn được hưởng lợi từ việc con người sử dụng quá mức thuốc kháng sinh để khai thác mọi nguồn gen kháng thuốc Kháng kháng sinh trong các mầm bệnh

do vi khuẩn gây ra đã và đang là một mối đe dọa đến sức khỏe toàn cầu Thế giới đang lo lắng

về sự dai dẳng và lây lan của chúng đã xuất hiện trên toàn trái đất WHO báo cáo ước tính có khoảng 480.000 trường hợp mắc bệnh lao do đa kháng thuốc, trong đó phần lớn là không được điều trị Các bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh hiện đã cướp đi sinh mạng của gần 50.000 người mỗi năm chỉ riêng ở Hoa Kỳ và Châu Âu, chưa kể hàng trăm nghìn người được báo cáo là chết ở các khu vực khác 2

Việt Nam đã và đang phải đấu tranh với mối hiểm họa nghiêm trọng của hiện tượng kháng thuốc kháng sinh do trạng thái sử dụng quá mức và không hợp lý ở nhiều các hệ thống chăm sóc y tế, trong công cộng, chăn nuôi cũng như sản xuất thực phẩm và nông nghiệp Theo WHO, một số chuyên gia đã ước tính rằng đến năm 2050, tình trạng kháng thuốc kháng sinh

có thể gây nên tử vong cho 10 triệu người trên toàn cầu vào mỗi năm, tương đương với tỷ lệ

cứ 3 giây sẽ có 1 trường hợp tử vong- lớn hơn so với người bệnh tử vong do mắc ung thư hiện nay 3

Thực phẩm nói chung và thực phẩm lên men nói chung cũng là một nguồn chứa vi sinh vật có khả năng kháng kháng sinh Có nhiều nguyên nhân ẩn chứa những mầm bệnh trong đó

có thể kể đến nội sinh (động vật, thực vật), ngoại sinh (nhân sự, nước, hoặc môi trường) hoặc

do lây nhiễm chéo Về yếu tố nội sinh và ngoại sinh, một trong những nguyên nhân của yếu

tố này là do trong quá trình sinh trưởng và phát triển của động vật ngoài môi trường, kháng sinh được sử dụng để trị bệnh cũng như kích thích tăng trưởng, do đó kháng thuốc kháng sinh

ở động vật có thể lây truyền sang con người thông qua chuỗi thức ăn Cũng như ở thực vật, các vi khuẩn kháng kháng sinh tồn tại trong môi trường có thể chưa được vệ sinh sạch sẽ nên vẫn còn tồn đọng trong quá trình lên men 4 Thêm vào đó, đã có những nghiên cứu báo về

3

thành phần chính của nem chua là thịt lợn sống có thể chứa Lactobacillus; Lactobacillus fermentum, Pediococcus acidilactici Những vi khuẩn này, cũng như các gen kháng thuốc kháng sinh (aphA3, erm, erm (B), tet (M) Erm (C), cat, Tn554) 4 có thể được chuyển ngang gen sang người thông qua trực tiếp và tiếp xúc gián tiếp với nguồn lây nhiễm 5 Hơn nữa, có

sự tiếp hợp vi khuẩn giữa plasmid pRE25 của Enterococcus faecalis mang một số gen kháng

với vi khuẩn axit Lactic (LAB) trong nem chua đã được báo cáo trong nghiên cứu của Sukmarini và cộng sự 6 Do đó, về mặt tự nhiên, nem chua có thể hoạt động như một phương tiện để các gen kháng kháng sinh lây lan sang các vi khuẩn khác trong hệ thống thực phẩm và

cả trong đường tiêu hóa

1.2 Giới thiệu về thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam

Thực phẩm lên men rất phổ biến ở các nước châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng Thực phẩm lên men bắt nguồn từ quá trình tự nhiên chủ yếu liên quan đến vi khuẩn axit lactic (LAB) và nấm men có trong nguyên liệu, đặc trưng bởi sự khác biệt về vùng địa lý và quy trình chế biến Quá trình lên men không chỉ giảm thiểu độc tính của nguyên liệu thực phẩm

mà còn làm tăng chất lượng của sản phẩm Thực phẩm được lên men thường có hương vị hương vị đặc biệt, giúp kéo dài thời gian bảo quản; tăng mùi thơm và thành phần dinh dưỡng;

ức chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn; và loại bỏ các chất kháng dinh dưỡng 7 Trong quá trình lên men, việc sản xuất các axit hữu cơ khác nhau, carbon dioxide, peptit kháng khuẩn và vi khuẩn ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật hư hỏng và quá trình này hoạt động như một chất bảo quản tự nhiên

Một phần thiết yếu của các món ăn truyền thống ở Việt Nam là thức ăn lên men Ngày nay, thực phẩm lên men ngày càng trở nên hấp dẫn đối với người tiêu dùng do được chế biến không thêm hóa chất, phụ gia Tuy nhiên, khách hàng Việt Nam lo ngại về chất lượng của thực phẩm lên men vì các cộng đồng vi sinh vật trong nguyên liệu thô có thể tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức khỏe của họ 5

Nem chua

Nem chua là một trong những thực phẩm lên men truyền thống rủi ro nhất vì nó sử dụng thịt sống mà không qua xử lý nhiệt trong quá trình lên men lactic ngắn Thành phần chính của nem chua bao gồm nạc lợn xay mịn, thịt lợn luộc và thái mỏng, bột gạo rang, muối

và gia vị (tiêu và tỏi) Nem chua được chuẩn bị như sau: các nguyên liệu được trộn theo công thức và hỗn hợp này sau đó được tạo thành hình khối hoặc hình trụ nhỏ, sử dụng thêm một số loại rau có tính khử khuẩn như lá ổi hoặc lá đinh lăng và miếng tỏi hoặc ớt (tùy từng địa

Tương bần

Tương bần là một loại thực phẩm lên men truyền thống điển hình Nguyên liệu chính

để làm tương bần là đậu tương, gạo nếp, muối và nước Thông thường, gạo hấp được ủ với môi trường ban đầu chủ yếu chứa Aspergillus oryzae ở khoảng 30° C trong 4-5 ngày 8

1.3 Tình hình nghiên cứu về tính kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men

truyền thống Việt Nam

Trong những năm gần đây, kháng kháng sinh được coi là một vấn đề lớn trong sức khỏe cộng đồng, nên việc hiểu biết về sự xuất hiện và phát triển của kháng thuốc trong các môi trường không thuộc lâm sàng đã được các nhà nghiên cứu trên khắp thế giới quan tâm Bên cạnh đất và nước, thức ăn lên men và thức ăn đường phố đã trở thành nguồn cung cấp vi khuẩn kháng kháng sinh quan trọng do tầm quan trọng của chúng trong chế độ ăn uống của con người, đặc biệt là ở các nước đang phát triển 9, 10

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các kiểu hình kháng với Kanamycin, Streptomycin, Tetracylin, Erythromycin, Chloramphenicol… được phân lập trong khi ARGs chủ yếu là gen

tet và erm ở Lactobacilli và Enterococci được tìm thấy trong các sản phẩm lên men truyền

thống khác nhau như trong sản phẩm sữa, thịt lên men và rau lên men 11-14 Bên cạnh LAB,

các mầm bệnh khác liên quan đến thực phẩm lên men truyền thống như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonela sp.… Cũng được báo cáo là có khả năng kháng các loại

kháng sinh khác nhau (ví dụ: β-lactams, cephalosporin, aminoglycosides và sulfamethoxazole…) 15 Hiện nay trên thế giới các loại thực phẩm lên men truyền thống, chủ yếu là sản phẩm từ sữa, thịt và rau lên men chứa LAB và các nguồn bệnh từ thực phẩm khác

trimethoprim-đã được báo cáo là có bản chất kháng nhiều loại kháng sinh và cũng có khả năng kháng thuốc

bổ sung Từ góc độ an toàn thực phẩm, một số báo cáo đã được Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu công bố trong những năm gần đây (liên quan đến việc thực phẩm có nguồn gốc động vật là nguồn gây ra kháng kháng sinh quan trọng do một số nguyên nhân, chẳng hạn như việc

Đã có một vài các nghiên cứu về kháng kháng sinh trong các quán ăn lề đường được nhóm nghiên cứu Malaysia công bố 17 Tuy nhiên ở Việt Nam, đây vẫn là một lĩnh vực chưa được

đề cập nhiều Đây là một hướng nghiên cứu liên quan tới sự liên hệ giữa sản phẩm nông nghiệp và y tế, là một chủ đề chưa được quan tâm đúng mức, cần được tiếp tục nghiên cứu đào sâu để đưa ra những giải pháp đồng bộ và hiệu quả Thực phẩm là một trong những nguồn chính cung cấp vi sinh vật cho cơ thể nên vệ sinh an toàn thực phẩm liên quan mật thiết với các yếu tố vi sinh ảnh hưởng tới sức khỏe con người

6

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Các thực phẩm lên men được mua từ các chợ ở địa phương ở Hà Nội Mỗi loại được chọn ngẫu nhiên từ những gian hang bán lẻ Các sản phẩm được làm thủ công qua quá trình lên men tự nhiên, mỗi mẫu lấy 3 sản phẩm bất kì Các mẫu được giữ ở 4-10 °C và không quá

24 giờ trước khi phân tích Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi sinh vật kháng thuốc

Các chủng vi sinh vật sẽ được phân lập từ các thực phẩm lên men truyền thống được thu thập ngẫu nhiên từ các chợ địa phương Vi khuẩn được lấy ra từ các sản phẩm lên men bằng cách nghiền 1 g mẫu trong 9 ml dung dịch (0,8% NaCl) và lắc trong 1 phút Hỗn hợp nem chua đã đồng nhất được pha loãng trong lần lượt trong 0,8% NaCl Tổng số vi sinh dị dưỡng được đếm trên môi trường TSA 1/10 (Tryptic Soil Agar pha loãng mười lần) có bổ sung chất chống nấm nystatin 200 mg/L) Các vi khuẩn kháng sinh dị dưỡng được thống kê trên cùng môi trường có bổ sung kháng sinh (sulfamethoxazole ở nồng độ 60 mg/L) Lấy 100

μl trong số dung dịch pha loãng 10-2 được trải trên các đĩa chứa kháng sinh SXM 60 mg/L thích hợp cho hệ vi sinh dị dưỡng kháng thuốc và 10-4 được trải cho toàn bộ hệ vi sinh dị dưỡng

2.2.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

Các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh được phân lập từ mẫu thực phẩm lên men tiếp theo được định danh bằng phương pháp giải trình tự (phương pháp Sanger) dựa trên gene 16S rRNA

a Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn mục tiêu

• Ly trích DNA của các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh đã phân lập sử dụng kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất TopPURE® genomic DNA extraction kit (ABT Việt Nam)

• Lượng DNA được xác định bằng phương pháp quang phổ A260/280nm

• Nồng độ DNA có trong mẫu được tính theo công thức:

A (ng/µl) = 50 × OD 260nm x n

Trong đó:

7

OD 260nm : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm 50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi n: hệ số pha loãng

b Thu nhận gene 16S

• Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi 27F/1492R18

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ với tổng thể tích là 20 µl, trong đó chứa các thành phần và nồng độ của các chất tham gia phản ứng như sau:

• Điện di trên gel agarose

Sản phẩm PCR được nhận biết thông qua kích thước phân tử của chúng qua quá trình

điện di nhờ vị trí của các vạch DNA trên gel agarose 1% Quá trình điện di được thực hiện

trên bộ điện di Bio-Rad (Richmond, CA, Hoa Kỳ) với dòng điện 100 mA và 135 V trong 25

phút

• Kiểm tra kết quả

Kết thúc quá trình điện di, kết quả điện di được kiểm tra dưới ánh sáng xanh của bàn soi gel (UltraSlim LED illuminator) và ghi nhận hình ảnh bằng máy chụp hình Canon Gene mục tiêu sau khi được xác nhận bằng phương pháp điện di, được gửi giải trình tự tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc)

c Định danh vi khuẩn

8

Các trình tự gene nhận được sau giải trình tự được so sánh trên ngân hàng dữ liệu NCBI

sử dụng công cụ BLAST Các loài vi khuẩn được định danh dựa trên điểm cao nhất đối với các thông số độ tương đồng (identity), độ bao phủ dữ liệu (query cover), giá trị mong đợi (E-value)

2.2.3 Thử nghiệm sinh hóa

a Nhuộm Gram

Nhuộm gram là kỹ thuật để phân biệt 2 nhóm vi khuẩn là Gram dương (+) và Gram âm (-) dựa trên cấu tạo vách tế bào của vi khuẩn

Quy trình nhuộm gram:

• Dàn đều bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên lam kính sạch;

• Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;

3 Tẩy màu bằng cồn 950 để khoảng 30 giây và rửa nước

4 Cuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 của Gram để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước

9

Methyl red nhằm kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ quá trình lên men glucose của vi sinh vật Voges – Proskauer nhằm xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật

• Môi trường: Sử dụng môi trường MR – VP Broth

1 Alpha-naphthol, chất tạo màu 5%

2 Kali Hydrooxide, 40%, chất oxy hóa

• Các kiểm soát dương tính và âm tính nên được thực hiện sau khi chuẩn bị từng

lô môi trường và từng lô thuốc thử Các kiểm soát được đề xuất bao gồm: Kiểm soát dương

tính: S.aureus Kiểm soát âm tính: Escherichia coli

d Thử nghiệm Calatase

Thử nghiệm Catalase được dùng để thử nghiệm khả năng thủy phân H2O2 thành H2O

và O2, tạo ra bọt khí dựa vào cơ chế vi khuẩn sinh enzym catalase để thủy phân

Thử nghiệm nhằm xác định khả năng di động của vi sinh vật

Nuôi khuẩn trong môi trường thạch mềm (Semi-Nutrient Agar) 0.5% thạch trong ống nghiệm Ủ trong 24 giờ ở 35°C, nếu thấy đường cấy không bị xê dịch là âm tính, đường cấy mọc lan ra môi trường là dương tính

2.2.4 Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được

Tiến hành sàng lọc và chọn các chủng đa kháng thuốc sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa thạch dựa theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm Lâm sàng (CLSI, 2015) 19 Các xét nghiệm sẽ được thực hiện trên thạch Mueller Hinton, đối với các loại thuốc

kháng sinh thường được sử dụng Hoạt tính kháng khuẩn của mỗi loại kháng sinh sẽ được kiểm tra cho tất cả các chủng phân lập và kết quả sẽ được giải thích theo hướng dẫn về xét nghiệm độ nhạy của đĩa kháng sinh do Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng cung cấp và kết quả sẽ được ghi là nhạy, kháng trung gian và kháng Các chủng kháng ít nhất 2 loại kháng sinh khác nhau sẽ được coi là chủng đa kháng thuốc (MDR) và sẽ định danh Số lượng các chủng MDR phân lập từ mỗi mẫu sẽ được ghi lại

Các kháng sinh sau đây đã được thử nghiệm vì chúng thuộc các họ riêng biệt: gentamicin (GE) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 µg; methicillin (Met) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 5 µg; kanamycin (Km) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 µg; tetracyclin (TE) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 µg; imipenem (IPM) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 µg; streptomycin (Sm) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 µg; ampicillin (Am) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 10 µg; Rifampicin (Rf) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 µg; trimethoprim (TMP) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 1,25 µg và chloramphenicol (Cm) ở nồng độ đĩa kháng sinh là 30 µg Nồng độ kháng

12

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sự phổ biến của các kiểu hình kháng thuốc

Sau khi ủ trong thạch TSA khoảng 24 giờ ở 37°C, sử dụng phương pháp quan sát và đếm khuẩn lạc cho thấy: nhìn chung, các hình thái chính của toàn bộ chủng là hình tròn, lồi, nhẵn và không trong suốt Hầu hết tất cả các khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng và một số trong

số chúng có màu vàng Đánh giá sự phong phú của vi khuẩn dị dưỡng kháng sulfomethoxazole (SMX) từ nem chua, dưa chua và tương bần tại Hà Nội (Bảng 1) Trong nem chua, số lượng

vi khuẩn kháng SMX là 0.35×104 (CFU/g) và tổng số lượng vi sinh dị dưỡng là 1.37×106(CFU/g) Ở dưa chua, số lượng vi khuẩn kháng SMX là 0.76×104 (CFU/g) và tổng số lượng

vi sinh dị dưỡng là 1.89×106 (CFU/g) Trong tương bần, số lượng vi khuẩn kháng SMX là 0.53×104 (CFU/g) và tổng số lượng vi sinh dị dưỡng 3.19×106 (CFU/g)

Bảng 1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trong các thực phẩm lên men khác nhau

Sản phẩm Vi khuẩn kháng

SMX (CFU/g)

Tổng số vi sinh vật dị dưỡng (CFU/g) Tỉ lệ

Nem chua (0.35 ± 0.2) x 104 (1.54 ± 0.28) x 106 0.24% ± 0.18

Dưa chua (0.76 ± 0.23) x 104 (1.89 ± 0.72) x 106 0.45% ± 0.27

Tương bần (0.53 ± 0.36) x104 (3.19 ± 0.8) x 106 0.17% ± 0.11

vi khuẩn với kiểu hình kháng kháng sinh cao nhất trong số ba loại thực phẩm lên men được kiểm tra Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh cao được tìm thấy ở đây có thể là do vệ sinh

cá nhân kém, tồn dư kháng sinh trong nguyên liệu thô, sử dụng nước bị ô nhiễm và vệ sinh thiết bị và bề mặt như dao, đĩa hoặc hộp đựng không đạt tiêu chuẩn Kết quả của chúng tôi đã cho thấy thực trạng cảnh báo tình trạng kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men tại Hà Nội

có nguy cơ tiềm ẩn gây nên các bệnh lý nghiêm trọng gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng Cần đánh giá tỷ lệ vi khuẩn kháng các loại kháng sinh khác thường dùng trong chăn nuôi như gentamycin, tetracyclin, ampicillin để hoàn thiện hình ảnh kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men của Việt Nam

Hình 1 Tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc trong ba loại thực phẩm Các giá trị trung bình của chín

lần lặp lại được sử dụng để đại diện cho sự phân bố trong mỗi loại thực phẩm Các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt đáng kể (Tukey’s HSD test, p <0,05)

14

3.2 Đánh giá tính kháng kháng sinh của vi sinh vật phân lập được

Từ mỗi mẫu, các kiểu hình kháng thuốc đại diện cho các hình thái khác nhau được phân lập và đặc biệt, 3 chủng AR ở nem chua, 3 chủng AR ở dưa chua và 3 chủng AR ở tương bần được chọn để thử nghiệm tính đa kháng thuốc Chín chủng phân lập kháng thuốc đại diện cho các kiểu hình thái khác nhau đã được chọn từ ba loại mẫu Tính nhạy với kháng sinh đồ được thử nghiệm đối với tất cả các chủng phân lập bằng cách sử dụng 10 loại kháng sinh và kết quả được giải thích theo hướng dẫn được cung cấp bởi CLSI 20

Bảng 2 Kết quả của các thử nghiệm khuếch tán đĩa kháng sinh đối với các chủng kháng thuốc

được chọn từ các mẫu thực phẩm lên men khác nhau Trong đó:

Km: kanamycin (30 µg) GE: gentamicin (10 µg)

TMP: trimethoprim (1.25 µg) Met: methicillin (5 µg)

Sm: streptomycin (10 µg) Am: ampicillin (10 µg)

Cm: chloramphenicol (30 µg) R: resistant (kháng)

TE: tetracyclin (30 µg) S: susceptible (không kháng)

IMP: imipenem (10 µg) I: intermediate (trung gian)

Có tổng cộng 6 chủng kháng từ 2 loại kháng sinh trở lên trên tổng số 9 chủng thu được

từ ba loại thực phẩm lên men truyền thống (do các chủng đã được phân lập từ môi trường có chứa SMX), chiếm xấp xỉ 66.67% So với các nghiên cứu trước đây được công bố ở Malaysia

về khả năng kháng thuốc do vi khuẩn Salmonella từ thịt tươi bán lẻ (khoảng 80% (70/88)

chủng thu được cho thấy khả năng kháng ít nhất hai loại kháng sinh đa kháng) 17, do đó 66.67% chủng khuẩn kháng đa thuốc được tìm thấy trong thực phẩm lên men thấp hơn đáng kể Tuy nhiên, những nguy cơ tiềm ẩn của những chủng kháng kháng sinh có trong thực phẩm lên men truyền thống vẫn là một mối lo ngại đối với vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm

Chủng tiềm năng đồng thời được định danh bằng phương pháp giải trình tự (phương pháp Sanger) dựa trên gene 16S Sau khi giải trình tự gen các chủng đa kháng kháng sinh, thu được kết quả như bảng 4

Bảng 3 Bảng kết quả định danh các chủng kháng kháng sinh theo phương pháp Sanger dựa

trên gene 16S

STT Kí hiệu

mẫu

Nguồn thực phẩm

Klebsiella pneumoniae

3 V8 Tương bần 2 loại (CmR, MetR) Enterobacter

ludwigii

Bảng 4 Bảng đặc tính của các chủng thu được từ thực phẩm lên men truyền thống Việt Nam

21

Đất, niêm mạc động vật, thực vật, nước 22

ăn những thực phẩm này Vi khuẩn gây bệnh từ sản phẩm có thể xuất hiện từ các yếu tố nội sinh (động vật, thực vật) và ngoại sinh (nhân sự, nước hoặc môi trường) Việc xuất hiện

K.aerogenes trong nguồn thức ăn và hậu quả nghiêm trọng do chúng gây ra K.aerogenes có

thể xâm nhập vào ruột của con người bất kể tình trạng miễn dịch của họ, gây ra tình trạng lây nhiễm chéo giữa người với người gây ra bệnh nghiêm trọng cho những người khác 26, 27 Trong các nghiên cứu gần đây, Atarashi và cộng sự 28 cùng với Cao và cộng sự 29 đã có báo cáo rằng

sự xâm nhập đường ruột của K pneumoniae từ khoang miệng đã gây ra tế bào T helper 1 và

gây ra tình trạng viêm ruột nghiêm trọng Các tác giả đã cho rằng khoang miệng có thể đóng vai trò như một nguồn chứa các mầm bệnh đường ruột tiềm ẩn Thêm vào đó, báo cáo của Tominaga và cộng sự 30 đã cho thấy rằng bánh ngọt và các loại thịt có thể là ổ chứa trước cho bệnh viêm đường ruột Do đó, chúng ta phải giám sát các loại thực phẩm như vậy để ngăn

17

chặn sự xâm nhập của K pneumoniae trong khoang miệng và sự tiêu hóa của các vi khuẩn có

hại khác có thể gây ngộ độc thực phẩm khi ăn qua bánh ngọt và các loại thịt, chẳng hạn như

S aureus, Salmonella spp và Clostridium perfringens 31 Sự nhiễm khuẩn E ludwigii qua

đường miệng cũng đã được nhắc đến trong nghiên cứu của Priyadarsini và cộng sự về việc gây ảnh hưởng xấu đến bệnh nhân tiểu đường 32 Nghiêm trọng hơn, việc ăn phải E ludwigii

có thể dẫn đến hậu quả thay đổi quá trình sản xuất histamnine – một bioamine quan trọng đóng vai trò nền tảng, tham gia vào nhiều hoạt động sống của cơ thể liên quan mật thiết đến

hệ miễn dịch cục bộ cũng như việc duy trì chức năng sinh lý của ruột 33 Có thể thấy rằng, tiềm ẩn phơi nhiễm với các chủng vi sinh kháng kháng sinh là rất lớn và hậu quả khi phơi nhiễm cũng rất nghiêm trọng, ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe của con người

Hiện nay chưa xuất hiện nhiều các báo cáo về vi khuẩn kháng kháng sinh trên thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên thế giới cũng đã có các báo cáo liên quan đến nguồn vi sinh vật kháng kháng sinh xuất hiện ở thực phẩm như báo cáo của Van và cộng sự 34 về sự

xuất hiện của Salmonella spp kháng kháng sinh trên các quầy bán lẻ thịt và trong các món ăn

đường phố ở Thành phố Hồ Chí Minh Haryani và cộng sự 35 đã khảo sát các loại thức ăn

đường phố ở các địa điểm khác nhau trên Malaysia và đã phát hiện được Enterobacter cloacae

kháng 6 loại kháng sinh Một nghiên cứu khác về hệ vi sinh vật kháng thuốc của Ashang và cộng sự 36 cho thấy nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm ăn liền bán ở Calabar Metropolis, Nigeria Ngoài ra, nguồn vi khuẩn kháng kháng sinh cũng được phát hiện trên nhiều các loại nguyên liệu thực phẩm tươi như rau củ, thịt, cá 24-26 Cũng như các loại thực phẩm khác, các món ăn lên men truyền thống cũng là một nguồn tiềm ẩn các vi sinh vật kháng kháng sinh và đồng thời cũng là nguồn quan trọng để chuyển gen sang các vi khuẩn gây bệnh khác cũng như trở thành tác nhân gây nên nên sự chuyển gen ở các vi khuẩn không gây bệnh nhưng mang gen kháng kháng sinh

Hiện nay chúng ta vẫn chưa có giải pháp ngăn chặn tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh một cách triệt để do đó những kết quả của đề tài này có thể góp phần kiểm soát nguồn vi khuẩn kháng kháng sinh và giảm khả năng lan rộng trong cộng đồng

18

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Thực phẩm là một trong những nguồn chính cung cấp vi sinh vật cho cơ thể nên vệ sinh an toàn thực phẩm liên quan mật thiết với các yếu tố vi sinh ảnh hưởng tới sức khỏe con người Nghiên cứu này cho thấy sự phổ biến đáng kể của vi khuẩn kháng thuốc trong ba loại thực phẩm lên men truyền thống ở Việt Nam nói chung và Hà Nội nói riêng Thử nghiệm tính nhạy cảm với kháng sinh cho thấy 33.3% số phân lập đề kháng với ít nhất ba loại kháng sinh Các chủng MDR này được cho là mầm bệnh từ nguồn nguyên liệu thô, là kết quả của quá trình sử dụng kháng sinh trong việc chăn nuôi hoặc vệ sinh chưa đạt tiêu chuẩn khiến thực phẩm vẫn còn tồn tại từ môi trường Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh đã phát triển trên thế giới trong nhiều thập kỷ qua và đã có những kết quả nghiên cứu nhất định, tuy nhiên những nghiên cứu về vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm ở Việt Nam còn rất hạn chế Đây là một hướng nghiên cứu liên quan tới sự liên hệ giữa sản phẩm nông nghiệp

và y tế, là một chủ đề chưa được quan tâm đúng mức, cần được tiếp tục nghiên cứu đào sâu

để đưa ra những giải pháp đồng bộ và hiệu quả Kết quả của đề tài sẽ cung cấp các thông tin hữu ích cho việc nhận thức về sự phổ biến của vi sinh vật kháng kháng sinh từ đó nâng cao ý thức vệ sinh an toàn thực phẩm trong thực tế và có những biện pháp nhằm hạn chế những sự lây nhiễm nguồn vi khuẩn kháng kháng sinh từ đồ ăn sang cơ thể người Ngoài ra, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cần được điều chỉnh mạnh mẽ để giảm thiểu cơ hội cho các sinh vật phát triển sức đề kháng Chúng tôi đề xuất thêm những nghiên cứu chi tiết hơn về sinh học phân tử để xác định và đặc tính di truyền của các chủng kháng thuốc, cũng như để hiểu rõ hơn và kiểm soát tình hình kháng kháng sinh trong thực phẩm lên men truyền thống của Việt Nam

Chủ nhiệm đề tài

Vũ Thị Nam Anh

19

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bush, K.; Courvalin, P.; Dantas, G.; Davies, J.; Eisenstein, B.; Huovinen, P.; Jacoby,

G A.; Kishony, R.; Kreiswirth, B N.; Kutter, E.; Lerner, S A.; Levy, S.; Lewis, K.; Lomovskaya, O.; Miller, J H.; Mobashery, S.; Piddock, L J.; Projan, S.; Thomas, C M.; Tomasz, A.; Tulkens, P M.; Walsh, T R.; Watson, J D.; Witkowski, J.; Witte, W.; Wright, G.; Yeh, P.; Zgurskaya, H I., Tackling antibiotic resistance Nat Rev Microbiol

4 Abriouel, H.; Knapp, C.; Gálvez, A.; Benomar, N., Antibiotic resistance profile of microbes from traditional fermented foods In Fermented foods in health and disease prevention, Elsevier: 2017; pp 675-704

5 Anal, A K.; Perpetuini, G.; Petchkongkaew, A.; Tan, R.; Avallone, S.; Tofalo, R.; Nguyen, H V.; Chu-Ky, S.; Ho, P H.; Phan, T T.; Waché, Y., Food safety risks in

traditional fermented food from South-East Asia Food Control 2020, 109

6 Sukmarini, L.; Mustopa, A Z.; Normawati, M.; Muzdalifah, I., Identification of Antibiotic-Resistance Genes from Lactic Acid Bacteria in Indonesian Fermented Foods

HAYATI Journal of Biosciences 2014, 21 (3), 144-150

7 Xiang, H.; Sun-Waterhouse, D.; Waterhouse, G I.; Cui, C.; Ruan, Z J F S.;

Wellness, H., Fermentation-enabled wellness foods: A fresh perspective 2019, 8 (3),

203-243

8 La Anh, N., Health-promoting microbes in traditional Vietnamese fermented foods: A

review Food Science and Human Wellness 2015, 4 (4), 147-161

9 Forslund, K.; Sunagawa, S.; Kultima, J R.; Mende, D R.; Arumugam, M.; Typas, A.; Bork, P., Country-specific antibiotic use practices impact the human gut resistome

Genome Res 2013, 23 (7), 1163-9

20

10 Gong, A n.; Shi, A.-m.; Liu, H.-z.; Yu, H.-w.; Liu, L.; Lin, W.-j.; Wang, Q., Relationship of chemical properties of different peanut varieties to peanut butter storage

stability Journal of Integrative Agriculture 2018, 17 (5), 1003-1010

11 Tran D., L H., Ngo P, Antibiotic resistance of lactobacillus spp Isolated from fermented foods and supplement food supervision at Hochiminh City Ho Chi Minh City

Journal of Medicine 2019, 23, 483–489

12 Nawaz, M.; Wang, J.; Zhou, A.; Ma, C.; Wu, X.; Moore, J E.; Millar, B C.; Xu, J., Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from

fermented food products Curr Microbiol 2011, 62 (3), 1081-9

13 Federici, S.; Ciarrocchi, F.; Campana, R.; Ciandrini, E.; Blasi, G.; Baffone, W., Identification and functional traits of lactic acid bacteria isolated from Ciauscolo salami

produced in Central Italy Meat Sci 2014, 98 (4), 575-84

14 Ammor, M S.; Mayo, B., Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as

functional starter cultures in dry sausage production: An update Meat Sci 2007, 76 (1),

138-46

15 Zdolec, N.; Filipović, I.; Fleck, Ž C.; Marić, A.; Jankuloski, D.; Kozačinski, L.; Njari, B., Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated from fermented

sausages and raw cheese veterinarski arhiv 2011, 81 (1), 133-141

16 The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed

- Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards EFSA Journal 2008, 6 (12)

17 Thong, K L.; Modarressi, S J F R I., Antimicrobial resistant genes associated with

Salmonella from retail meats and street foods 2011, 44 (9), 2641-2646

18 Frank, J A.; Reich, C I.; Sharma, S.; Weisbaum, J S.; Wilson, B A.; Olsen, G J., Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA

genes Appl Environ Microbiol 2008, 74 (8), 2461-70

19 Jean B Patel, P., D(ABMM); Melvin P Weinstein, M.; George M Eliopoulos, M.; Stephen G Jenkins, P., D(ABMM), F(AAM); James S Lewis II, P.; Brandi Limbago, P.; Amy J Mathers, M.; Tony Mazzulli, M., FRCP (C), FACP; Robin Patel, M.; Sandra S Richter, M., D(ABMM); Michael Satlin, M., MS; Jana M Swenson, M.; Maria M Traczewski, B., MT(ASCP); John D Turnidge, M.; Barbara L Zimmer, P., Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 2017

20 M100: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing

isolated from industrial contaminated soil Environ Pollut 2020, 264, 114637

24 Yousaf, S.; Afzal, M.; Reichenauer, T G.; Brady, C L.; Sessitsch, A., Hydrocarbon degradation, plant colonization and gene expression of alkane degradation genes by

endophytic Enterobacter ludwigii strains Environ Pollut 2011, 159 (10), 2675-83

25 Al-Kharousi, Z S.; Guizani, N.; Al-Sadi, A M.; Al-Bulushi, I M., Antibiotic Resistance of Enterobacteriaceae Isolated from Fresh Fruits and Vegetables and

Characterization of their AmpC beta-Lactamases J Food Prot 2019, 82 (11), 1857-1863

26 Casewell, M.; Phillips, I., Hands as route of transmission for Klebsiella species Br

Med J 1977, 2 (6098), 1315-7

27 Kiddy, K.; Josse, E.; Griffin, N J J o H I., An outbreak of serious Klebsiella

infections related to food blenders 1987, 9 (2), 191-193

28 Atarashi, K.; Suda, W.; Luo, C.; Kawaguchi, T.; Motoo, I.; Narushima, S.; Kiguchi, Y.; Yasuma, K.; Watanabe, E.; Tanoue, T J S., Ectopic colonization of oral bacteria in

the intestine drives TH1 cell induction and inflammation 2017, 358 (6361), 359-365

29 Cao, X., Intestinal inflammation induced by oral bacteria Science 2017, 358 (6361),

308-309

30 Tominaga, T., Rapid detection of Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Raoultella ornithinolytica and other related bacteria in food by lateral-flow test strip

immunoassays J Microbiol Methods 2018, 147, 43-49

31 Food Poisoning Statistics, 2009; Ministry of Health Labour and Welfare

32 Priyadarsini, S.; Mukherjee, S.; Samikshya, S N.; Bhanja, A.; Paikra, S K.; Nayak, N.; Mishra, M., Dietary infection of Enterobacter ludwigii causes fat accumulation and

resulted in the diabetes-like condition in Drosophila melanogaster Microb Pathog 2020,

149, 104276

22

33 Priyadarsini, S.; Sahoo, M.; Sahu, S.; Jayabalan, R.; Mishra, M J I N., An infection

of Enterobacter ludwigii affects development and causes age-dependent neurodegeneration

in Drosophila melanogaster 2019, 19 (4), 1-15

34 Van, T T H.; Moutafis, G.; Istivan, T.; Tran, L T.; Coloe, P J J A.; microbiology, e., Detection of Salmonella spp in retail raw food samples from Vietnam and

characterization of their antibiotic resistance 2007, 73 (21), 6885-6890

35 Haryani, Y.; Tunung, R.; Chai, L.; Lee, H.; Tang, S.; Son, R J I F R J.,

Characterization of Enterobacter cloacae isolated from street foods 2008, 15 (1)

36 Ashang, U.; Antai, S.; Tiku, D J W J o P.; Research, M., Distribution of antibiotic

resistant bacteria flora in ready to-eat food samples sold in Calabar Metropolis 2017, 3

(11), 198-125

23

PHỤ LỤC 3: MINH CHỨNG ĐI KÈM

1 SẢN PHẨM DẠNG 3: (toàn văn bài báo, sách chuyên khảo….)